2 - World Health Organization

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Kapitel 3 • Fakultative Untersuchungen
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terer Un Referenzbereich
Der un tere Ref erenzbereich f ür F ruktose b eträgt
13 µmol im Gesamt-Ejakulat (Cooper et al. 1991 und
unpublizierte Daten von TG Cooper).
Kommentar
Ein niedriger Fruktosegehalt ist charakteristisch für
Obstruktionen im Duc tus ejaculatorius, der bilat e-
ralen kongenitalen Aplasie des Vas deferens (de la
Taille et al. 1998; Daudin et al. 2000; von Eckardstein
et al. 2000), partielle retrograde Ejakulation und Androgenmangel.
3.4.3Bestimmung der neutralen
α-Glukosidase im
Seminalplasma
Hin tergrund
Im Seminalplasma befindet sic h s owohl ein neutrales
α-Glukosidase Isoenzym, welches aus dem
Nebenhoden st ammt, als a uch das s aure I soenzym,
das in der P rostata gebildet wird. D as s aure
α-Glukosidase Isoenzym kann durch SDS (Sodium
Dodecyl S ulfate) inhib iert w erden (P aquin et al .
1984), damit das neutrale Isoenzym gemessen werden
k ann. D iese n eutrale α- Glukosidase s piegelt
die F unktionsfähigkeit des N ebenhodens wider .
Um die S ensitivität der Messmethode zu st eigern,
werden C astanospermine als I nhibitoren ein gesetzt
und dabei helfen, die unspezifischen Reaktionen
der Probe erkennen, damit sie rechnerisch von
dem Messergebnis abgezogen werden können. Die
beschriebene Methode ist f ür Spektralphotometer
konzipiert w orden, die 96-w ell-Mikrotiterplatten
lesen und eine S ensitivität von 1,9 mU/ml aufweisen
(Cooper et al. 1990b). Trotzdem kann nach wie
vor ein Photometer verwendet werden, das Küvetten
mit einer Kapazität von 1 ml oder 3 ml liest. In
diesem Fall müssen die Volumina des Seminalplasmas
und der Re agenzien p roportional a ngepasst
werden u nd e ntsprechend muss d ie Umrechnung
erfolgen.
rinzip P
Glukosidase wandelt das syn thetische Glukopyranosid-Substrat
zu p-N itrophenol um, w elches b ei
Zugabe v on N atriumcarbonat eine G elbfärbung
annimmt.
−−−−−−−−→ p-Ni-
p-ni trophenol-α-glucopyranoside α-Glucosidayse
trophenol Na2CO3 −−−→ Komplex, der Licht der Wellenlänge
405 nm absorbiert
Reagenzien
Für die B estimmung der ep ididymalen neu tralen
Alpha-Glukosidase im Seminalplasma sind Kits im
Handel erhäl tlich. Es s ollten jedo ch n ur die K its
verwendet werden, die SDS und Castanospermine
enthalten. Al ternativ k önnen die Re agenzien jedoch
auch selbst hergestellt werden.
1. Puffer 1 (0,2 mol/l Phosphat, pH 6,8): 4,56 g
K 2
HPO
4 × 3 H 2
O in 100 ml Aqua dest lösen.
Dann 2,72 g KH 2
PO 4
separat in 100 ml Aqua
dest lösen. Beide Lösungen so miteinander
vermischen, bis ein pH-Wert von 6,8 erreicht
ist.
2. Puffer 2: 1 g SDS in 100 ml von Puffer1 geben.
Das SDS fällt bei kühleren Temperaturen aus,
die Präzipitation löst sich jedoch bei Wärmezufuhr.
3. arbreagenz F 1 (für das Stoppen der Reaktion,
0,1 mol/l Natrium Carbonat): 6,20 g Na 2
CO 3
×
H 2
O in 500 ml Aqua dest lösen.
4. arbreagenz F 2: 0,1 g SDS in 100 ml der Farbreagenz
1 lösen.
5. p-N itrophenol Glukopyranosid-Substrat
(PNPG) (5 mg/ml): 0,1 g des PNGP in 20 ml
Puffer 2 geben und die Lösung auf eine Wärmeplatte
mit Magnetrührer bei ca. 50 °C für
rund 10 Minuten stellen. Es stellt kein Problem
dar, wenn sich wenige verbleibende Kristalle
nicht auflösen. Für die gesamte Dauer des Assays
wird diese Lösung bis zum Gebrauch bei
37 °C aufbewahrt und kann für spätere Assays
nicht mehr verwendet werden.
. 6 ucosidase Gl Inhibitor für die Leerwertbestimmung
der Seminalplasmen (Castanospermine,
10 mmol/l): 18,9 mg Castanospermine in 10 ml
Aqua dest lösen. Zur Herstellung der Arbeitslösung
wird eine 10fache Verdünnung hergestellt,
sodass 1mmol/l entsteht. Diese sollten in
1,0 ml Aliquots bei –20 °C gelagert werden.
7. PNP -Standard (5mmol/l): 69,5 mg PNP werden
in 100 ml Aqua dest gelöst, wobei zu