F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

F1-Praktikum in Mikrobiologie
Block E: Physiologie der Mikroorganismen
03.12. - 07.12.2007
Universität Würzburg
Biozentrum, Raum A 104
Leitung: PD Dr. Dagmar Beier
Beginn: 03.12.2007, 9:15 Uhr

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Diauxie, Katabolitrepression
Escherichia coli kann neben Glucose auch andere Zucker wie z.B. Lactose als Kohlenstoffund
Energiequelle nutzen. Der erste Schritt beim Lactoseabbau ist die Hydrolyse von Lactose
zu Galactose und Glucose durch das Enzym β-Galactosidase. Die Expression der β-
Galactosidase wird durch Lactose induziert. Enthält das Wachstumsmedium aber gleichzeitig
Glucose und Lactose, so verwerten die Bakterien zunächst nur die Glucose. Erst wenn die
Glucose verbraucht ist, erfolgt die Adaptation an die noch vorhandene C-Quelle Lactose, da
die Anwesenheit von Glucose im Wachstumsmedium die Expression der β-Galactosidase
reprimiert. Man bezeichnet diesen Effekt als "Katabolitrepression". Die Umstellung des
Stoffwechsels vom Glucoseabbau zum Lactoseabbau schlägt sich in einer vorübergehenden
Verlangsamung der bakteriellen Zellvermehrung nieder, so dass die Bakterienkultur in
Gegenwart von Glucose und Lactose zwei exponentielle Wachstumsphasen durchläuft. Man
bezeichnet dies als "Diauxie" (zweiphasiges Wachstum).
In Enterobakterien wird die Katabolitrepression durch das Regulatorprotein CAP (auch als
Crp bezeichnet) vermittelt. Unter Katabolitrepression stehende Gene enthalten in ihrer
Promotorregion eine Bindestelle für einen Komplex aus CAP und dem Coaktivator cyclo-
AMP (cAMP). Erst durch die Bindung von CAP-cAMP an den Promotor wird die
Transkription der entsprechenden Gene aktiviert. Demzufolge wird die Expression Katabolitreprimierter
Gene durch die Konzentration von cAMP in der Zelle gesteuert. Die
Anwesenheit von Glucose im Wachstumsmedium beeinflusst den cAMP-Spiegel in der Zelle
über das Phosphotransferase (PTS)-System zur Aufnahme von Kohlenhydraten, das sich aus
den Proteinen EI und HPr und den Zucker-spezifischen EII-Komponenten zusammensetzt.
PTS-System:
PEP
EI
HPr
EIIA
EIIB
EIIC
Pyruvat P Glucose
P
Glucose-6-P
Ist im Medium Glucose vorhanden, wird diese über EII glc aufgenommen, so dass EIIA glc
vorrangig unphosphoryliert vorliegt. Ist keine Glucose vorhanden, überwiegt dagegen die
phosphorylierte Form von EIIA glc . EIIA glc -P stimuliert die Aktivität des Enzyms
Adenylatcyclase, was zur Erhöhung des cAMP-Spiegels und schließlich zur Ausbildung des
CAP-cAMP Komplexes führt. Ein weiterer Effekt, der zur Katabolitrepression beiträgt, ist die
„inducer-exclusion“: Unphosphoryliertes EIIA glc hemmt die Aktivität von nicht-PTS Zucker-
Permeasen und unterdrückt somit die Aufnahme von Inducer-Molekülen die zur Aktivierung
zusätzlicher kataboler Stoffwechselwege erforderlich wären.

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Aufgabe:
Untersuchung des Wachstumsverhaltens von E. coli in Gegenwart verschiedener
Kohlenstoffquellen (Glucose, Glucose/Lactose, Glucose/Galactose, Glucose/Sorbit).
Versuchsdurchführung:
- 6 ml einer Übernacht(ÜN)-Kultur von E. coli B leu3 in CM-Minimalmedium mit 0.45 %
Glycerin werden in ein Zentrifugenröhrchen (Plastik) überführt und 5 min in der
Tischzentrifuge zentrifugiert.
- Das Zellsediment wird 2x mit jeweils 6 ml Saline gewaschen und schließlich in 3 ml Saline
resuspendiert.
- 2 Erlenmeyerkolben mit Seitenansatz (Klettkolben) werden mit je 20 ml CM ohne C-Quelle
gefüllt. Anschließend wird Glucoselösung (0.04 g/ml), Lactoselösung (0.2 g/ml),
Galactoselösung (0.2 g/ml) bzw. Sorbitlösung (0.2 g/ml) zugegeben, wie in folgendem
Pipettierschema angegeben:
Kolben A: Kolben B:
Gruppe 1 und 2: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung
50 µl Lactoselösung
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Gruppe 3 und 4: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung
50 µl Galactoselösung
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Gruppe 5 und 6: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung
50 µl Sorbitlösung
- Zuletzt jeweils 1.0 ml der gewaschenen Bakteriensuspension zugeben.
- Zelldichte der Kulturen sofort nach Zugabe der Bakterien mit Hilfe des Klett-Photometers
bestimmen (als Leerwert: CM ohne C-Quelle).
- Klettkolben im Wasserbadschüttler bei 37°C inkubieren und dann alle 30 min die Zelldichte
mit dem Klett-Photometer bestimmen (für ca. 5 Stunden).
- Auswertung: Die ermittelten Werte für die Zelldichte (Klett-Einheiten) sind in Abhängigkeit
von der Zeit aufzutragen (mm-Papier). Bei welchen Kulturen ist Diauxie feststellbar?

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Enzyminduktion und Katabolitrepression am Beispiel der
β-Galactosidase von Escherichia coli
Das Enzym β-Galactosidase katalysiert die Spaltung von Lactose in Galactose und Glucose.
Eine E. coli-Zelle enthält bei Abwesenheit von Lactose im Nährmedium nur sehr wenige
(

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Aufgabe:
Die Induktion und Katabolitrepression der β-Galactosidase soll an einem E. coli-Stamm
mit wildtypischem lac-Operon untersucht werden (E. coli B leu3), sowie an zwei
Mutanten, die in der Regulation des lac-Operons gestört sind (E. coli W575; E. coli
1783).
Versuchsdurchführung:
Vorbereitung: Die drei E. coli-Stämme werden zunächst in CM-Minimalmedium mit 0.2 %
Glucose vorgezüchtet und dann nach Verbrauch der Glucose in CM-Medium mit 0.45 %
Glycerin kultiviert:
- Je 20 ml CM + 0.2 % Glucose mit E. coli B leu3, E. coli W575 bzw. E. coli 1783 animpfen
und über Nacht bei 37°C schütteln.
- Die Kulturen jeweils mit CM + 0.45 % Glycerin auf 200 ml auffüllen und ca. eine Stunde
bei 37°C schütteln.
Herstellung der Induktionsansätze in Erlenmeyerkolben:
I) 9 ml Bakteriensuspension (E. coli B leu3 bzw. W575 bzw. 1783)
1 ml CM mit 0.45 % Glycerin
II) 9 ml Bakteriensuspension (E. coli B leu3 bzw. W575 bzw. 1783)
0.5 ml CM mit 0.45 % Glycerin
0.5 ml Lactoselsg. (0.1 M)
III) 9 ml Bakteriensuspension (E. coli B leu3 bzw. W575 bzw. 1783)
0.5 ml Lactoselsg. (0.1 M)
0.5 ml Glucoselsg. (0.1 M)
- Die Erlenmeyerkolben mit den Induktionsansätzen werden im Wasserbadschüttler bei 37°C
inkubiert.
- Bei Beginn der Inkubation sowie nach 45 und 90 min wird jeweils 1 ml Suspension in ein
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und mit 50 µl Toluol und 50 µl
Natriumdesoxycholatlösung (1 %ig) versetzt. Die so hergestellten Proben werden unter
mehrmaligem Schütteln 30 min bei 37°C inkubiert (Zelllyse).
Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität in den hergestellten Zell-Lysaten:
Der Test beruht darauf, dass β-Galactosidase vom farblosen, synthetischen Substrat o-
Nitrophenylgalactosid (ONPG) das gelb gefärbte o-Nitrophenol abspaltet. Die Konzentration
dieses Produkts wird photometrisch bei 420 nm bestimmt.

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-Zur Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität werden folgende Ansätze hergestellt:
900 µl 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4
+ 100 µl ONPG (5 mg/ml)
+ 100 µl Zell-Lysat
(Die Zell-Lysate werden erst zugegeben, wenn alle Ansätze Phosphatpuffer und ONPG
enthalten).
- Die Testansätze werden 15 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Dann wird die
Enzymreaktion durch Zugabe von 40 µl Na 2 CO 3 -Lösung (10 %ig) gestoppt.
- Die Extinktion der Proben wird bei 420 nm in Halbmikroküvetten bestimmt.
Herstellung des Leerwerts:
1 ml 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4
+ 100 µl ONPG (5 mg/ml)
+ 40 µl Na 2 CO 3 -Lösung (10 %ig).
Auswertung:
Die Extinktionswerte der einzelnen Testansätze sind in die nachfolgende Tabelle einzutragen.
Um welche Mutationen kann es sich bei den Stämmen E. coli W575 bzw. E. coli 1783
handeln?
Zeit E. coli B leu3 E. coli W575 E. coli 1783
I II III I II III I II III
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
0 min
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
45 min
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------
90 min
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

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Alkoholische Gärung bei Saccharomyces cerevisiae
Fakultativ anaerobe Organismen können ihren Energiebedarf durch aerobe Atmung bzw. in
Abwesenheit von Sauerstoff durch anaerobe Atmung oder Gärung decken. Unter aeroben
Bedingungen wird Glucose vollständig zu CO 2 und H 2 O abgebaut, wobei durch
Substratkettenphosphorylierung und oxidative Phosphorylierung insgesamt 36 Mol ATP pro
Mol Glucose entstehen. Das beim Glucoseabbau zu NADH + H + reduzierte NAD + wird dabei
in der Atmungskette wieder vollständig regeneriert. Auch bei der anaeroben Atmung, bei der
oxidierte anorganische Verbindungen wie NO - 3 , SO 2- 4 oder Fe 3+ als terminale Elektronenakzeptoren
genutzt werden, wird NAD + durch Einspeisen von Elektronen in die Atmungskette
aus NADH + H + regeneriert.
Bei der Gärung werden die bei der Oxidation organischer Substrate anfallenden Elektronen
auf organische Akzeptoren übertragen. Gärungsreaktionen dienen somit der Regeneration von
NAD + , das zur Aufrechterhaltung der Glycolyse erforderlich ist, die bei der Gärung den
alleinigen energiegewinnenden Prozess darstellt. Der Energiegewinn bei der Gärung ist
folglich sehr gering, so dass Gärungsreaktionen nur dann ablaufen, wenn keine geeigneten
anorganischen terminalen Elektronenakzeptoren vorhanden sind. Gärungsreaktionen laufen
auch ab, wenn Enzyme der Atmungskette fehlen (z.B. in Hefe-"petite"-Mutanten) oder durch
Drogen blockiert sind. Bei vielen Bakterien wird das in der Glycolyse entstandene NADH +
H + dazu verwendet, deren Endprodukt, Pyruvat, zu Lactat zu reduzieren (Milchsäuregärung),
wobei wieder NAD + entsteht. Hefen, wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae,
decarboxylieren das Pyruvat zunächst und reduzieren das dabei entstehende Acetaldehyd
dann mit Hilfe von NADH + H + zu Ethanol (alkoholische Gärung). Sowohl bei der
Milchsäuregärung als auch bei der alkoholischen Gärung wird soviel NADH + H + verbraucht,
wie zuvor in der Glycolyse produziert wurde.
Um Lactat oder Ethanol weiter abbauen zu können, wird NAD + benötigt, das nur von der
Atmungskette geliefert werden kann. Fakultativ anaerobe Organismen, die unter anaeroben
Bedingungen Lactat oder Ethanol akkumulieren, können diese Substanzen folglich nur unter
aeroben Bedingungen unter Energiegewinn weiterverwerten.
Auch Glycerin kann nur unter aeroben Bedingungen als Energiequelle genutzt werden, denn
beim Umbau von 1 Mol Glycerin zu Pyruvat müssten 2 Mol NAD + zu NADH + H + reduziert
werden, bei der anschließenden Gärungsreaktion mit Lactat oder Ethanol als Endprodukt
könnte aber nur 1 Mol NAD + regeneriert werden.
Wird in Hefezellen das bei der alkoholischen Gärung anfallende Acetaldehyd durch
Hydrogensulfit oder Semicarbazid aus dem Prozess gezogen, so wird das in der Glycolyse
entstehende NADH + H + hauptsächlich dazu verwendet, um Dihydroxyaceton-3-phosphat zu
3-Phosphoglycerin zu reduzieren, das dann mit Hilfe der Phosphoglycerinkinase unter ATP-
Bildung in Glycerin umgewandelt wird. NAD + und NADH + H + sind dabei in einem
Kreislauf. Dieser Prozess wird auch angewendet, um Glycerin industriell herzustellen.

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Aufgabe:
Untersuchung der Fähigkeit von normalen (ρ + ) bzw. atmungsdefekten (ρ - )
Saccharomyces cerevisiae-Zellen, unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen Glucose
zu Ethanol zu vergären.
Versuchsdurchführung:
- 4 100 ml-Erlenmeyerkolben werden mit je 20 ml YNB-Minimalmedium gefüllt.
- Jeweils 2 Kolben werden mit einer Impföse voll normaler (ρ + ) bzw. atmungsdefekter (ρ - )
Saccharomyces cerevisiae-Zellen beimpft.
- Je ein Kolben mit ρ + Zellen und ρ - Zellen wird bei 30°C mindestens 15 h geschüttelt (aerobe
Kultur). Das Medium in den beiden anderen Kolben wird mit jeweils 20 ml sterilem
Paraffinöl überschichtet. Diese beiden Kolben werden dann ohne Schütteln >15 h bei 30°C im
Brutschrank inkubiert (anaerobe Kultur).
-Anschließend wird die in den 4 Kulturen gebildete Menge Ethanol mit Hilfe des optischen
Tests gemessen. Hierzu werden von jeder Kultur 1 ml Zellsuspension in der Tischzentrifuge 1
min abzentrifugiert. Je 0.1 ml des zellfreien Überstands werden mit 0.9 ml H 2 O verdünnt.
Optischer Test:
Die Reduktion von Acetaldehyd mit NADH + H + in der Alkoholdehydrogenasereaktion zu
Ethanol kann auch rückwärts verlaufen. Entfernt man das gebildete Acetaldehyd mit Hilfe
von Semicarbazid als Semicarbazon aus dem Reaktionsgleichgewicht, so wird der Alkohol
quantitativ umgesetzt und dabei eine äquivalente Menge NADH + H + aus NAD + gebildet.
NADH hat im Gegensatz zu NAD + ein Extinktionsmaximum bei einer Wellenlänge von 340
nm. Die gebildete Menge an NADH kann daher photometrisch bestimmt werden.
- In 9 Plastikküvetten werden jeweils 2.9 ml Semicarbazid/NAD + -Lösung gemischt mit:
1) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ + Kultur (aerob).
2) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ - Kultur (aerob).
3) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ + Kultur (anaerob).
4) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ - Kultur (anaerob).
5) 100 µl H 2 O (Leerwert).
6) 99 µl H 2 O + 1 µl 1% (v/v) Ethanol.
7) 98 µl H 2 O + 2 µl 1% (v/v) Ethanol.
8) 95 µl H 2 O + 5 µl 1% (v/v) Ethanol.
9) 90 µl H 2 O + 10 µl 1% (v/v) Ethanol.
- Alle Ansätze werden mit jeweils 25 µl Alkoholdehydrogenase (10 mg/ml in H 2 O; 200-400
U/mg) versetzt (sorgfältig mischen) und 1 h bei 30°C inkubiert.
- Danach wird die Extinktion der Proben bei 340 nm gegen Semicarbazid/NAD + -Lösung
gemessen.

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Auswertung:
Aus den Messwerten der Ansätze 5) bis 9) ist eine Eichkurve zu zeichnen. Mit Hilfe dieser
Eichkurve und den Messwerten der Ansätze 1) bis 4) ist die Menge Alkohol in g/l zu
berechnen, die die Hefezellen unter den verschiedenen Kulturbedingungen produziert haben.
Dichte von Ethanol = 0.78 g/ml.
Aufgabe:
Untersuchung der Fähigkeit von normalen und atmungsdefekten Saccharomyces
cerevisiae-Zellen, Glycerin unter aeroben Bedingungen als Energiequelle nutzen zu
können.
Die beiden Teststämme von S. cerevisiae (ρ + bzw. ρ - ) werden auf eine YEPD-Platte (enthält
Dextrose = Glucose) und eine YEPG-Platte (enthält Glycerin) ausgestrichen.
Die Agarplatten werden ÜN bei 30°C inkubiert.
Das Wachstum der beiden Hefestämme auf den Platten ist zu protokollieren.

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Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropher
Mutanten
Wildstämme von Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae wachsen in einem
gepufferten Mineralsalzmedium, das Glucose als einzige organische Verbindung enthält, die
als C- und Energiequelle benutzt wird. Auxotrophe Mutanten (Mangelmutanten) benötigen
dagegen zusätzlich einen oder mehrere organische Stoffe (z.B. bestimmte Aminosäuren), die
sie nicht mehr selbst synthetisieren können, weil durch eine Mutation ein Enzym defekt ist
oder ganz fehlt. Diese Mangelmutanten wachsen jedoch je nach der Lage des genetischen
Blocks nicht nur bei Zugabe des Endprodukts der unterbrochenen Biosynthesekette zum
Nährmedium, sondern auch mit Zwischenprodukten, nämlich mit solchen, deren Synthese
aufbauend auf dem Produkt erfolgt, dessen Synthese durch die Mutation verhindert wird.
Befindet sich der genetische Block in einer verzweigten Biosynthesekette, so benötigen
auxotrophe Mutanten unter Umständen mehrere Stoffe zum Wachstum (Polyauxotrophie).
Aus der Art und Zahl der wachstumswirksamen Substanzen lassen sich Rückschlüsse auf die
Lage des genetischen Blocks ziehen.
Auxotrophe Mutanten akkumulieren oftmals das Zwischenprodukt der Biosynthesekette, das
wegen des genetischen Blocks nicht mehr weiterverarbeitet werden kann. In vielen Fällen
ermöglicht das akkumulierte Produkt anderen Mutanten, die ihren genetischen Block an einer
früheren Stelle in der gleichen Biosynthesekette haben, das Wachstum ("Kreuzfütterung").
Aufgabe:
Bei drei Tryptophan-Mangelmutanten von Saccharomyces cerevisiae ist die Lage des
genetischen Blocks in der Tryptophan-Biosynthesekette durch einen
Kreuzfütterungstest zu bestimmen.
Versuchsdurchführung:
- Jeweils 100 ml YEPD-Medium werden mit einer der drei Trp-Mangelmutanten von S.
cerevisiae (HK51, HK78, HK145) angeimpft und über Nacht bei 30°C geschüttelt.
- Jede Gruppe pipettiert von den 3 Kulturen jeweils 5 ml in je ein Zentrifugenröhrchen
(Plastik).
- Die Hefezellen werden abzentrifugiert (3 min), 2x mit je 5 ml Saline gewaschen und
schließlich in 4 ml Saline suspendiert.
- Jeweils 3 ml der Zellsuspensionen werden zusammen mit 15 ml geschmolzenem YNB-
Minimalmedium-Agar (40-45°C) in sterile Petrischalen gegossen. In eine vierte Petrischale
werden 18 ml YNB-Minimalmedium-Agar ohne Zellen gegossen (Negativkontrolle). Durch
leichtes Bewegen der Petrischalen wird der Agar gleichmäßig verteilt.
- Die restlichen 1 ml Zellsuspension werden mit 5 ml Saline verdünnt. Ca. 50 μl der drei
verdünnten Zellsuspensionen werden nach dem Erstarren des Agars auf jeder Agaroberfläche
mit einer 1 ml-Glaspipette zickzackförmig ausgestrichen. Die Platten werden anschließend
bei 30°C inkubiert.

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- Nach 4 Tagen Inkubation wird das Wachstum der ausgestrichenen Stämme auf den
Agarplatten überprüft. Akkumulierte Anthranilsäure ist bei UV-Bestrahlung der Agarplatten
durch ihre blaue Fluoreszenz zu erkennen.
Auswertung:
Tragen Sie das Ergebnis des Kreuzfütterungstests in die nachfolgende Tabelle ein und geben
Sie die Lage des genetischen Blocks bei den Mutanten an.
Agar mit Mutante
Wachstum der ausgestrichenen Mangelmutanten
HK 51 HK 78 HK 145
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
HK51
HK78
HK145
HK51:
HK78:
A ----> B ----> C ----> Tryptophan
A ----> B ----> C ----> Tryptophan
HK145: A ----> B ----> C ----> Tryptophan
Aufgabe:
Lokalisierung des genetischen Blocks im Biosyntheseweg der aromatischen
Aminosäuren bei verschiedenen auxotrophen Mutanten von Saccharomyces cerevisiae
durch einen Wachstumstest.
Verwendete Mutanten von S. cerevisiae:
HK1 (Wildtyp), HK11, HK51, HK78, HK99, HK145, KP171-1.
Jede Gruppe untersucht eine Mutante.
Der Wachstumstest wird in supplementiertem Minimalmedium durchgeführt. Als
Wuchsstoffe werden verwendet: Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, p-Aminobenzoesäure,
Indol, Anthranilsäure und Shikimisäure. Chorisminsäure und Prephensäure stehen nicht zur
Verfügung. Die Konzentration der ausgegebenen Stammlösungen beträgt 1 mg/ml, bei p-
Aminobenzoesäure 0.1 mg/ml.
Überlegen Sie sich anhand des untenstehenden Schemas der Biosynthese aromatischer
Aminosäuren, welche Wuchsstoffe bzw. welche Wuchsstoffkombinationen verwendet werden
müssen, um den genetischen Block der jeweiligen S. cerevisiae-Mutante zu lokalisieren.
(Einschließlich einer Negativkontrolle ohne Wuchsstoff ergeben sich 10 Testmöglichkeiten.)

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Versuchsdurchführung:
- 10 Kapsenbergröhrchen (Glasröhrchen mit Metallverschluß) werden mit 5 ml YNB-
Minimalmedium gefüllt. Anschließend werden jeweils 0.5 ml der entsprechenden
Wuchsstofflösung(en) dazu pipettiert.
- Die zu untersuchenden S. cerevisiae-Mutanten wurden 1 Woche in je 20 ml YNB
(supplementiert mit 2 ml der entsprechenden Aminosäurestammlösung(en)) bei 30°C
vorgezüchtet. Jeweils 10 ml der Kulturen werden abzentrifugiert (3 min), mit 5 ml Saline
gewaschen, dann in 2.5 ml Saline resuspendiert und schließlich 1:20 mit Saline verdünnt.
- Jedes Röhrchen wird mit 50 µl der 20-fach verdünnten Zellsuspension beimpft.
- Nach 4 Tagen Inkubation bei 30°C (Schüttler) wird das Wachstum in den Röhrchen (Größe
des Zellsediments) protokolliert. Die Lage des genetischen Blocks bei der untersuchten
Mutante ist zu ermitteln und in das vereinfachte Schema der Biosynthese aromatischer
Aminosäuren einzutragen.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Zusatz zum Medium:
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Wachstum:
HK 1 ____________________________________________________________________
HK 11____________________________________________________________________
HK 51____________________________________________________________________
HK 78____________________________________________________________________
HK 99 ____________________________________________________________________
HK 145___________________________________________________________________
KP 171-1__________________________________________________________________
Prephensäure
Tyrosin
Phenylalanin
Shikimisäure
Chorisminsäure
Anthranilsäure
Indol
Tryptophan
p-Aminobenzoesäure

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Assimilation von Stickstoff: Regulation von Expression und Aktivität
der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli
Die meisten Mikroorganismen assimilieren Stickstoff durch Einbau von NH 3 in α-
Ketoglutarat und Glutaminsäure. Ist NH 3 in hohen Konzentrationen (> 1 mM) verfügbar, wird
α-Ketoglutarat durch die Glutamat-Dehydrogenase unter Verbrauch von NAD(P)H + H +
direkt zu Glutaminsäure umgesetzt.
(I)
Glutamatdehydrogenase
NH Glutaminsäure + NAD(P) + 3 + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H +
+
Unter Stickstoff-Mangelbedingungen werden durch die Glutamin-Synthetase unter ATP-
Verbrauch NH 3 und Glutaminsäure zu Glutamin umgesetzt. Bei der durch die Glutamin-2-
oxoglutarat-aminotransferase (GOGAT) katalysierten Reaktion von Glutamin und α-
Ketoglutarat entsteht dann unter Verbrauch von NAD(P)H + H + Glutaminsäure.
(II)
NH 3 + Glutaminsäure + ATP
Glutamin-
Synthetase
Glutamin + ADP + P i
GOGAT
(III) Glutamin + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H + 2 Glutaminsäure + NAD(P) +
Glutaminsäure und Glutamin sind wichtige Vorstufen zur Biosynthese von Aminosäuren und
Nucleotiden. Die Glutamin-Synthetase als Schlüsselenzym für ihre Synthese unterliegt
vielfältigen Regulationsmechanismen, sowohl hinsichtlich ihrer Expression als auch der
Enzymaktivität.
Die Transkription des glnA-Gens, das die Glutamin-Synthetase codiert, wird durch das
NtrB/NtrC Zweikomponenten-System in Abhängigkeit vom Glutamin- und α-Ketoglutarat-
Spiegel in der Zelle reguliert. Der phosphorylierte Response-Regulator NtrC~P wirkt dabei
als Transkriptionsaktivator für glnA. Der Phosphorylierungszustand von NtrC wird durch die
bifunktionelle Kinase/Phosphatase NtrB kontrolliert. Die Aktivität von NtrB wird wiederum
durch ein weiteres Protein, PII (GlnB), reguliert. Unter Stickstoff-Mangelbedingungen wird
PII durch das UTase/UR-Enzym (GlnD) reversibel an einem Tyrosin-Rest uridyliert, während
in Gegenwart hoher Glutamin-Konzentrationen vom selben Enzym der UMP-Rest wieder von
PII abgespalten wird. Das UTase/UR-Enzym sellt somit den eigentlichen Sensor für das
Verhältnis von Glutamin und α-Ketoglutarat in der Zelle dar. Das unmodifizierte PII
interagiert mit NtrB, was die Inhibition der Autokinase-Aktivität von NtrB bei gleichzeitiger
Stimulierung der Phosphatase-Aktivität von NtrB gegenüber NtrC~P bewirkt. Folglich liegt
NtrC bei Stickstoff-Überschuss in der unphosphorylierten Form vor und die Transkription
von glnA unterbleibt. PII-UMP interagiert nicht mit NtrB. Demzufolge überwiegt bei
Stickstoff-Mangel die Autokinase-Aktivität von NtrB, was zur Phosphorylierung von NtrC
und zur Transkription von glnA führt.

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Die Enzymaktivität der Glutamin-Synthetase wird durch Adenylierung, katalysiert durch das
bifunktionelle Enzym ATase, moduliert. Die Aktivität der ATase wird wiederum über PII
kontrolliert. Durch Adenylierung, die in Gegenwart hoher Konzentrationen von Glutamin
erfolgt, wenn PII unmodifiziert vorliegt, wird die Glutamin-Synthetase inhibiert. PII-UMP
bindet dagegen an die ATase und stimuliert die Deadenylierung der Glutamin-Synthetase,
wodurch diese aktiviert wird. Außerdem wird die Aktivität der Glutamin-Synthetase durch
kumulative Feedback-Hemmung durch verschiedene Endprodukte des Glutamin- und
Glutamatstoffwechsels (Tryptophan, Histidin, CTP, AMP, Glucosamin-6-phosphat,
Carbamylphosphat, außerdem Glycin, Serin und Alanin) reguliert.
Gln
ATP
PPi
ATas
GS-AMP
GS
PPi
PII-UMP
H 2 O
ATas
Gln
UTP
UTase
PII
UR
Gln
UMP
ADP
Gln
Pi
ATP
NtrB
NtrC~P
H 2 O
NtrB
ADP
NtrB~P
NtrC
Pi
Signaltransduktionssysteme zur Regulation der Glutamin-Synthetase aus E. coli

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Aufgabe:
Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht in
Nährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-Angebot
Verwendete E. coli-Stämme:
E. coli YMC10, E. coli RB9060 (ΔglnB), E. coli YMC26 (ΔglnD), E. coli NCM1850
(ntrC::Tn5)
Versuchsdurchführung:
- 50 ml Kulturen mit Ggln bzw. GLBgln-Medium werden mit Übernacht-Kulturen der E. coli
Stämme YMC10, RB9060,YMC26 bzw. NCM1850 zu einer Start-OD 600 von ca. 0.08 – 0.1
beimpft und unter Schütteln bei 37°C inkubiert bis eine OD 600 von ca. 0.5 erreicht ist. Pro
Kultur werden zwei 2 ml-Aliquots in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und die
Bakteriensuspensionen werden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 5 sec
schockgekühlt. Die Bakterien werden durch Zentrifugation sedimentiert (1 min, 12000 rpm),
der Überstand wird verworfen. Die Zellpellets werden sofort in flüssigem Stickstoff
eingefroren.
Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glutamin-Synthetase (GS)
Der Test beruht auf der Fähigkeit der Glutamin-Synthetase, statt NH 3 auch NH 2 OH
umzusetzen. In der Umkehrung der eigentlichen Reaktion wird Glutamin quantitativ in N-
Glutamylhydroxamsäure überführt.
O NH 2
C
CH 2
+ NH 2 OH
+ CH 2
H 3 N CH
COO -
O NHOH
Glutamin-
C
Synthetase
CH 2
+ NH 3
ADP, AsO 2- 4 , Mn 2+ + CH 2
H 3 N CH
COO
Der Test ist sehr einfach, kann im Rohextrakt angewendet werden und zeigt die Aktivität des
Enzyms genau an.
Das entstehende γ-Glutamylhydroxamat gibt zusammen mit Fe(III)-Salzen einen stark
gefärbten Komplex. Seine Konzentration kann bei 546 nm photometrisch bestimmt werden.
- Die Zellpellets werden auf Eis aufgetaut und in 1 ml eiskalter Waschlösung (1% KCl)
resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (1 min, 12000 rpm) werden die Zellen in 1 ml
Permeabilisierungslösung (1% KCl, 0.1 mg/ml CTAB) resuspendiert. Die Proben, die
identische Zellsuspensionen enthalten (siehe oben) werden nun vereinigt und die
Zellsuspensionen werden für 3 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden durch erneute
Zentrifugation geerntet und in 1 ml Reaktionsmix resuspendiert. Zwei mal 450 μl der
Suspension werden für den enzymatischen Test verwendet und in 1,5 ml Eppendorf-
Reaktionsgefäße überführt, der Rest dient zur Bestimmung der Proteinkonzentration im Zell-
Lysat.

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- GS-Enzymtest:
Die Eppendorf-Gefäße, die 450 μl der Zellsuspensionen enthalten, werden 5 min bei 37°C
vorinkubiert. Die Transferase-Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösung
gestartet. Nach 10- bzw. 30-minütiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch die
Zugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt. Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000
rpm) und die optische Dichte des Überstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatz
ohne Zellsuspension) gemessen. Die Konzentration an γ-Glutamylhydroxamat in den Proben
wird mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes bestimmt:
P(λ) = P 0 (λ)e -ε(λ)cx
P: Strahlungsleistung
λ: Wellenlänge
ε: Extinktionskoeffizient
c: Konzentration
x: Küvettendicke
Am Photometer wird die dekadische Extinktion -log(P/P 0 ) bestimmt. Der dekadische
Extinktionskoeffizient des Komplexes aus Fe(III) und γ-Glutamylhydroxamat (ε 546 ) beträgt
436 cm 2 /mmol. Die Dicke der Küvette beträgt 1 cm. Daraus ergibt sich:
c (mmol/cm 3 ) = - log(P/P 0 ) / ε 546
Die Glutaminsynthetase-Aktivität wird in nmol γ-Glutamylhydroxamat min -1 (mg Protein) -1
angegeben.
-Bestimmung der Proteinkonzentration der Zell-Lysate:
Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe des „Bio-Rad Protein Assay“ ermittelt, der darauf
beruht, dass sich das Absorptionsmaximun einer sauren Lösung von Coomassie Brilliant Blue
G-250 von 465 nm nach 595 nm verschiebt, wenn die Substanz an Protein bindet. Zur
Erstellung einer Eichgeraden werden 1, 2, 4, 6, 8 und 10 μl einer BSA-Lösung (1μg/μl) zu je
800 μl Wasser gegeben, das in 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße vorgelegt wurde.
Anschließend werden die Ansätze mit 200 μl „Bio-Rad Protein Assay“-Lösung versetzt und
gemischt. Nach fünf Minuten wird die OD 595 der Ansätze gegen einen Leerwert (800 μl d
H 2 O, 200 μl Bio-Rad Assay-Lösung) bestimmt. Von den Zell-Lysaten werden jeweils 10 und
20 μl entsprechend vermessen. Die Proteinkonzentration wird in mg/ml angegeben.

17
Aufgabe:
Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwart
von Inhibitoren
Versuchsdurchführung:
In diesem Experiment wird gereinigte Glutamin-Synthetase aus E. coli verwendet. Der GS-
Enzymtest wird im wesentlichen durchgeführt wie oben beschrieben. Dazu wird folgender
Ansatz in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert und 5 min bei 37°C
vorinkubiert:
450 μl Reaktionsmix
20 μl Glutamin-Synthetase-Lösung (1.7 μg/μl)
50 μl dH 2 O bzw. Inhibitor-Lösung
Als Inhibitoren werden verwendet: Glycin (Stocklösung: 300 mM)
Alanin (Stocklösung: 300 mM)
CTP (Stocklösung: 100 mM)
Glycin + CTP (1:1 Gemisch aus 600 mM Glycin und
200 mM CTP)
Die Transferase-Reaktion wird wiederum durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösung
gestartet. Nach 10 minütiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch die Zugabe von 1
ml Stopplösung abgestoppt. Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000 rpm) und die
optische Dichte des Überstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatz ohne Enzym)
gemessen.
Die Glutaminsynthetase-Aktivität für die einzelnen Ansätze wird bestimmt und in nmol γ-
Glutamylhydroxamat min -1 (mg Protein) -1 angegeben.

18
Antibiotika
Antibiotika sind chemische Substanzen, die von bestimmten pro- oder eukaryontischen
Mikroorganismen produziert und sezerniert werden und die andere Mikroorganismen abtöten
oder in ihrem Wachstum inhibieren. Sie werden deshalb in der Medizin zur Bekämpfung
bakterieller Infektionskrankheiten eingesetzt, einige auch zur Bekämpfung von
Pilzerkrankungen.
Heute sind über 8000 antibiotisch wirksame Substanzen bekannt. Die meisten kommerziell
verwendeten Antibiotika werden von filamentösen Pilzen (Penicillium, Cephalosporium) und
von Bakterien der Actinomycetengruppe (v.a. Streptomyceten) sowie Bazillen gebildet.
Antibiotikum Produzierender Mikroorganismus
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Bacitracin Bacillus subtilis
Cephalosporin Cephalosporium sp.
Chloramphenicol Streptomyces venezuelae (heute chem. Synthese)
Cycloheximid Streptomyces griseus
Cycloserin S. orchidaceus
Erythromycin S. erythreus
Griseofulvin Penicillium griseofulvin
Kanamycin S. kanamyceticus
Lincomycin S. lincolnensis
Neomycin S. fradiae
Nystatin
S. noursei
Penicillin
Penicillium chrysogenum
Polymyxin B Bacillus polymyxa
Streptomycin S. griseus
Tetracycline S. aureofaciens, S. rimosus
Die Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber verschiedenen Antibiotika ist
unterschiedlich. Gewöhnlich sind Gram-positive Bakterien sensitiver gegenüber Antibiotika
als Gram-negative Bakterien. Antibiotika, die sowohl auf Gram-positive, als auch auf Gramnegative
Bakterien wirken, werden als "Breitband-Antibiotika" bezeichnet.
Einige natürlich vorkommende Antibiotika können durch chemische Modifikationen
effektiver gemacht werden. Die so hergestellten semisynthetischen Antibiotika besitzen oft
ein erweitertes Wirkungsspektrum.

19
Wirkungsweise verschiedener Antibiotika:
Angriffsort im Mikroorganismus Beispiel
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1) Bakterielle Zellwand (Murein) - Penicilline (z.B. Penicillin G, Ampicillin)
- Cephalosporine (z.B. Cephamycin)
2) Proteinsynthese
(a) bei Prokaryonten
(b) bei Eukaryonten
- Aminoglycoside (z.B. Streptomycin,
Kanamycin, Gentamycin, Neomycin)
- Tetracycline
- Fusidinsäure
- Chloramphenicol
- Makrolidantibiotika (z.B. Erythromycin)
- Lincomycin
- Puromycin
- Cycloheximid
3) Zytoplasmamembran
(a) bei Prokaryonten - Polymyxine (z.B. Polymyxin B)
- Gramicidin A
- Gramicidin S
(b) bei Eukaryonten
- Polyene (z.B. Nystatin)
4) Nukleinsäuresynthese
(a) bei Prokaryonten
(b) bei Pro- und Eukaryonten
- Nalidixinsäure (inhibiert DNA-Synthese)
- Rifamycine (z.B. Rifamycin B, Rifampicin;
inhibieren RNA-Synthese)
- Actinomycin D (inhibiert RNA-Synthese)
Klassifizierung von Antibiotika aufgrund ihrer chemischen Struktur:
1. Kohlenhydrat-haltige Antibiotika:
Reine Zucker (Nojrimycin)
Aminoglycoside (Streptomycin)
Orthosomycine (Everninomicin)
N-Glycoside (Streptothricin)
C-Glycoside (Vancomycin)
Glycolipide (Moenomycin)
2. Makrocyclische Lactone:
Makrolid-Antibiotika (Erythromycin)
Polyene (Candicidin)
Ansamycine (Rifamycin)
Makrotetrolide (Tetranactin)

20
3. Chinone und Chinonderivate:
Tetracycline (Tetracyclin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin)
Anthracycline (Adriamycin)
Naphthochinone (Actinorhodin)
Benzochinone (Mitomycin)
4. Aminosäure- und Peptidantibiotika:
Aminosäurederivate (Cycloserin)
β-Lactam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine)
Peptidantibiotika (Bacitracin)
Chromopeptide (Actinomycin D)
Depsipeptide (Valinomycin)
Chelatbildende Peptide (Bleomycine)
5. Heterocyclische, N-haltige Antibiotika:
Nucleosid-Antibiotika (Polyoxine)
6. Heterocyclische, O-haltige Antibiotika:
Polyether-Antibiotika (Monensin)
7. Alizyklische Derivate:
Cycloalkanderivate (Cycloheximid)
Steroid-Antibiotika (Fusidinsäure)
8. Aromatische Antibiotika:
Benzenderivate (Chloramphenicol)
Kondensierte aromatische Antibiotika (Griseofulvin)
Aromatische Äther (Novobiocin)
9. Aliphatische Antibiotika:
Phosphor-haltige Verbindungen (Fosfomycine)
Resistenz von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika:
Die Resistenz von Mikroorganismen gegenüber bestimmten Antibiotika kann verschiedene
Ursachen haben:
1. Dem Mikroorganismus fehlt die Struktur, an der das Antibiotikum angreift. Beisp.:
Mycoplasmen besitzen keine Zellwand und sind daher resistent gegenüber Penicillinen.
2. Der Mikroorganismus ist impermeabel für das Antibiotikum. Beisp.: Resistenz von
Pseudomonas aeruginosa gegenüber Penicillinen.
3. Der Mikroorganismus inaktiviert das Antibiotikum (enzymatischer Abbau oder chemische
Modifikation). Beisp.: Spaltung von Penicillinen durch β-Lactamase; Acetylierung von
Chloramphenicol durch Chloramphenicol-Acetyltransferase (Cat-Protein); Inaktivierung von
Streptomycin oder Kanamycin durch Phosphorylierung.
4. Das Ziel des Antibiotikums in der Zelle ist verändert und dadurch für das Antibiotikum
unzugänglich. Beisp.: Resistenz gegenüber Rifamycin durch Veränderung der β-Untereinheit
der RNA-Polymerase; Resistenz gegenüber Erythromycin durch Veränderung der 50S-
Untereinheit der Ribosomen.

21
5. Das Antibiotikum wird durch ein spezifisches Efflux-System aus der Zelle transportiert.
6. Der Reaktionsweg, in den ein Antibiotikum eingreift, kann verändert sein.
Häufig ist die Resistenz von Bakterien gegenüber bestimmten Antibiotika auf
extrachromosomalen Plasmiden, den sog. R-Faktoren, genetisch determiniert. Solche
plasmidkodierten Resistenzen sind z.B. gegenüber Antibiotika wie Chloramphenicol,
Erythromycin, Gentamycin, Kanamycin, Penicillinen und Tetracyclinen gefunden worden.
Viele R-Faktoren enthalten auch mehrere Resistenzgene.
R-Faktoren können durch Konjugation nicht nur auf Bakterien der gleichen Art, sondern auch
auf andere Bakterien übertragen werden. Eine besondere Gefahr liegt z.B. darin, dass R-
Faktoren von E. coli auch auf pathogene Enterobakterien wie Shigella dysenteriae (Erreger
der Ruhr) oder Salmonella typhimurium (verursacht Gastroenteritis) übertragen werden
können. Vor allem durch den starken Einsatz von Antibiotika in der Medizin und als Zusatz
von Futtermitteln sind R-Faktor-tragende Bakterien stark angereichert worden und stellen
heute ein beachtliches medizinisches Problem dar. Eine zurückhaltende Anwendung der
Antibiotika ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt die einzige Möglichkeit, um eine Verringerung
der resistenten Keime zu erreichen, da keine therapeutischen Methoden verfügbar sind, um R-
Faktoren zu eliminieren.
Aufgabe:
Untersuchung der Resistenz von R-Faktor-tragenden E. coli- und B. subtilis-Stämmen
gegenüber verschiedenen Antibiotika.
Bakterienstämme: E. coli K-12
E. coli W945 (R1drd16)
E. coli K-12 (R1drd19)
E. coli EndoI (R64)
E. coli DH5α (pACYC184)
B. subtilis
B. subtilis 1E7 (pE194 cop6)
Versuchsdurchführung:
Jeweils 0.1 ml ÜN-Kultur von den 7 Stämmen werden auf YT-Agarplatten ausplattiert (4
Platten pro Stamm). Anschließend werden Papierplättchen auf die Agarplatten gelegt, die
zuvor mit 5 µg, 10 µg, 50 µg bzw. 100 µg verschiedener Antibiotika getränkt wurden (bei
Penicillin G 50 µg, 100 µg, 500 µg bzw. 1000 µg).

22
Zum Tränken der Papierplättchen werden folgende Antibiotikalösungen verwendet:
Penicillin G (Pn) (10 mg/ml bzw. 100 mg/ml in H 2 O)
Ampicillin (Ap) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H 2 O)
Kanamycin (Km) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H 2 O)
Streptomycin (Sm) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H 2 O)
Tetracyclin (Tc)
(1mg/ml bzw. 10 mg/ml in 50% Ethanol)
Chloramphenicol (Cm) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in Ethanol)
Erythromycin (Em) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in Ethanol)
Die Agarplatten mit den aufgelegten Papierplättchen werden 2-3 Stunden im Kühlschrank
stehen gelassen, damit die Antibiotika in den Agar diffundieren können. Danach werden die
Platten ÜN bei 37°C inkubiert. Bakterien, die gegenüber einem Antibiotikum sensitiv sind,
werden abgetötet, so dass sich im Zellrasen klare Zonen um das entsprechende Plättchen
bilden.
Auswertung:
Das Resistenzmuster der versch. E. coli- und B. subtilis-Stämme ist zu bestimmen und in die
folgende Tabelle einzutragen.
(R = resistent; S+, S++ und S+++ = schwach, mittel und stark sensitiv)
Pn Ap Km Sm Tc Cm Em
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
E. coli K-12
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
E. coli W945 (R1drd16)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
E. coli K-12 (R1drd19)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
E. coli EndoI (R64)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
E. coli DH5α (pACYC184)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
B. subtilis
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
B. subtilis 1E7 (pE194 cop6)

23
Untersuchung der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens (Tetracyclin),
Streptomyces griseus (Streptomycin), Streptomyces venezuelae (Chloramphenicol) und
Streptomyces rimosus (Oxytetracyclin)
Die wichtigste Stoffwechselleistung der Streptomyceten ist ihre Fähigkeit, chemisch sehr
unterschiedliche antibiotisch wirkende Substanzen zu synthetisieren. Etwa 80% der
therapeutisch eingesetzten Antibiotika werden aus Streptomyceten isoliert.
Aufgabe:
Biologischer Nachweis der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens,
Streptomyces griseus und Streptomyces venezuelae.
Streptomyceten-Stämme:
Testkeime:
Streptomyces aureofaciens
Streptomyces griseus subsp. griseus
Streptomyces venezuelae
E. coli K-12 (in 2xYT, 37°C)
Bacillus subtilis (in 2xYT, 30°C)
Pseudomonas fluorescens (in 2xYT, 24°C)
Serratia marcescens (in 2xYT, 30°C)
(1) Agarstrichtest:
Die Streptomycetenstämme werden jeweils in der Form eines dicken Impfstrichs in der Mitte
von GYM-Agarplatten ausgestrichen (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Platten werden ca. 4
Tage bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die versch. Testkeime senkrecht zum
Antibiotika-Produzenten hin ausgestrichen (jeweils 1 Tropfen ÜN-Kultur der Teststämme
ausstreichen). Die Platten werden danach 1-2 Tage bei 30°C bebrütet. Mikroorganismen, die
sensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) des jeweiligen
Streptomycetenstammes sind, können in seiner unmittelbaren Nachbarschaft nicht wachsen.
(2) Agarzylindertest:
Jeweils 100 µl von stationären Kulturen der Streptomycetenstämme in GYM-Medium werden
auf GYM-Agarplatten ausplattiert (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Agarplatten werden für 2-
5 Tage bei 30°C inkubiert. Danach werden aus den Platten Agarzylinder ausgestochen. Die
mit den verschiedenen Streptomycetenstämmen bewachsenen Agarzylinder werden in eine
leere Petrischale gesetzt (bewachsene Seite nach oben) und mit ca. 20 ml geschmolzenem,
0,75 %igem YT-Weichagar (ca. 42°C) umgossen, der zuvor mit einem der oben angegebenen
Testkeime angeimpft wurde (0.5 ml ÜN-Kultur des Testkeims pro 20 ml Weichagar). Nach
dem Erstarren des Weichagars werden zur Kontrolle Papierplättchen auf die Agarplatten
gelegt, die mit 50 μg der von dem jeweiligen Streptomyceten produzierten Antibiotika
getränkt wurden (S. aureofaciens: Tetracyclin; S. griseus: Streptomycin; S. venezuelae:
Chloramphenicol). Die Petrischalen werden dann ÜN bei 30°C bzw. 37°C (siehe Testkeime)
inkubiert. Es bilden sich Hemmzonen um die Agarzylinder bzw. Kontrollplättchen, wenn der

24
Testorganismus sensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) der
Streptomyceten ist.
Aufgabe:
Quantitative Bestimmung der Oxytetracyclinproduktion durch Streptomyces rimosus.
Versuchsdurchführung:
Zwei Impfösen Myzel von S. rimosus RF-107 werden in 5 ml Vorzuchtmedium inokuliert
(100 ml-Schikanekolben) und 48 Stunden bei 30°C geschüttelt. Anschließend werden 45 ml
Produktionsmedium mit 5 ml Vorkultur beimpft (200 ml-Schikanekolben) und bei 30°C
geschüttelt. Nach 24, 48, 72 und 96 Stunden werden von der Kultur je 2 µl bzw. 20 µl auf
Papierplättchen pipettiert. Die Plättchen werden nach dem Antrocknen jeweils auf eine YT-
Agarplatte gelegt, die zuvor mit 3.5 ml geschmolzenem, 0.75 %igem YT-Weichagar + 100 µl
ÜN-Kultur von Micrococcus luteus oder M. flavus (Oxytetracyclin-sensitive Testkeime)
überschichtet wurde. Als Kontrolle werden von einer Oxytetracyclinlösung (0.01 mg/ml bzw.
0.1 mg/ml in Methanol/HCl pH 2.0) 0.02 µg, 0.05 µg, 0.1 µg, 0.2 µg, 0.5 µg, 1.0 µg, 1.5 μg
und 2 μg auf Filterplättchen pipettiert und ebenfalls auf die Agarplatte gelegt. Nach einer
Inkubation ÜN bei 30°C wird die produzierte Oxytetracyclinmenge vergleichend mit Hilfe
einer Eichkurve bestimmt.

25
Anhang: Stämme, Medien, Chemikalien
(mit Mengenangaben für 10 Gruppen)
Diauxie, Katabolitrepression:
E. coli B leu3 (auf YT-Platte, 37°C)
1.0 l CM-Minimalmedium ohne C-Quelle: 0.2 g MgSO 4 x 7 H 2 O
2.0 g Zitronensäure (C 6 H 8 O 7 x H 2 O)
2.0 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O
5.0 g KH 2 PO 4
2.0 g (NH 4 )H 2 PO 4 (ersatzweise (NH 4 ) 2 HPO 4 )
3.4 g KOH
1.0 l H 2 O
nach dem Autoklavieren 50 mg Leucin
(aus einer 10 mg/ml-Stammlösung) zugeben.
200 ml CM mit 0.45 % Glycerin (= 195.5 ml CM + 4.5 ml 20 % Glycerin)
100 ml Glucoselösung (0.04 g/ml)
100 ml Lactoselösung (0.2 g/ml)
100 ml Galactoselösung (0.2 g/ml)
100 ml Sorbitlösung (0.2 g/ml)
500 ml Saline (für 1.0 l: 5.0 g NaCl; 0.12 g MgSO 4 x 7 H 2 O; 1.0 l H 2 O)
Enzyminduktion und Katabolitrepression am Beispiel der β-Galactosidase von
Escherichia coli:
E. coli B leu3 (auf YT-Platte, 37°C)
E. coli W575 ( " " )
E. coli 1783 ( " " )
2.0 l CM mit 0.45 % Glycerin (= 1.955 l CM + 45 ml 20 % Glycerin)
200 ml CM mit 0.2 % Glucose (= 198 ml CM + 2 ml 20 % Glucose)
200 ml 20 %ige Glucoselösung (für CM mit 0.2 % Glucose)
200 ml 20 %ige Glycerinlösung ( für CM mit 0.45 % Glycerin)

26
100 ml 0.1 M Lactose
100 ml 0.1 M Glucose
100 ml Toluol
100 ml Natriumdesoxycholatlösung (1 %ig)
200 ml 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4 (mit 7 µl β-Mercaptoethanol pro 1.0 l)
50 ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) (5 mg/ml)
100 ml 10 % Natriumcarbonat
Alkoholische Gärung bei Saccharomyces cerevisiae:
Saccharomyces cerevisiae DX 2180-13 ρ +
Saccharomyces cerevisiae DX 2180-13 ρ -
(auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium (30°C))
(auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium (30°C))
1.0 l YNB-Hefe-Minimalmedium: 6.7 g Yeast nitrogen base (YNB) w/o amino acids
5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose)
H 2 O ad 100 ml;
sterilfiltrieren, bei 4°C lagern;
vor Gebrauch 1:10 mit H 2 O verdünnen.
HM-Agarplatten:
4.0 g Yeast extract
10.0 g Maltose
15.0 g Agar
H 2 O ad 992 ml
nach dem Autoklavieren 8.0 ml 50 %ige
Glucoselösung zugeben.
500 ml steriles Paraffinöl
500 ml Semicarbazid/NAD + -Lösung: 75 mM Na-Pyrophosphat (= 9.97 g pro 500 ml)
20 mM Glycin (= 0.75 g pro 500 ml)
75 mM Semicarbazid-hydrochlorid (= 4.18 g
pro 500 ml)
7.5 mM β-NAD (Fluka)(= 2.49 g pro 500 ml)
(β-NAD erst unmittelbar vor dem Versuch
zugeben).
10 ml 1 % (v/v) Ethanol p.a.
Alkoholdehydrogenase (Fluka): aus Bäckerhefe, NAD/NADH-frei, 200-400 U/mg, kurz vor
Gebrauch in H 2 O lösen (10 mg/ml).

27
1.0 l YEPD-Agarplatten: 10.0 g Yeast extract
20.0 g Bacto-Pepton
15.0 g Agar
960 ml H 2 O
nach dem Autoklavieren 40 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben.
1.0 l YEPG-Agarplatten: 10.0 g Yeast extract
20.0 g Bacto-Pepton
15.0 g Agar
975 ml H 2 O
nach dem Autoklavieren 25 ml 86 %ige Glycerinlösung
zugeben.
Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropher Mutanten:
Saccharomyces cerevisiae HK 1 (auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium, 30°C)
S. cerevisiae HK 11 ( " )
S. cerevisiae HK 51 ( " )
S. cerevisiae HK 78 ( " )
S. cerevisiae HK 99 ( " )
S. cerevisiae HK 145 ( " )
S. cerevisiae KP 171-1 ( " )
1.0 l YEPD-Medium: 10.0 g Yeast extract
20.0 g Bacto-Pepton
960 ml H 2 O
nach dem Autoklavieren 40 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben.
1.0 l YNB-Minimalmedium: 6.7 g Yeast nitrogen base (YNB) w/o amino acids
5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose)
H 2 O ad 100 ml;
sterilfiltrieren, bei 4°C lagern;
vor Gebrauch 1:10 mit H 2 O verdünnen.
1.0 l YNB-Minimalmedium-Agar: (a) 6.7 g YNB w/o amino acids
5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose)
H 2 O ad 100 ml;
sterilfiltrieren, bei 4°C lagern;
(b) 900 ml H 2 O + 15 g Agar;
autoklavieren;
Ansätze (a) und (b) mischen.
1.0 l Saline (5.0 g NaCl; 0.12 g MgSO 4 x 7 H 2 O; 1.0 l H 2 O)

28
Je 100 ml: Tyrosin (1 mg/ml)
Phenylalanin ( " )
Tryptophan ( " )
Indol ( " )
Anthranilsäure ( " )
Shikimisäure ( " )
p-Aminobenzoesäure (0.1 mg/ml)
Regulation von Expression und Enzymaktivität der Glutamin-Synthetase von
Escherichia coli:
E. coli YMC10 (auf LB-Platte, 37°C)
E. coli RB9060 (ΔglnB) (auf LB-Platte, 37°C)
E. coli YMC26 (ΔglnD) (auf LB-Platte, 37°C)
E. coli NCM1850 (ntrC::Tn5) (auf LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin, 37°C)
1.0 l GLBgln: 10 g Bacto Pepton
5 g Bacto Yeast Extract
10 g NaCl
H 2 O ad 870 ml
nach dem Autoklavieren 20 ml 20% Glucose-Lösung und 100 ml Glutamin-
Lösung (20 mg/ml) zugeben.
1.0 l Ggln: 10.5 g K 2 HPO 4
4.5 g KH 2 PO 4
0.246 g MgSO 4 x 7 H 2 O
H 2 O ad 870 ml
nach dem Autoklavieren 20 ml 20% Glucose-Lösung und 100 ml Glutamin-
Lösung (20 mg/ml) zugeben.
1 l Waschlösung: 1% KCl
500 ml Permeabilisierungslösung: 1% KCl, 0.1mg/ml CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid)
Reaktionsmix:
benötigt werden bei Durchführung aller Experimente 15 ml
Reaktionsmix pro Gruppe
2.25 ml 1 M Imidazol, pH 7.0
0.37 ml 0.8 M Hydroxylamin pH 7*
45 μl 0.1 M MnCl 2
1.5 ml 0.28 M Na-Arsenat
0.15 ml 0.04 M Na-ADP
9 ml H 2 O
* Hydroxylamin bei pH 7 ist instabil, es muß daher unmittelbar vor
Gebrauch durch Mischen gleicher Volumenteile einer 1.6 M

29
Hydroxylammoniumchlorid-Lösung und einer NaOH-Lösung
hergestellt werden. Die NaOH-Lösung wird vorher so eingestellt (1.4
M), dass der pH-Wert der Mischung etwa 7 beträgt.
Stopp-Lösung:
Glutamin-Lösung:
55 g FeCl 3 x 6 H 2 O
20 g Trichloressigsäure
21 ml konz. HCl
H 2 O ad 1 l
2.92 g ad 100 ml H 2 O (0.2 M), frisch hergestellt
Inhibitor-Lösungen: 300 bzw. 600 mM Glycin (10 ml)
300 mM Alanin (10 ml)
100 bzw. 200 mM CTP (2 ml)
Glutamin-Synthetase aus E. coli (Sigma-Aldrich), kurz vor Gebrauch in d H 2 0 lösen
Antibiotika:
Escherichia coli K12
(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
37°C)
E. coli W945 (R1drd16) (Km r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
37°C)
E. coli K12 (R1drd19) (Cm r , Sm r , Ap r , Km r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
37°C)
E. coli EndoI (R64) (Sm r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
37°C)
E. coli DH5α (pACYC184) (Cm r , Tc r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
37°C)
Bacillus subtilis (Sm r )
(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
30°C)
Bacillus subtilis 1E7 (pE194 cop6) (Em r , Sm r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
30°C)
Bacillus megaterium
(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
30°C)
Pseudomonas fluorescens
(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
24°C)
Serratia marcescens
(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
30°C)
Streptomyces aureofaciens
(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Tetracyclin
bzw. in GYM-Medium, 30°C)
Streptomyces griseus subsp. griseus
(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Streptomycin
bzw. in GYM-Medium, 30°C)
Streptomyces rimosus
(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Oxytetracyclin
bzw. in GYM-Medium, 30°C)
Streptomyces venezuelae
(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Chloramphenicol
bzw. in GYM-Medium, 30°C)
Micrococcus luteus oder M. flavus
(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,
30°C)

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1.0 l 2xYT-Medium: 16.0 g Bacto-Trypton
10.0 g Yeast extract
10.0 g NaCl
1.0 l H 2 O
10 l YT-Agarplatten: 8 g Bacto-Trypton
5.0 g Yeast extract
5.0 g NaCl
15.0 g Agar
1.0 l H 2 O
8 x 200 ml 0.75 % YT-Weichagar
1.0 l GYM-Medium: 10.0 g Maltose
4.0 g Yeast extract
2.0 g CaCO 3
pH 7.2
H 2 O ad 992 ml
nach dem Autoklavieren 8 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben.
2.0 l GYM-Agarplatten: GYM-Medium mit 15.0 g Agar pro 1.0 l.
500 ml Vorzuchtmedium für Streptomyces rimosus:
für 1.0 l: 7.0 g CaCO 3
16.0 g Corn steep
40.0 g Dextrin
2.0 g (NH 4 ) 2 SO 4
1.4 ml D/L-Milchsäure
pH 7.1-7.2 mit NaOH
H 2 O ad 1.0 l
1.0 l Produktionsmedium für Streptomyces rimosus:
70.0 g Maltose
9.0 g Corn steep
6.0 g CaCO 3
3.5 g (NH 4 ) 2 SO 4
3.0 g NH 4 Cl
1.0 g MgSO 4 x 7 H 2 O
0.1 g MnSO 4 x H 2 O
5 mg CoCl 2 x 6 H 2 O
H 2 O ad 1.0 l.

31
Antibiotika-Stammlösungen (je 10 ml, bei Oxytetracyclin 1 ml):
Penicillin G (Na-Salz) (10 mg/ml; 100 mg/ml in H 2 O)
Ampicillin (1 mg/ml; 10 mg/ml; 100 mg/ml in H 2 O)
Kanamycin (1 mg/ml; 10 mg/ml in H 2 O)
Streptomycin (1 mg/ml; 10 mg/ml in H 2 O)
Tetracyclin
(1 mg/ml; 10 mg/ml in 50 % Ethanol)
Chloramphenicol (1 mg/ml; 10 mg/ml in Ethanol)
Erythromycin
(1 mg/ml; 10 mg/ml in Ethanol)
Oxytetracyclin
(0.1 mg/ml; 1 mg/ml in Methanol/HCl pH2)

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Zeitplan:
Montag, 03.12.2007
Induktion und Katabolitrepression (S. 5): Versuchsdurchführung.
Wachstumstest (S. 10): Herstellung der Versuchsansätze.
Kreuzfütterungstest (S. 11): Herstellung der Versuchsansätze.
Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (24h-Wert).
Diauxie (S. 3): Kultur von E. coli B leu3 in CM mit Glycerin ansetzen.
Alkoholische Gärung (S. 8, 9): ÜN-Kulturen der Saccharomyces cerevisiae-Stämme in YNB
ansetzen.
Dienstag, 04.12.2007
Diauxie (S. 3): Versuchsdurchführung.
Alkoholische Gärung (S. 8, 9): Versuchsdurchführung.
Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (48h-Wert).
Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): ÜN-Kulturen der Testkeime ansetzen.
Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): ÜN-Kulturen der
Stämme in 2xYT ansetzen.
Regulation von Expression und Aktivität der Glutamin-Synthetase (S. 15): ÜN-Kulturen
der Teststämme in LB-Medium ansetzen.

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Mittwoch, 05.12.2007
Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (72h-Wert).
Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): Herstellung der Testansätze.
Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21):
Versuchsdurchführung.
Regulation von Expression und Aktivität der Glutamin-Synthetase (S. 15): Teststämme
in Ggln- und GLBgln-Medium kultivieren, Zellpellets einfrieren.
Donnerstag, 06.12.2007
Regulation von Expression und Aktivität der Glutamin-Synthetase:
- Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht in
Nährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-Angebot (S. 15)
- Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwart von
Inhibitoren (S. 17)
Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (96h-Wert).
Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): Auswertung.
Freitag, 07.12.2007
Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Auswertung.
Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): Auswertung.
Wachstumstest (S. 10): Auswertung.
Kreuzfütterungstest (S. 11): Auswertung.
Kolloquium