Aus der Klinik für Urologie - Universität zu Lübeck

Das Gesamtvolumen pro well betrug dabei 5 ml. Die Zellen, die später als unstimulierte
Kontrolle eingesetzt wurden, wurden nur in Medium ohne weitere Zusätze parallel
kultiviert. Wurden Bakterien als Stimulus verwendet, wurde dem Medium kein
Antibiotikum zugesetzt.
1x10 6 MNZ + 3,75x10 4 cfu BCG
1x10 6 MNZ + 800 U/ml IL-2
1x10 6 MNZ
⇒ 7 Tage ⇒ BAK-Zellen
⇒ 7 Tage ⇒ LAK-Zellen
⇒ 7 Tage ⇒ unstimulierte Kontrolle (UK)
Nach 7 Tagen wurden die teilweise adhärenten Zellen mit einem Gummischaber gelöst,
abpipettiert, gewaschen und anschließend mit Trypanblau auf ihre Vitalität untersucht.
Gleichzeitig wurden die Zellen gezählt (Neubauer-Zählkammer (BRAND,
Ludwigshafen)). Anschließend wurde eine Konzentration von 2x10 6 Zellen/ml eingestellt.
2.4.3. Präparation der Zielzellen für den Zytotoxizitäts-Assay
Die zuvor kultivierten Zellen der oben angeführten Blasentumorzellinien wurden mit
Trypsin aus den Kulturflaschen enzymatisch gelöst und anschließend das Trypsin mit FKS
inhibiert. Nach der Zentrifugation (s.o.) wurden die Zellen zweimal mit Methionin-freiem
Medium gewaschen. Die Zellen wurden darauf in 1 ml RPMI 1640 ohne L-Methionin
(10% FKS, 1% Antibiotikalösung) aufgenommen und, wie oben ebenfalls beschrieben,
gezählt. Jetzt wurde eine Konzentration von 5x10 5 Zellen/ml in Falcon Tubes (10 ml,
Becton Dickinson, Heidelberg) eingestellt und 20 µCi/ml [ 3 H]-L-Methionin hinzugegeben.
Durch den Einbau des radioaktiven [ 3 H]-L-Methionin wurden die Blasentumorzellen
markiert. Die Dauer des Markierungsvorganges betrug 4 Stunden bei 37°C und 5% CO 2 .
Anschließend wurden die Zellen mit Methionin-haltigem Medium gewaschen (120 s
Anlaufzeit, 10 min, 400g, 20°C) und auf eine Konzentration von 2,5x10 4 Zellen/ml
eingestellt. Zuletzt wurden 200 µl der Zellsuspension in eine Flachboden-Mikrotiterplatte
(96-well, F-Form, Falcon 3072; Becton Dickinson, Heidelberg) pipettiert, so dass jedes
well 5000 Tumor-Zellen enthielt.
Die Zellen wurden anschließend für 20 Stunden im Brutschrank (37°C, 5% CO 2 ) kultiviert,
um die Adhäsion der Zellen der adhärent wachsenden Zellinien zu gewährleisten.
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