Analytische HPLC

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Analytische HPLC Ultraschnelle chirale Trennung durch Ligandenaustausch - HPLC mit dynamisch beschichteten Chromolith ® Säulen > Abbildung 1. Dynamische Beschichtung der RP-18- Monolith-Säule mit chiralem Selektor Abstract Die Entwicklung von Verfahren zur Enantiomerentrennung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Chromatographieverfahren, wie z. B. TLC, GC, SFC und vor allem HPLC, werden seit über 20 Jahren zur Trennung von Enantiomeren eingesetzt. Diese Arbeit beschreibt die Vorbereitung und Anwendung dynamisch beschichteter Phasen für die Ligandenaustausch- Chromatographie zur Enantiomertrennung. Die Phasen wurden durch Einpumpen einer n-decyl-L-4-hydroxyprolin-Lösung mit einer handelsüblichen Chromolith ® RP-18e Säule vorbereitet. Diese Beschichtungen erwiesen sich bei Umgebungstemperatur über mehrere Monate gegen Desorption unter Verwendung von wässrigen mobilen Phasen stabil. Die Säulen wurden zur chiralen Trennung von Aminosäuren, Glycyl-Dipeptiden, diastereomeren Dipeptiden und Tripeptiden eingesetzt. Einen großen Vorteil bei der Verwendung von Chromolith ® Säulen stellt der niedrige Rückdruck dar, der zu hohen Flussraten führt. Zudem kann der chirale Selektor einfach entfernt oder ausgewechselt werden, indem die Säule mit Acetonitril oder Methanol gewaschen wird. Mit hohen Flussraten erzielt man sehr schnelle Trennungen innerhalb von Sekunden. Einführung Fast die Hälfte aller verwendeten Medikamente sind chiral. Es ist bekannt, dass in den meisten Fällen nur eines der Enantiomere pharmakologisch wirksam ist (Eutomer). Die Aktivität der Enantiomere kann sich sowohl qualitativ als auch quantitativ unterscheiden. Oftmals zeigt das inaktive Enantiomer (Distomer) unerwünschte Nebenwirkungen oder wirkt sogar toxisch. Auch wenn die Nebenwirkungen nicht gravierend sind, so muss das Distomer doch verstoffwechselt werden und stellt somit eine unnötige Belastung für den Organismus dar. Aus diesem Grund gewinnt die Entwicklung von Verfahren zur Trennung von Enantiomeren auf analytischer und präparativer Ebene zunehmend an Bedeutung. Das Prinzip der chiralen Ligandenaustausch-Chromatographie wurde von V.A.Davankov [2] eingeführt. Im Vergleich zur Vorbereitung chemisch gebundener chiraler stationärer Phasen stellt das Verfahren, nonchirale HPLC-Phasen mit chiralen Selektoren zu beschichten, eine weniger aufwändige Alternative dar. Außerdem kommen zunehmend monolithische Säulen bei der HPLC zum Einsatz. In diesem Artikel wird nun dargestellt, wie dynamisch beschichtete Phasen auf der Basis handelsüblicher monolithischer Säulen vom Typ RP-18e präpariert und zur chiralen Trennung von Aminosäuren und Dipeptiden eingesetzt werden. t1 (s) t2 (s) α Rs DOPA 9,9 17,5 2,05 1,46 Methionin 9,9 15,7 1,79 1,04 Abbildung 2. Beispiele für ultraschnelle Enantiomertrennung von (A) m-Tyrosin und (B) Phenylglycin Stationäre Phase: Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, (A) 25x4,6 mm, (B) 50x4,6 mm). Mobile Phase: 50 mM Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)- Sulfat, pH-Wert 4,5. Injektion 1 μl; Durchfluss: (A) 7 ml/min, (B) 8 ml/min Phenylglycin 15,8 38,5 2,73 2,45 m-Tyrosin 9,5 20,6 2,62 2,78 Gly-Leu 10,3 20,3 2,31 1,88 Gly-Nle 10,6 19,5 2,11 1,59 Gly-Phe 13,8 54,4 4,64 4,42 Gly-Trp 22,1 43,0 2,07 1,08 Leu-Gly 11,5 15,0 1,39 0,97 Tabelle 1: Ultraschnelle Trennung von Aminosäuren und Glycyl-Dipeptiden (ausgewählte Beispiele) Stationäre Phase: Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50x4,6 mm). Durchfluss: 8 ml/min. Mobile Phase: Aminosäuren: 50 mM Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5. Glycyl- Dipeptide: 0,1 mM Cu(II)-Sulfat 12 VWR ChromJournal Ausgabe 4 April 2008
Säulen Informationen zu unseren Produkten erhalten Sie bei Ihrem lokalen VWR-Ansprechpartner, senden Sie uns eine E-Mail an: chromjournal@eu.vwr.com oder besuchen Sie unsere Website www.vwr.com Abbildung 3. Chirale Trennung eines Gemisches aus o-, m- and p-Tyrosin. Stationäre Phase: Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP- 18e, 50x4,6 mm). Mobile Phase: 50 mM Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH- Wert 4,5. Injektion 3 μl; Durchfluss 1,5 ml/min Abbildung 4. Reinheitsprüfung einer handelsüblichen Probe von D-DOPA mit 0,05 % LDOPA Stationäre Phase: Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50x4,6 mm). Mobile Phase: 50 mM Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5. Injektion 1 μl; Durchfluss: 2 ml/min Material und Verfahren Alle Aminosäuren, Dipeptide, Kupfer(II)-Sulfate und N-Decyl-L-4-Hydroxyprolin stammen von Sigma Chemicals, Co. (St. Louis, USA). Natriumdihydrogenphosphat, Diethylether, Acetonitril und Methanol (Gradient Grade) stammen von VWR International (Darmstadt). Es kamen 2 HPLC-Systeme zum Einsatz: ein Hewlett- Packard 1050 Chromatograph (Waldbronn) mit Autosampler und UV-Detektor (System 1100, Agilent Technologies, Waldbronn), und ein Merck Hitachi HPLC-System vom Typ LaChrom ® , bestehend aus einer L-7100 Pumpe und einem L- 7455 Diodenarray-Detektor. Die Detektion wurde bei 208 nm durchgeführt. Die monolithischen Säulen vom Typ Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50 oder 25x4,6 mm) stammen von VWR International (Darmstadt). Durch 90-minütiges Einpumpen einer 0,025%igen wässrigen Lösung mit dem chiralen Selektor wurden die Säulen dynamisch beschichtet. Danach wurde durch Einpumpen einer wässrigen Cu(II)-Sulfat-Lösung Kupfer(II) in die Säule geladen. Die Phase wurde dann 15 Minuten lang mit der mobilen Phase ins Gleichgewicht gebracht. Mobile Phasen wurden vor dem Gebrauch mit Helium entgast und durch einen Membranfilter (0,2 μm, Schleicher & Schüll, Dassel) geleitet. Die Probenlösungen wurden, soweit nicht anders angegeben, durch Lösung der Analyten (1 mg) in bidestilliertem, deionisiertem Wasser (1 ml) vorbereitet. Das Injektionsvolumen betrug, soweit nicht anders angegeben, 1 μl. Zum Austausch des chiralen Selektors wurde die Säule mit Acetonitril oder Methanol gespült, um die Beschichtung zu entfernen. Ergebnisse Die Vorbereitung der Phasen ist ein sehr einfaches und kostengünstiges Verfahren. Ein Ausbluten der Säulen wird verhindert, wenn wässrige Puffer mit einem höchstens 50%igen Anteil an organischen Modifizierern eingesetzt werden. Die hydrophoben Moleküle des chiralen Selektors binden diesen durch hydrophobe Wechselwirkungen an die Chromolith ® SpeedROD (Abb. 1). Die Basislinienauflösung eines breiten Spektrums underivatisierter Aminosäuren erfolgte mit einer Natriumdihyrogenphosphat/Cu(II)-Lösung (pH-Wert 4,5) als mobile Phase. Dieses Verfahren eignet sich auch für Reinheitsuntersuchungen. In einer handelsüblichen Probe D-DOPA wurde ein Anteil von 0,05 % des L-Enantiomers festgestellt. Die enantiomere Elutionsfolge kann dann durch den Wechsel der Chiralität des Selektors umgekehrt werden. Da Chromolith ® Säulen aufgrund ihrer hohen Durchlässigkeit hohe Flussraten ermöglichen, wurden bei einer Flussrate von 8 ml/min ultraschnelle Trennungen innerhalb von 30 Sekunden erreicht. Schlussfolgerung Chromolith ® SpeedROD bietet ein einfaches und schnelles Verfahren zur Enantiomertrennung bei Aminosäuren und Dipeptiden durch Ligandenaustausch-Chromatographie. Dank der ausgezeichneten Durchlässigkeit dieser Säulen können hohe Flussraten angewendet werden. Die Zugabe von organischen Modifizierern wie Methanol führte zu einer Verringerung der Retentionszeiten. Bei einer Flussrate von 8 ml/min wurden in Minutenbruchteilen ultraschnelle Trennungen erzielt. Mit diesem Verfahren konnte eine Basislinienauflösung von 23 Aminosäuren und 3 Dipeptiden durchgeführt werden [1]. Referenzen [1] M. G. Schmid, K. Schreiner, D. Reisinger and G. Gübitz, J. Sep. Sci. 2006, 29, 1470 [2] S.V. Rogozhin, V.A. Davankov, Dokl. Akad. Nauk. 1970, 193, 94. Martin G. Schmid, Elfriede Pittler, Karin Schreiner, Daniela Reisinger and Gerald Gübitz Institut für pharmazeutische Wissenschaften, Abteilung pharnazeutische Chemmie, Karl-Franzens- Universität, Universitätsplatz 1, A-8010 Graz, Austria Kontakt: Martin G. Schmid, Karl-Franzens- Universität Graz, Institut für pharmazeutische Wissenschaften, Abteilung pharmazeutische Chemie, Universitätsplatz 1, 8010 Graz, Austria. Tel.: +43-316-380 5386, Fax: +43-316-380 9846 e-mail : martin.schmid@uni-graz.at VWR ChromJournal Ausgabe 4 April 2008 13
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