2 Material und Methoden

saure Invertase) bzw. pH 7,0 (alkalische Invertase) inkubiert.
Zusammensetzung des Bestimmungspuffers:
• 50mM Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O pH 4,5 bzw.7,0
• 50mM Zitronensäure
• 100mM Saccharose
Inkubationsansätze:
• Saure zellwandgebundene Invertase
10mg Zellwandpellet + 140µl Extraktionslösung + 150µl Bestimmungspuffer (pH 4,5)
• Saure lösliche Invertase
150µl Überstand + 150µl Bestimmungspuffer (pH 4,5)
• Neutrale lösliche Invertase
150µl Überstand + 150µl Bestimmungspuffer (pH 7,0)
Inkubation: 20 Minuten unter Schütteln bei 30°C.
Abstoppen: 10 Minuten Erhitzen auf 95°C im Wasserbad.
Die Kontrolle wurden sofort bei 95°C für 15 Minuten inkubiert. Nach dem Abkühlen wurden
die Proben für 10 Minuten bei 10.000 UPM zentrifugiert. Der Überstand wurde für die
Glucosebestimmung mit dem Bestimmungskit 716251 von Boehringer-Mannheim
eingesetzt.
Die Enzymaktivität wurde für die zellwandgebundene Invertase in µmol Glucose /mg
ZW*min, für die löslichen Invertasen mit µmol Glucose /mg FM*min angegeben.
2.8.2 Saccharosesynthase (Susy)
Die Bestimmung der Saccharosesynthase-Aktivität erfolgte in Richtung Saccharosespaltung
nach WEBER et al. (1996 a). Definierte Abschnitte des Wirt-Parasit-Systems wurden nach
Bestimmung der Frischmasse im dreifachen Volumen Extraktionspuffer gemörsert (100mM
MOPS/KOH (pH 7,5); 10mM MgCl 2 x 6 H 2 O; 1mM EDTA; 1mM EGTA; 2mM DTT). Nach
gründlichem Mischen auf dem Vortex wurden die Proben für 10 Minuten bei 4ºC und 10.000
UPM zentrifugiert.
Zur Aktivitätsbestimmung des Enzyms wurden 30µl des Überstandes mit 150µl
Bestimmungspuffer I vermischt und für 10 Minuten bei 25ºC unter Schütteln inkubiert.
Zusammensetzung des Bestimmungspuffers I:
• 75mM HEPES/KOH (pH 7,5)
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