Biologie I/B: Klassische und molekulare Genetik, molekulare ...

Biologie I/B: Klassische und molekulare Genetik, molekulare Grundlagen der Entwicklung
Theoretische Übungen SS 2013, Termin 7
D) Sequenzieren
Ihre Aufgabe ist es, ein doppelsträngiges DNA-Fragment zu sequenzieren. Zu diesem Zweck
haben Sie das Fragment in einen geeigneten Vektor kloniert und das rekombinante Plasmid
gereinigt.
Sie wählen die Sanger-Methode, um Ihr Fragment zu sequenzieren. In der folgenden
Abbildung ist ein Ausschnitt des Plasmids gezeichnet. Fett und groß gedruckt ist die
Sequenz Ihres Fragments, dünn und etwas kleiner die (bekannte) Sequenz des Vektors
1. Geben Sie die Sequenz eines 8 Basen langen Primers an, der als Start für die
Sequenzreaktion geeignet ist und Ihnen erlaubt, möglichst viele Basen vom Beginn des
Fragmentes zu lesen. Beschriften Sie das 5’- und 3’-Ende des Primers
3’ ......GGCTAACGTATAGATCCTAGGTACAAACCTGA...... 5’
2. Nach der Anheftung des Primers teilen Sie den Reaktionsansatz in 4 Portionen und geben
diese in 4 Reaktionsgefäße, in denen sich, jeweils spezifisch für die 4 Basen, ein Gemisch
verschiedener Nukleotide und DNA-Polymerase befinden. Kreuzen Sie in der folgenden
Tabelle an, welche Nukleotide sich in den jeweiligen Reaktionsgefäßen befinden:
32 P-dATP
dCTP
dGTP
dTTP
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddTTP
„A“ „C“ „G“ „T“
3. Nach erfolgter Inkubationszeit tragen Sie die Reaktionsgemische auf ein Polyacrylamidgel
auf, trennen sie elektrophoretisch auf und machen die DNA-Banden autoradiographisch
sichtbar. In der folgenden Abbildung sehen Sie das Ergebnis der Autoradiographie.
Lesen Sie die Sequenz ab,
a) schreiben Sie sie in das unten vorgegebene Feld und
b) markieren Sie in 1), welchen Bereich ihres Fragmentes Sie lesen
können.
Denken Sie an die Beschriftung der 3’- und 5’-Enden!
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