Analytische HPLC
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Säulen<br />
Informationen zu unseren Produkten erhalten Sie bei Ihrem lokalen VWR-Ansprechpartner,<br />
senden Sie uns eine E-Mail an:<br />
chromjournal@eu.vwr.com<br />
oder besuchen Sie unsere Website www.vwr.com<br />
Abbildung 3.<br />
Chirale Trennung eines Gemisches aus o-,<br />
m- and p-Tyrosin. Stationäre Phase:<br />
Beschichtete Chromolith ® SpeedROD (RP-<br />
18e, 50x4,6 mm). Mobile Phase: 50 mM<br />
Phosphatlösung, 0,1 mM Cu(II)-Sulfat, pH-<br />
Wert 4,5.<br />
Injektion 3 μl; Durchfluss 1,5 ml/min<br />
Abbildung 4.<br />
Reinheitsprüfung einer handelsüblichen<br />
Probe von D-DOPA mit 0,05 % LDOPA<br />
Stationäre Phase: Beschichtete<br />
Chromolith ® SpeedROD (RP-18e, 50x4,6<br />
mm).<br />
Mobile Phase: 50 mM Phosphatlösung, 0,1<br />
mM Cu(II)-Sulfat, pH-Wert 4,5.<br />
Injektion 1 μl; Durchfluss: 2 ml/min<br />
Material und Verfahren<br />
Alle Aminosäuren, Dipeptide, Kupfer(II)-Sulfate<br />
und N-Decyl-L-4-Hydroxyprolin stammen von<br />
Sigma Chemicals, Co. (St. Louis, USA).<br />
Natriumdihydrogenphosphat, Diethylether,<br />
Acetonitril und Methanol (Gradient Grade)<br />
stammen von VWR International (Darmstadt). Es<br />
kamen 2 <strong>HPLC</strong>-Systeme zum Einsatz: ein Hewlett-<br />
Packard 1050 Chromatograph (Waldbronn) mit<br />
Autosampler und UV-Detektor (System 1100,<br />
Agilent Technologies, Waldbronn), und ein Merck<br />
Hitachi <strong>HPLC</strong>-System vom Typ LaChrom ® ,<br />
bestehend aus einer L-7100 Pumpe und einem L-<br />
7455 Diodenarray-Detektor. Die Detektion wurde<br />
bei 208 nm durchgeführt. Die monolithischen<br />
Säulen vom Typ Chromolith ® SpeedROD (RP-18e,<br />
50 oder 25x4,6 mm) stammen von VWR<br />
International (Darmstadt). Durch 90-minütiges<br />
Einpumpen einer 0,025%igen wässrigen Lösung<br />
mit dem chiralen Selektor wurden die Säulen<br />
dynamisch beschichtet. Danach wurde durch<br />
Einpumpen einer wässrigen Cu(II)-Sulfat-Lösung<br />
Kupfer(II) in die Säule geladen. Die Phase wurde<br />
dann 15 Minuten lang mit der mobilen Phase ins<br />
Gleichgewicht gebracht. Mobile Phasen wurden<br />
vor dem Gebrauch mit Helium entgast und durch<br />
einen Membranfilter (0,2 μm, Schleicher & Schüll,<br />
Dassel) geleitet. Die Probenlösungen wurden,<br />
soweit nicht anders angegeben, durch Lösung der<br />
Analyten (1 mg) in bidestilliertem, deionisiertem<br />
Wasser (1 ml) vorbereitet. Das Injektionsvolumen<br />
betrug, soweit nicht anders angegeben, 1 μl. Zum<br />
Austausch des chiralen Selektors wurde die Säule<br />
mit Acetonitril oder Methanol gespült, um die<br />
Beschichtung zu entfernen.<br />
Ergebnisse<br />
Die Vorbereitung der Phasen ist ein sehr einfaches<br />
und kostengünstiges Verfahren. Ein Ausbluten der<br />
Säulen wird verhindert, wenn wässrige Puffer mit<br />
einem höchstens 50%igen Anteil an organischen<br />
Modifizierern eingesetzt werden. Die hydrophoben<br />
Moleküle des chiralen Selektors binden diesen<br />
durch hydrophobe Wechselwirkungen an die<br />
Chromolith ® SpeedROD (Abb. 1). Die<br />
Basislinienauflösung eines breiten Spektrums<br />
underivatisierter Aminosäuren erfolgte mit einer<br />
Natriumdihyrogenphosphat/Cu(II)-Lösung (pH-Wert<br />
4,5) als mobile Phase. Dieses Verfahren eignet sich<br />
auch für Reinheitsuntersuchungen. In einer<br />
handelsüblichen Probe D-DOPA wurde ein Anteil<br />
von 0,05 % des L-Enantiomers festgestellt. Die<br />
enantiomere Elutionsfolge kann dann durch den<br />
Wechsel der Chiralität des Selektors umgekehrt<br />
werden. Da Chromolith ® Säulen aufgrund ihrer<br />
hohen Durchlässigkeit hohe Flussraten ermöglichen,<br />
wurden bei einer Flussrate von 8 ml/min<br />
ultraschnelle Trennungen innerhalb von 30<br />
Sekunden erreicht.<br />
Schlussfolgerung<br />
Chromolith ® SpeedROD bietet ein einfaches und<br />
schnelles Verfahren zur Enantiomertrennung bei<br />
Aminosäuren und Dipeptiden durch<br />
Ligandenaustausch-Chromatographie. Dank der<br />
ausgezeichneten Durchlässigkeit dieser Säulen<br />
können hohe Flussraten angewendet werden. Die<br />
Zugabe von organischen Modifizierern wie<br />
Methanol führte zu einer Verringerung der<br />
Retentionszeiten. Bei einer Flussrate von 8 ml/min<br />
wurden in Minutenbruchteilen ultraschnelle<br />
Trennungen erzielt. Mit diesem Verfahren konnte<br />
eine Basislinienauflösung von 23 Aminosäuren<br />
und 3 Dipeptiden durchgeführt werden [1].<br />
Referenzen<br />
[1] M. G. Schmid, K. Schreiner, D. Reisinger and<br />
G. Gübitz, J. Sep. Sci. 2006, 29, 1470<br />
[2] S.V. Rogozhin, V.A. Davankov, Dokl. Akad.<br />
Nauk. 1970, 193, 94.<br />
Martin G. Schmid, Elfriede Pittler, Karin Schreiner,<br />
Daniela Reisinger and Gerald Gübitz<br />
Institut für pharmazeutische Wissenschaften,<br />
Abteilung pharnazeutische Chemmie, Karl-Franzens-<br />
Universität, Universitätsplatz 1, A-8010 Graz,<br />
Austria<br />
Kontakt: Martin G. Schmid, Karl-Franzens-<br />
Universität<br />
Graz, Institut für pharmazeutische Wissenschaften,<br />
Abteilung pharmazeutische Chemie,<br />
Universitätsplatz 1, 8010 Graz, Austria.<br />
Tel.: +43-316-380 5386, Fax: +43-316-380 9846<br />
e-mail : martin.schmid@uni-graz.at<br />
VWR ChromJournal Ausgabe 4 April 2008 13