F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

2Diauxie, KatabolitrepressionEscherichia coli kann neben Glucose auch andere Zucker wie z.B. Lactose als KohlenstoffundEnergiequelle nutzen. Der erste Schritt beim Lactoseabbau ist die Hydrolyse von Lactosezu Galactose und Glucose durch das Enzym β-Galactosidase. Die Expression der β-Galactosidase wird durch Lactose induziert. Enthält das Wachstumsmedium aber gleichzeitigGlucose und Lactose, so verwerten die Bakterien zunächst nur die Glucose. Erst wenn dieGlucose verbraucht ist, erfolgt die Adaptation an die noch vorhandene C-Quelle Lactose, dadie Anwesenheit von Glucose im Wachstumsmedium die Expression der β-Galactosidasereprimiert. Man bezeichnet diesen Effekt als "Katabolitrepression". Die Umstellung desStoffwechsels vom Glucoseabbau zum Lactoseabbau schlägt sich in einer vorübergehendenVerlangsamung der bakteriellen Zellvermehrung nieder, so dass die Bakterienkultur inGegenwart von Glucose und Lactose zwei exponentielle Wachstumsphasen durchläuft. Manbezeichnet dies als "Diauxie" (zweiphasiges Wachstum).In Enterobakterien wird die Katabolitrepression durch das Regulatorprotein CAP (auch alsCrp bezeichnet) vermittelt. Unter Katabolitrepression stehende Gene enthalten in ihrerPromotorregion eine Bindestelle für einen Komplex aus CAP und dem Coaktivator cyclo-AMP (cAMP). Erst durch die Bindung von CAP-cAMP an den Promotor wird dieTranskription der entsprechenden Gene aktiviert. Demzufolge wird die Expression KatabolitreprimierterGene durch die Konzentration von cAMP in der Zelle gesteuert. DieAnwesenheit von Glucose im Wachstumsmedium beeinflusst den cAMP-Spiegel in der Zelleüber das Phosphotransferase (PTS)-System zur Aufnahme von Kohlenhydraten, das sich ausden Proteinen EI und HPr und den Zucker-spezifischen EII-Komponenten zusammensetzt.PTS-System:PEPEIHPrEIIAEIIBEIICPyruvat P GlucosePGlucose-6-PIst im Medium Glucose vorhanden, wird diese über EII glc aufgenommen, so dass EIIA glcvorrangig unphosphoryliert vorliegt. Ist keine Glucose vorhanden, überwiegt dagegen diephosphorylierte Form von EIIA glc . EIIA glc -P stimuliert die Aktivität des EnzymsAdenylatcyclase, was zur Erhöhung des cAMP-Spiegels und schließlich zur Ausbildung desCAP-cAMP Komplexes führt. Ein weiterer Effekt, der zur Katabolitrepression beiträgt, ist die„inducer-exclusion“: Unphosphoryliertes EIIA glc hemmt die Aktivität von nicht-PTS Zucker-Permeasen und unterdrückt somit die Aufnahme von Inducer-Molekülen die zur Aktivierungzusätzlicher kataboler Stoffwechselwege erforderlich wären.

3Aufgabe:Untersuchung des Wachstumsverhaltens von E. coli in Gegenwart verschiedenerKohlenstoffquellen (Glucose, Glucose/Lactose, Glucose/Galactose, Glucose/Sorbit).Versuchsdurchführung:- 6 ml einer Übernacht(ÜN)-Kultur von E. coli B leu3 in CM-Minimalmedium mit 0.45 %Glycerin werden in ein Zentrifugenröhrchen (Plastik) überführt und 5 min in derTischzentrifuge zentrifugiert.- Das Zellsediment wird 2x mit jeweils 6 ml Saline gewaschen und schließlich in 3 ml Salineresuspendiert.- 2 Erlenmeyerkolben mit Seitenansatz (Klettkolben) werden mit je 20 ml CM ohne C-Quellegefüllt. Anschließend wird Glucoselösung (0.04 g/ml), Lactoselösung (0.2 g/ml),Galactoselösung (0.2 g/ml) bzw. Sorbitlösung (0.2 g/ml) zugegeben, wie in folgendemPipettierschema angegeben:Kolben A: Kolben B:Gruppe 1 und 2: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung50 µl Lactoselösung-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Gruppe 3 und 4: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung50 µl Galactoselösung-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Gruppe 5 und 6: 200 µl Glucoselösung 200 µl Glucoselösung50 µl Sorbitlösung- Zuletzt jeweils 1.0 ml der gewaschenen Bakteriensuspension zugeben.- Zelldichte der Kulturen sofort nach Zugabe der Bakterien mit Hilfe des Klett-Photometersbestimmen (als Leerwert: CM ohne C-Quelle).- Klettkolben im Wasserbadschüttler bei 37°C inkubieren und dann alle 30 min die Zelldichtemit dem Klett-Photometer bestimmen (für ca. 5 Stunden).- Auswertung: Die ermittelten Werte für die Zelldichte (Klett-Einheiten) sind in Abhängigkeitvon der Zeit aufzutragen (mm-Papier). Bei welchen Kulturen ist Diauxie feststellbar?

6-Zur Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität werden folgende Ansätze hergestellt:900 µl 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4+ 100 µl ONPG (5 mg/ml)+ 100 µl Zell-Lysat(Die Zell-Lysate werden erst zugegeben, wenn alle Ansätze Phosphatpuffer und ONPGenthalten).- Die Testansätze werden 15 min bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Dann wird dieEnzymreaktion durch Zugabe von 40 µl Na 2 CO 3 -Lösung (10 %ig) gestoppt.- Die Extinktion der Proben wird bei 420 nm in Halbmikroküvetten bestimmt.Herstellung des Leerwerts:1 ml 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4+ 100 µl ONPG (5 mg/ml)+ 40 µl Na 2 CO 3 -Lösung (10 %ig).Auswertung:Die Extinktionswerte der einzelnen Testansätze sind in die nachfolgende Tabelle einzutragen.Um welche Mutationen kann es sich bei den Stämmen E. coli W575 bzw. E. coli 1783handeln?Zeit E. coli B leu3 E. coli W575 E. coli 1783I II III I II III I II III--------------------------------------------------------------------------------------------------------------0 min--------------------------------------------------------------------------------------------------------------45 min--------------------------------------------------------------------------------------------------------------90 min--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

7Alkoholische Gärung bei Saccharomyces cerevisiaeFakultativ anaerobe Organismen können ihren Energiebedarf durch aerobe Atmung bzw. inAbwesenheit von Sauerstoff durch anaerobe Atmung oder Gärung decken. Unter aerobenBedingungen wird Glucose vollständig zu CO 2 und H 2 O abgebaut, wobei durchSubstratkettenphosphorylierung und oxidative Phosphorylierung insgesamt 36 Mol ATP proMol Glucose entstehen. Das beim Glucoseabbau zu NADH + H + reduzierte NAD + wird dabeiin der Atmungskette wieder vollständig regeneriert. Auch bei der anaeroben Atmung, bei deroxidierte anorganische Verbindungen wie NO - 3 , SO 2- 4 oder Fe 3+ als terminale Elektronenakzeptorengenutzt werden, wird NAD + durch Einspeisen von Elektronen in die Atmungsketteaus NADH + H + regeneriert.Bei der Gärung werden die bei der Oxidation organischer Substrate anfallenden Elektronenauf organische Akzeptoren übertragen. Gärungsreaktionen dienen somit der Regeneration vonNAD + , das zur Aufrechterhaltung der Glycolyse erforderlich ist, die bei der Gärung denalleinigen energiegewinnenden Prozess darstellt. Der Energiegewinn bei der Gärung istfolglich sehr gering, so dass Gärungsreaktionen nur dann ablaufen, wenn keine geeignetenanorganischen terminalen Elektronenakzeptoren vorhanden sind. Gärungsreaktionen laufenauch ab, wenn Enzyme der Atmungskette fehlen (z.B. in Hefe-"petite"-Mutanten) oder durchDrogen blockiert sind. Bei vielen Bakterien wird das in der Glycolyse entstandene NADH +H + dazu verwendet, deren Endprodukt, Pyruvat, zu Lactat zu reduzieren (Milchsäuregärung),wobei wieder NAD + entsteht. Hefen, wie die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae,decarboxylieren das Pyruvat zunächst und reduzieren das dabei entstehende Acetaldehyddann mit Hilfe von NADH + H + zu Ethanol (alkoholische Gärung). Sowohl bei derMilchsäuregärung als auch bei der alkoholischen Gärung wird soviel NADH + H + verbraucht,wie zuvor in der Glycolyse produziert wurde.Um Lactat oder Ethanol weiter abbauen zu können, wird NAD + benötigt, das nur von derAtmungskette geliefert werden kann. Fakultativ anaerobe Organismen, die unter anaerobenBedingungen Lactat oder Ethanol akkumulieren, können diese Substanzen folglich nur unteraeroben Bedingungen unter Energiegewinn weiterverwerten.Auch Glycerin kann nur unter aeroben Bedingungen als Energiequelle genutzt werden, dennbeim Umbau von 1 Mol Glycerin zu Pyruvat müssten 2 Mol NAD + zu NADH + H + reduziertwerden, bei der anschließenden Gärungsreaktion mit Lactat oder Ethanol als Endproduktkönnte aber nur 1 Mol NAD + regeneriert werden.Wird in Hefezellen das bei der alkoholischen Gärung anfallende Acetaldehyd durchHydrogensulfit oder Semicarbazid aus dem Prozess gezogen, so wird das in der Glycolyseentstehende NADH + H + hauptsächlich dazu verwendet, um Dihydroxyaceton-3-phosphat zu3-Phosphoglycerin zu reduzieren, das dann mit Hilfe der Phosphoglycerinkinase unter ATP-Bildung in Glycerin umgewandelt wird. NAD + und NADH + H + sind dabei in einemKreislauf. Dieser Prozess wird auch angewendet, um Glycerin industriell herzustellen.

8Aufgabe:Untersuchung der Fähigkeit von normalen (ρ + ) bzw. atmungsdefekten (ρ - )Saccharomyces cerevisiae-Zellen, unter aeroben bzw. anaeroben Bedingungen Glucosezu Ethanol zu vergären.Versuchsdurchführung:- 4 100 ml-Erlenmeyerkolben werden mit je 20 ml YNB-Minimalmedium gefüllt.- Jeweils 2 Kolben werden mit einer Impföse voll normaler (ρ + ) bzw. atmungsdefekter (ρ - )Saccharomyces cerevisiae-Zellen beimpft.- Je ein Kolben mit ρ + Zellen und ρ - Zellen wird bei 30°C mindestens 15 h geschüttelt (aerobeKultur). Das Medium in den beiden anderen Kolben wird mit jeweils 20 ml sterilemParaffinöl überschichtet. Diese beiden Kolben werden dann ohne Schütteln >15 h bei 30°C imBrutschrank inkubiert (anaerobe Kultur).-Anschließend wird die in den 4 Kulturen gebildete Menge Ethanol mit Hilfe des optischenTests gemessen. Hierzu werden von jeder Kultur 1 ml Zellsuspension in der Tischzentrifuge 1min abzentrifugiert. Je 0.1 ml des zellfreien Überstands werden mit 0.9 ml H 2 O verdünnt.Optischer Test:Die Reduktion von Acetaldehyd mit NADH + H + in der Alkoholdehydrogenasereaktion zuEthanol kann auch rückwärts verlaufen. Entfernt man das gebildete Acetaldehyd mit Hilfevon Semicarbazid als Semicarbazon aus dem Reaktionsgleichgewicht, so wird der Alkoholquantitativ umgesetzt und dabei eine äquivalente Menge NADH + H + aus NAD + gebildet.NADH hat im Gegensatz zu NAD + ein Extinktionsmaximum bei einer Wellenlänge von 340nm. Die gebildete Menge an NADH kann daher photometrisch bestimmt werden.- In 9 Plastikküvetten werden jeweils 2.9 ml Semicarbazid/NAD + -Lösung gemischt mit:1) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ + Kultur (aerob).2) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ - Kultur (aerob).3) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ + Kultur (anaerob).4) 100 µl 10-fach verd. Überstand der ρ - Kultur (anaerob).5) 100 µl H 2 O (Leerwert).6) 99 µl H 2 O + 1 µl 1% (v/v) Ethanol.7) 98 µl H 2 O + 2 µl 1% (v/v) Ethanol.8) 95 µl H 2 O + 5 µl 1% (v/v) Ethanol.9) 90 µl H 2 O + 10 µl 1% (v/v) Ethanol.- Alle Ansätze werden mit jeweils 25 µl Alkoholdehydrogenase (10 mg/ml in H 2 O; 200-400U/mg) versetzt (sorgfältig mischen) und 1 h bei 30°C inkubiert.- Danach wird die Extinktion der Proben bei 340 nm gegen Semicarbazid/NAD + -Lösunggemessen.

9Auswertung:Aus den Meßwerten der Ansätze 5) bis 9) ist eine Eichkurve zu zeichnen. Mit Hilfe dieserEichkurve und den Meßwerten der Ansätze 1) bis 4) ist die Menge Alkohol in g/l zuberechnen, die die Hefezellen unter den verschiedenen Kulturbedingungen produziert haben.Dichte von Ethanol = 0.78 g/ml.Aufgabe:Untersuchung der Fähigkeit von normalen und atmungsdefekten Saccharomycescerevisiae-Zellen, Glycerin unter aeroben Bedingungen als Energiequelle nutzen zukönnen.Die beiden Teststämme von S. cerevisiae (ρ + bzw. ρ - ) werden auf eine YEPD-Platte (enthältDextrose = Glucose) und eine YEPG-Platte (enthält Glycerin) ausgestrichen.Die Agarplatten werden ÜN bei 30°C inkubiert.Das Wachstum der beiden Hefestämme auf den Platten ist zu protokollieren.

10Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropherMutantenWildstämme von Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae wachsen in einemgepufferten Mineralsalzmedium, das Glucose als einzige organische Verbindung enthält, dieals C- und Energiequelle benutzt wird. Auxotrophe Mutanten (Mangelmutanten) benötigendagegen zusätzlich einen oder mehrere organische Stoffe (z.B. bestimmte Aminosäuren), diesie nicht mehr selbst synthetisieren können, weil durch eine Mutation ein Enzym defekt istoder ganz fehlt. Diese Mangelmutanten wachsen jedoch je nach der Lage des genetischenBlocks nicht nur bei Zugabe des Endprodukts der unterbrochenen Biosynthesekette zumNährmedium, sondern auch mit Zwischenprodukten, nämlich mit solchen, deren Syntheseaufbauend auf dem Produkt erfolgt, dessen Synthese durch die Mutation verhindert wird.Befindet sich der genetische Block in einer verzweigten Biosynthesekette, so benötigenauxotrophe Mutanten unter Umständen mehrere Stoffe zum Wachstum (Polyauxotrophie).Aus der Art und Zahl der wachstumswirksamen Substanzen lassen sich Rückschlüsse auf dieLage des genetischen Blocks ziehen.Auxotrophe Mutanten akkumulieren oftmals das Zwischenprodukt der Biosynthesekette, daswegen des genetischen Blocks nicht mehr weiterverarbeitet werden kann. In vielen Fällenermöglicht das akkumulierte Produkt anderen Mutanten, die ihren genetischen Block an einerfrüheren Stelle in der gleichen Biosynthesekette haben, das Wachstum ("Kreuzfütterung").Aufgabe:Bei drei Tryptophan-Mangelmutanten von Saccharomyces cerevisiae ist die Lage desgenetischen Blocks in der Tryptophan-Biosynthesekette durch einenKreuzfütterungstest zu bestimmen.Versuchsdurchführung:- Jeweils 100 ml YEPD-Medium werden mit einer der drei Trp-Mangelmutanten von S.cerevisiae (HK51, HK78, HK145) angeimpft und über Nacht bei 30°C geschüttelt.- Jede Gruppe pipettiert von den 3 Kulturen jeweils 5 ml in je ein Zentrifugenröhrchen(Plastik).- Die Hefezellen werden abzentrifugiert (3 min), 2x mit je 5 ml Saline gewaschen undschließlich in 4 ml Saline suspendiert.- Jeweils 3 ml der Zellsuspensionen werden zusammen mit 15 ml geschmolzenem YNB-Minimalmedium-Agar (40-45°C) in sterile Petrischalen gegossen. In eine vierte Petrischalewerden 18 ml YNB-Minimalmedium-Agar ohne Zellen gegossen (Negativkontrolle). Durchleichtes Bewegen der Petrischalen wird der Agar gleichmäßig verteilt.- Die restlichen 1 ml Zellsuspension werden mit 5 ml Saline verdünnt. Ca. 50 μl der dreiverdünnten Zellsuspensionen werden nach dem Erstarren des Agars auf jeder Agaroberflächemit einer 1 ml-Glaspipette zickzackförmig ausgestrichen. Die Platten werden anschließendbei 30°C inkubiert.

11- Nach 4 Tagen Inkubation wird das Wachstum der ausgestrichenen Stämme auf denAgarplatten überprüft. Akkumulierte Anthranilsäure ist bei UV-Bestrahlung der Agarplattendurch ihre blaue Fluoreszenz zu erkennen.Auswertung:Tragen Sie das Ergebnis des Kreuzfütterungstests in die nachfolgende Tabelle ein und gebenSie die Lage des genetischen Blocks bei den Mutanten an.Agar mit MutanteWachstum der ausgestrichenen MangelmutantenHK 51 HK 78 HK 145-----------------------------------------------------------------------------------------------------HK51HK78HK145HK51:HK78:A ----> B ----> C ----> TryptophanA ----> B ----> C ----> TryptophanHK145: A ----> B ----> C ----> TryptophanAufgabe:Lokalisierung des genetischen Blocks im Biosyntheseweg der aromatischenAminosäuren bei verschiedenen auxotrophen Mutanten von Saccharomyces cerevisiaedurch einen Wachstumstest.Verwendete Mutanten von S. cerevisiae:HK1 (Wildtyp), HK11, HK51, HK78, HK99, HK145, KP171-1.Jede Gruppe untersucht eine Mutante.Der Wachstumstest wird in supplementiertem Minimalmedium durchgeführt. AlsWuchsstoffe werden verwendet: Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, p-Aminobenzoesäure,Indol, Anthranilsäure und Shikimisäure. Chorisminsäure und Prephensäure stehen nicht zurVerfügung. Die Konzentration der ausgegebenen Stammlösungen beträgt 1 mg/ml, bei p-Aminobenzoesäure 0.1 mg/ml.Überlegen Sie sich anhand des untenstehenden Schemas der Biosynthese aromatischerAminosäuren, welche Wuchsstoffe bzw. welche Wuchsstoffkombinationen verwendet werdenmüssen, um den genetischen Block der jeweiligen S. cerevisiae-Mutante zu lokalisieren.(Einschließlich einer Negativkontrolle ohne Wuchsstoff ergeben sich 10 Testmöglichkeiten.)

13Assimilation von Stickstoff: Regulation von Expression und Aktivitätder Glutamin-Synthetase von Escherichia coliDie meisten Mikroorganismen assimilieren Stickstoff durch Einbau von NH 3 in α-Ketoglutarat und Glutaminsäure. Ist NH 3 in hohen Konzentrationen (> 1 mM) verfügbar, wirdα-Ketoglutarat durch die Glutamat-Dehydrogenase unter Verbrauch von NAD(P)H + H +direkt zu Glutaminsäure umgesetzt.(I)GlutamatdehydrogenaseNH Glutaminsäure + NAD(P) + 3 + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H ++Unter Stickstoff-Mangelbedingungen werden durch die Glutamin-Synthetase unter ATP-Verbrauch NH 3 und Glutaminsäure zu Glutamin umgesetzt. Bei der durch die Glutamin-2-oxoglutarat-aminotransferase (GOGAT) katalysierten Reaktion von Glutamin und α-Ketoglutarat entsteht dann unter Verbrauch von NAD(P)H + H + Glutaminsäure.(II)NH 3 + Glutaminsäure + ATPGlutamin-SynthetaseGlutamin + ADP + P iGOGAT(III) Glutamin + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H + 2 Glutaminsäure + NAD(P) +Glutaminsäure und Glutamin sind wichtige Vorstufen zur Biosynthese von Aminosäuren undNucleotiden. Die Glutamin-Synthetase als Schlüsselenzym für ihre Synthese unterliegtvielfältigen Regulationsmechanismen, sowohl hinsichtlich ihrer Expression als auch derEnzymaktivität.Die Transkription des glnA-Gens, das die Glutamin-Synthetase codiert, wird durch dasNtrB/NtrC Zweikomponenten-System in Abhängigkeit vom Glutamin- und α-Ketoglutarat-Spiegel in der Zelle reguliert. Der phosphorylierte Response-Regulator NtrC~P wirkt dabeials Transkriptionsaktivator für glnA. Der Phosphorylierungszustand von NtrC wird durch diebifunktionelle Kinase/Phosphatase NtrB kontrolliert. Die Aktivität von NtrB wird wiederumdurch ein weiteres Protein, PII (GlnB), reguliert. Unter Stickstoff-Mangelbedingungen wirdPII durch das UTase/UR-Enzym (GlnD) reversibel an einem Tyrosin-Rest uridyliert, währendin Gegenwart hoher Glutamin-Konzentrationen vom selben Enzym der UMP-Rest wieder vonPII abgespalten wird. Das UTase/UR-Enzym sellt somit den eigentlichen Sensor für dasVerhältnis von Glutamin und α-Ketoglutarat in der Zelle dar. Das unmodifizierte PIIinteragiert mit NtrB, was die Inhibition der Autokinase-Aktivität von NtrB bei gleichzeitigerStimulierung der Phosphatase-Aktivität von NtrB gegenüber NtrC~P bewirkt. Folglich liegtNtrC bei Stickstoff-Überschuß in der unphosphorylierten Form vor und die Transkription vonglnA unterbleibt. PII-UMP interagiert nicht mit NtrB. Demzufolge überwiegt bei Stickstoff-Mangel die Autokinase-Aktivität von NtrB, was zur Phosphorylierung von NtrC und zurTranskription von glnA führt.

14Die Enzymaktivität der Glutamin-Synthetase wird durch Adenylierung, katalysiert durch dasbifunktionelle Enzym ATase, moduliert. Die Aktivität der ATase wird wiederum über PIIkontrolliert. Durch Adenylierung, die in Gegenwart hoher Konzentrationen von Glutaminerfolgt, wenn PII unmodifiziert vorliegt, wird die Glutamin-Synthetase inhibiert. PII-UMPbindet dagegen an die ATase und stimuliert die Deadenylierung der Glutamin-Synthetase,wodurch diese aktiviert wird. Außerdem wird die Aktivität der Glutamin-Synthetase durchkumulative Feedback-Hemmung durch verschiedene Endprodukte des Glutamin- undGlutamatstoffwechsels (Tryptophan, Histidin, CTP, AMP, Glucosamin-6-phosphat,Carbamylphosphat, außerdem Glycin und Alanin) reguliert.GlnATPPPiATasGS-AMPGSPPiPII-UMPH 2 OATasGlnUTPUTasePIIURGlnUMPADPGlnPiATPNtrBNtrC~PH 2 ONtrBADPNtrB~PNtrCPiSignaltransduktionssysteme zur Regulation der Glutamin-Synthetase aus E. coli

15Aufgabe:Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht inNährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-AngebotVerwendete E. coli-Stämme:E. coli YMC10, E. coli RB9060 (ΔglnB), E. coli YMC26 (ΔglnD), E. coli NCM1850(ntrC::Tn5)Versuchsdurchführung:- 50 ml Kulturen mit Ggln bzw. GLBgln-Medium werden mit Übernacht-Kulturen der E. coliStämme YMC10, RB9060,YMC26 bzw. NCM1850 zu einer Start-OD 600 von ca. 0.08 – 0.1beimpft und unter Schütteln bei 37°C inkubiert bis eine OD 600 von ca. 0.5 erreicht ist. ProKultur werden zwei 2 ml-Aliquots in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und dieBakteriensuspensionen werden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 5 secschockgekühlt. Die Bakterien werden durch Zentrifugation sedimentiert (1 min, 12000 rpm),der Überstand wird verworfen. Die Zellpellets werden sofort in flüssigem Stickstoffeingefroren.Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glutamin-Synthetase (GS)Der Test beruht auf der Fähigkeit der Glutamin-Synthetase, statt NH 3 auch NH 2 OHumzusetzen. In der Umkehrung der eigentlichen Reaktion wird Glutamin quantitativ in N-Glutamylhydroxamsäure überführt.O NH 2CCH 2+ NH 2 OH+ CH 2H 3 N CHCOO -O NHOHGlutamin-CSynthetaseCH 2+ NH 3ADP, AsO 2- 4 , Mn 2+ + CH 2H 3 N CHCOODer Test ist sehr einfach, kann im Rohextrakt angewendet werden und zeigt die Aktivität desEnzyms genau an.Das entstehende N-Glutarhydroxamat gibt zusammen mit Fe(III)-Salzen einen stark gefärbtenKomplex. Seine Konzentration kann bei 546 nm photometrisch bestimmt werden.- Die Zellpellets werden auf Eis aufgetaut und in 1 ml eiskalter Waschlösung (1% KCl)resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (1 min, 12000 rpm) werden die Zellen in 1 mlPermeabilisierungslösung (1% KCl, 0.1 mg/ml CTAB) resuspendiert. Die Proben, dieidentische Zellsuspensionen enthalten (siehe oben) werden nun vereinigt und dieZellsuspensionen werden für 3 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden durch erneuteZentrifugation geerntet und in 1 ml Reaktionsmix resuspendiert. Zwei mal 450 μl derSuspension werden für den enzymatischen Test verwendet und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, der Rest dient zur Bestimmung der Proteinkonzentration im Zell-Lysat.

16- GS-Enzymtest:Die Eppendorf-Gefäße, die 450 μl der Zellsuspensionen enthalten, werden 5 min bei 37°Cvorinkubiert. Die Transferase-Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösunggestartet. Nach 10- bzw. 30-minütiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch dieZugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt. Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000rpm) und die optische Dichte des Überstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatzohne Zellsuspension) gemessen. Die Konzentration an γ-Glutamylhydroxamat in den Probenwird mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes bestimmt:P(λ) = P 0 (λ)e -ε(λ)cxP: Strahlungsleistungλ: Wellenlängeε: Extinktionskoeffizientc: Konzentrationx: KüvettendickeAm Photometer wird die dekadische Extinktion -log(P/P 0 ) bestimmt. Der dekadischeExtinktionskoeffizient des Komplexes aus Fe(III) und N-Glutarhydroxamat (ε 546 ) beträgt 436cm 2 /mmol. Die Dicke der Küvette beträgt 1 cm. Daraus ergibt sich:c (mmol/cm 3 ) = - log(P/P 0 ) / ε 546Die Glutaminsynthetase-Aktivität wird in nmol γ-Glutamylhydroxamat min -1 (mg Protein) -1angegeben.-Bestimmung der Proteinkonzentration der Zell-Lysate:Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe des „Bio-Rad Protein Assay“ ermittelt, der daraufberuht, dass sich das Absorptionsmaximun einer sauren Lösung von Coomassie Brilliant BlueG-250 von 465 nm nach 595 nm verschiebt, wenn die Substanz an Protein bildet. ZurErstellung einer Eichgeraden werden 1, 2, 4, 6, 8 und 10 μl einer BSA-Lösung (1μg/μl) zu je800 μl Wasser gegeben, das in 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße vorgelegt wurde.Anschließend werden die Ansätze mit 200 μl „Bio-Rad Protein Assay“-Lösung versetzt undgemischt. Nach fünf Minuten wird die OD 595 der Ansätze gegen einen Leerwert (800 μl dH 2 O, 200 μl Bio-Rad Assay-Lösung) bestimmt. Von den Zell-Lysaten werden jeweils 10 und20 μl entsprechend vermessen. Die Proteinkonzentration wird in mg/ml angegeben.

17Aufgabe:Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwartvon InhibitorenVersuchsdurchführung:In diesem Experiment wird gereinigte Glutamin-Synthetase aus E. coli verwendet. Der GS-Enzymtest wird im wesentlichen durchgeführt wie oben beschrieben. Dazu wird folgenderAnsatz in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert und 5 min bei 37°Cvorinkubiert:450 μl Reaktionsmix20 μl Glutamin-Synthetase-Lösung (1.7 μg/μl)50 μl dH 2 O bzw. Inhibitor-LösungAls Inhibitoren werden verwendet: Glycin (Stocklösung: 300 mM)Alanin (Stocklösung: 300 mM)CTP (Stocklösung: 100 mM)Glycin + CTP (1:1 Gemisch aus 600 mM Glycin und200 mM CTP)Die Transferase-Reaktion wird wiederum durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösunggestartet. Nach 10 min wird die Reaktion durch die Zugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt.Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000 rpm) und die optische Dichte desÜberstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatz ohne Enzym) gemessen.Die Glutaminsynthetase-Aktivität für die einzelnen Ansätze wird bestimmt und in nmol γ-Glutamylhydroxamat min -1 (mg Protein) -1 angegeben.

18AntibiotikaAntibiotika sind chemische Substanzen, die von bestimmten pro- oder eukaryontischenMikroorganismen produziert und sezerniert werden und die andere Mikroorganismen abtötenoder in ihrem Wachstum inhibieren. Sie werden deshalb in der Medizin zur Bekämpfungbakterieller Infektionskrankheiten eingesetzt, einige auch zur Bekämpfung vonPilzerkrankungen.Heute sind über 8000 antibiotisch wirksame Substanzen bekannt. Die meisten kommerziellverwendeten Antibiotika werden von filamentösen Pilzen (Penicillium, Cephalosporium) undvon Bakterien der Actinomycetengruppe (v.a. Streptomyceten) sowie Bazillen gebildet.Antibiotikum Produzierender Mikroorganismus---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Bacitracin Bacillus subtilisCephalosporin Cephalosporium sp.Chloramphenicol Streptomyces venezuelae (heute chem. Synthese)Cycloheximid Streptomyces griseusCycloserin S. orchidaceusErythromycin S. erythreusGriseofulvin Penicillium griseofulvinKanamycin S. kanamyceticusLincomycin S. lincolnensisNeomycin S. fradiaeNystatinS. nourseiPenicillinPenicillium chrysogenumPolymyxin B Bacillus polymyxaStreptomycin S. griseusTetracycline S. aureofaciens, S. rimosusDie Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber verschiedenen Antibiotika istunterschiedlich. Gewöhnlich sind Gram-positive Bakterien sensitiver gegenüber Antibiotikaals Gram-negative Bakterien. Antibiotika, die sowohl auf Gram-positive, als auch auf GramnegativeBakterien wirken, werden als "Breitband-Antibiotika" bezeichnet.Einige natürlich vorkommende Antibiotika können durch chemische Modifikationeneffektiver gemacht werden. Die so hergestellten semisynthetischen Antibiotika besitzen oftein erweitertes Wirkungsspektrum.

19Wirkungsweise verschiedener Antibiotika:Angriffsort im Mikroorganismus Beispiel---------------------------------------------------------------------------------------------------------------1) Bakterielle Zellwand (Murein) - Penicilline (z.B. Penicillin G, Ampicillin)- Cephalosporine (z.B. Cephamycin)2) Proteinsynthese(a) bei Prokaryonten(b) bei Eukaryonten- Aminoglycoside (z.B. Streptomycin,Kanamycin, Gentamycin, Neomycin)- Tetracycline- Fusidinsäure- Chloramphenicol- Makrolidantibiotika (z.B. Erythromycin)- Lincomycin- Puromycin- Cycloheximid3) Zytoplasmamembran(a) bei Prokaryonten - Polymyxine (z.B. Polymyxin B)- Gramicidin A- Gramicidin S(b) bei Eukaryonten- Polyene (z.B. Nystatin)4) Nukleinsäuresynthese(a) bei Prokaryonten(b) bei Pro- und Eukaryonten- Nalidixinsäure (inhibiert DNA-Synthese)- Rifamycine (z.B. Rifamycin B, Rifampicin;inhibieren RNA-Synthese)- Actinomycin D (inhibiert RNA-Synthese)Klassifizierung von Antibiotika aufgrund ihrer chemischen Struktur:1. Kohlenhydrat-haltige Antibiotika:Reine Zucker (Nojrimycin)Aminoglycoside (Streptomycin)Orthosomycine (Everninomicin)N-Glycoside (Streptothricin)C-Glycoside (Vancomycin)Glycolipide (Moenomycin)2. Makrocyclische Lactone:Makrolid-Antibiotika (Erythromycin)Polyene (Candicidin)Ansamycine (Rifamycin)Makrotetrolide (Tetranactin)

203. Chinone und Chinonderivate:Tetracycline (Tetracyclin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin)Anthracycline (Adriamycin)Naphthochinone (Actinorhodin)Benzochinone (Mitomycin)4. Aminosäure- und Peptidantibiotika:Aminosäurederivate (Cycloserin)β-Lactam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine)Peptidantibiotika (Bacitracin)Chromopeptide (Actinomycin D)Depsipeptide (Valinomycin)Chelatbildende Peptide (Bleomycine)5. Heterocyclische, N-haltige Antibiotika:Nucleosid-Antibiotika (Polyoxine)6. Heterocyclische, O-haltige Antibiotika:Polyether-Antibiotika (Monensin)7. Alizyklische Derivate:Cycloalkanderivate (Cycloheximid)Steroid-Antibiotika (Fusidinsäure)8. Aromatische Antibiotika:Benzenderivate (Chloramphenicol)Kondensierte aromatische Antibiotika (Griseofulvin)Aromatische Äther (Novobiocin)9. Aliphatische Antibiotika:Phosphor-haltige Verbindungen (Fosfomycine)Resistenz von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika:Die Resistenz von Mikroorganismen gegenüber bestimmten Antibiotika kann verschiedeneUrsachen haben:1. Dem Mikroorganismus fehlt die Struktur, an der das Antibiotikum angreift. Beisp.:Mycoplasmen besitzen keine Zellwand und sind daher resistent gegenüber Penicillinen.2. Der Mikroorganismus ist impermeabel für das Antibiotikum. Beisp.: Resistenz vonPseudomonas aeruginosa gegenüber Penicillinen.3. Der Mikroorganismus inaktiviert das Antibiotikum (enzymatischer Abbau oder chemischeModifikation). Beisp.: Spaltung von Penicillinen durch β-Lactamase; Acetylierung vonChloramphenicol durch Chloramphenicol-Acetyltransferase (Cat-Protein); Inaktivierung vonStreptomycin oder Kanamycin durch Phosphorylierung.4. Das Ziel des Antibiotikums in der Zelle ist verändert und dadurch für das Antibiotikumunzugänglich. Beisp.: Resistenz gegenüber Rifamycin durch Veränderung der β-Untereinheitder RNA-Polymerase; Resistenz gegenüber Erythromycin durch Veränderung der 50S-Untereinheit der Ribosomen.

215. Das Antibiotikum wird durch ein spezifisches Efflux-System aus der Zelle transportiert.6. Der Reaktionsweg, in den ein Antibiotikum eingreift, kann verändert sein.Häufig ist die Resistenz von Bakterien gegenüber bestimmten Antibiotika aufextrachromosomalen Plasmiden, den sog. R-Faktoren, genetisch determiniert. Solcheplasmidkodierten Resistenzen sind z.B. gegenüber Antibiotika wie Chloramphenicol,Erythromycin, Gentamycin, Kanamycin, Penicillinen und Tetracyclinen gefunden worden.Viele R-Faktoren enthalten auch mehrere Resistenzgene.R-Faktoren können durch Konjugation nicht nur auf Bakterien der gleichen Art, sondern auchauf andere Bakterien übertragen werden. Eine besondere Gefahr liegt z.B. darin, dass R-Faktoren von E. coli auch auf pathogene Enterobakterien wie Shigella dysenteriae (Erregerder Ruhr) oder Salmonella typhimurium (verursacht Gastroenteritis) übertragen werdenkönnen. Vor allem durch den starken Einsatz von Antibiotika in der Medizin und als Zusatzvon Futtermitteln sind R-Faktor-tragende Bakterien stark angereichert worden und stellenheute ein beachtliches medizinisches Problem dar. Eine zurückhaltende Anwendung derAntibiotika ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt die einzige Möglichkeit, um eine Verringerungder resistenten Keime zu erreichen, da keine therapeutischen Methoden verfügbar sind, um R-Faktoren zu eliminieren.Aufgabe:Untersuchung der Resistenz von R-Faktor-tragenden E. coli- und B. subtilis-Stämmengegenüber verschiedenen Antibiotika.Bakterienstämme: E. coli K-12E. coli W945 (R1drd16)E. coli K-12 (R1drd19)E. coli EndoI (R64)E. coli DH5α (pACYC184)B. subtilisB. subtilis 1E7 (pE194 cop6)Versuchsdurchführung:Jeweils 0.1 ml ÜN-Kultur von den 7 Stämmen werden auf YT-Agarplatten ausplattiert (4Platten pro Stamm). Anschließend werden Papierplättchen auf die Agarplatten gelegt, diezuvor mit 5 µg, 10 µg, 50 µg bzw. 100 µg verschiedener Antibiotika getränkt wurden (beiPenicillin G 50 µg, 100 µg, 500 µg bzw. 1000 µg).

22Zum Tränken der Papierplättchen werden folgende Antibiotikalösungen verwendet:Penicillin G (Pn) (10 mg/ml bzw. 100 mg/ml in H 2 O)Ampicillin (Ap) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H 2 O)Kanamycin (Km) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H 2 O)Streptomycin (Sm) (1 mg/ml bzw. 10 mg/ml in H 2 O)Tetracyclin (Tc)(1mg/ml bzw. 10 mg/ml in 50% Ethanol)Chloramphenicol (Cm) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in Ethanol)Erythromycin (Em) (1mg/ml bzw. 10 mg/ml in Ethanol)Die Agarplatten mit den aufgelegten Papierplättchen werden 2-3 Stunden im Kühlschrankstehen gelassen, damit die Antibiotika in den Agar diffundieren können. Danach werden diePlatten ÜN bei 37°C inkubiert. Bakterien, die gegenüber einem Antibiotikum sensitiv sind,werden abgetötet, so dass sich im Zellrasen klare Zonen um das entsprechende Plättchenbilden.Auswertung:Das Resistenzmuster der versch. E. coli- und B. subtilis-Stämme ist zu bestimmen und in diefolgende Tabelle einzutragen.(R = resistent; S+, S++ und S+++ = schwach, mittel und stark sensitiv)Pn Ap Km Sm Tc Cm Em---------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli K-12---------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli W945 (R1drd16)---------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli K-12 (R1drd19)---------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli EndoI (R64)---------------------------------------------------------------------------------------------------------------E. coli DH5α (pACYC184)---------------------------------------------------------------------------------------------------------------B. subtilis---------------------------------------------------------------------------------------------------------------B. subtilis 1E7 (pE194 cop6)

23Untersuchung der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens (Tetracyclin),Streptomyces griseus (Streptomycin), Streptomyces venezuelae (Chloramphenicol) undStreptomyces rimosus (Oxytetracyclin)Die wichtigste Stoffwechselleistung der Streptomyceten ist ihre Fähigkeit, chemisch sehrunterschiedliche antibiotisch wirkende Substanzen zu synthetisieren. Etwa 80% dertherapeutisch eingesetzten Antibiotika werden aus Streptomyceten isoliert.Aufgabe:Biologischer Nachweis der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens,Streptomyces griseus und Streptomyces venezuelae.Streptomyceten-Stämme:Testkeime:Streptomyces aureofaciensStreptomyces griseus subsp. griseusStreptomyces venezuelaeE. coli K-12 (in 2xYT, 37°C)Bacillus megaterium (in 2xYT, 30°C)Bacillus subtilis (in 2xYT, 30°C)Pseudomonas fluorescens (in 2xYT, 24°C)Serratia marcescens (in 2xYT, 30°C)(1) Agarstrichtest:Die Streptomycetenstämme werden jeweils in der Form eines dicken Impfstrichs in der Mittevon GYM-Agarplatten ausgestrichen (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Platten werden ca. 4Tage bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die versch. Testkeime senkrecht zumAntibiotika-Produzenten hin ausgestrichen (jeweils 1 Tropfen ÜN-Kultur der Teststämmeausstreichen). Die Platten werden danach 1-2 Tage bei 30°C bebrütet. Mikroorganismen, diesensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) des jeweiligenStreptomycetenstammes sind, können in seiner unmittelbaren Nachbarschaft nicht wachsen.(2) Agarzylindertest:Jeweils 100 µl von stationären Kulturen der Streptomycetenstämme in GYM-Medium werdenauf GYM-Agarplatten ausplattiert (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Agarplatten werden für 2-5 Tage bei 30°C inkubiert. Danach werden aus den Platten Agarzylinder ausgestochen. Diemit den verschiedenen Streptomycetenstämmen bewachsenen Agarzylinder werden in eineleere Petrischale gesetzt (bewachsene Seite nach oben) und mit ca. 20 ml geschmolzenem,0,75 %igem YT-Weichagar (ca. 42°C) umgossen, der zuvor mit einem der oben angegebenenTestkeime angeimpft wurde (0.5 ml ÜN-Kultur des Testkeims pro 20 ml Weichagar). Nachdem Erstarren des Weichagars werden zur Kontrolle Papierplättchen auf die Agarplattengelegt, die mit 50 μg der von dem jeweiligen Streptomyceten produzierten Antibiotikagetränkt wurden (S. aureofaciens: Tetracyclin; S. griseus: Streptomycin; S. venezuelae:Chloramphenicol). Die Petrischalen werden dann ÜN bei 30°C bzw. 37°C (siehe Testkeime)inkubiert. Es bilden sich Hemmzonen um die Agarzylinder bzw. Kontrollplättchen, wenn der

24Testorganismus sensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) derStreptomyceten ist.Aufgabe:Quantitative Bestimmung der Oxytetracyclinproduktion durch Streptomyces rimosus.Versuchsdurchführung:Zwei Impfösen Myzel von S. rimosus RF-107 werden in 5 ml Vorzuchtmedium inokuliert(100 ml-Schikanekolben) und 48 Stunden bei 30°C geschüttelt. Anschließend werden 45 mlProduktionsmedium mit 5 ml Vorkultur beimpft (200 ml-Schikanekolben) und bei 30°Cgeschüttelt. Nach 24, 48, 72 und 96 Stunden werden von der Kultur je 2 µl bzw. 20 µl aufPapierplättchen pipettiert. Die Plättchen werden nach dem Antrocknen jeweils auf eine YT-Agarplatte gelegt, die zuvor mit 3.5 ml geschmolzenem, 0.75 %igem YT-Weichagar + 100 µlÜN-Kultur von Micrococcus luteus oder M. flavus (Oxytetracyclin-sensitive Testkeime)überschichtet wurde. Als Kontrolle werden von einer Oxytetracyclinlösung (0.01 mg/ml bzw.0.1 mg/ml in Methanol/HCl pH 2.0) 0.02 µg, 0.05 µg, 0.1 µg, 0.2 µg, 0.5 µg, 1.0 µg, 1.5 μgund 2 μg auf Filterplättchen pipettiert und ebenfalls auf die Agarplatte gelegt. Nach einerInkubation ÜN bei 30°C wird die produzierte Oxytetracyclinmenge vergleichend mit Hilfeeiner Eichkurve bestimmt.

25Anhang: Stämme, Medien, Chemikalien(mit Mengenangaben für 10 Gruppen)Diauxie, Katabolitrepression:E. coli B leu3 (auf YT-Platte, 37°C)1.0 l CM-Minimalmedium ohne C-Quelle: 0.2 g MgSO 4 x 7 H 2 O2.0 g Zitronensäure (C 6 H 8 O 7 x H 2 O)2.0 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O5.0 g KH 2 PO 42.0 g (NH 4 )H 2 PO 4 (ersatzweise (NH 4 ) 2 HPO 4 )3.4 g KOH1.0 l H 2 Onach dem Autoklavieren 50 mg Leucin(aus einer 10 mg/ml-Stammlösung) zugeben.200 ml CM mit 0.45 % Glycerin (= 195.5 ml CM + 4.5 ml 20 % Glycerin)100 ml Glucoselösung (0.04 g/ml)100 ml Lactoselösung (0.2 g/ml)100 ml Galactoselösung (0.2 g/ml)100 ml Sorbitlösung (0.2 g/ml)500 ml Saline (für 1.0 l: 5.0 g NaCl; 0.12 g MgSO 4 x 7 H 2 O; 1.0 l H 2 O)Enzyminduktion und Katabolitrepression am Beispiel der β-Galactosidase vonEscherichia coli:E. coli B leu3 (auf YT-Platte, 37°C)E. coli W575 ( " " )E. coli 1783 ( " " )2.0 l CM mit 0.45 % Glycerin (= 1.955 l CM + 45 ml 20 % Glycerin)200 ml CM mit 0.2 % Glucose (= 198 ml CM + 2 ml 20 % Glucose)200 ml 20 %ige Glucoselösung (für CM mit 0.2 % Glucose)200 ml 20 %ige Glycerinlösung ( für CM mit 0.45 % Glycerin)

26100 ml 0.1 M Lactose100 ml 0.1 M Glucose100 ml Toluol100 ml Natriumdesoxycholatlösung (1 %ig)200 ml 0.05 M Na/K-Phosphatpuffer pH 7.4 (mit 7 µl β-Mercaptoethanol pro 1.0 l)50 ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) (5 mg/ml)100 ml 10 % NatriumcarbonatAlkoholische Gärung bei Saccharomyces cerevisiae:Saccharomyces cerevisiae DX 2180-13 ρ +Saccharomyces cerevisiae DX 2180-13 ρ -(auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium (30°C))(auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium (30°C))1.0 l YNB-Hefe-Minimalmedium: 6.7 g Yeast nitrogen base (YNB) w/o amino acids5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose)H 2 O ad 100 ml;sterilfiltrieren, bei 4°C lagern;vor Gebrauch 1:10 mit H 2 O verdünnen.HM-Agarplatten:4.0 g Yeast extract10.0 g Maltose15.0 g AgarH 2 O ad 992 mlnach dem Autoklavieren 8.0 ml 50 %igeGlucoselösung zugeben.500 ml steriles Paraffinöl500 ml Semicarbazid/NAD + -Lösung: 75 mM Na-Pyrophosphat (= 9.97 g pro 500 ml)20 mM Glycin (= 0.75 g pro 500 ml)75 mM Semicarbazid-hydrochlorid (= 4.18 gpro 500 ml)7.5 mM β-NAD (Fluka)(= 2.49 g pro 500 ml)(β-NAD erst unmittelbar vor dem Versuchzugeben).10 ml 1 % (v/v) Ethanol p.a.Alkoholdehydrogenase (Fluka): aus Bäckerhefe, NAD/NADH-frei, 200-400 U/mg, kurz vorGebrauch in H 2 O lösen (10 mg/ml).

271.0 l YEPD-Agarplatten: 10.0 g Yeast extract20.0 g Bacto-Pepton15.0 g Agar960 ml H 2 Onach dem Autoklavieren 40 ml 50 %ige Glucoselösungzugeben.1.0 l YEPG-Agarplatten: 10.0 g Yeast extract20.0 g Bacto-Pepton15.0 g Agar975 ml H 2 Onach dem Autoklavieren 25 ml 86 %ige Glycerinlösungzugeben.Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropher Mutanten:Saccharomyces cerevisiae HK 1 (auf HM-Platte bzw. in YEPD-Medium, 30°C)S. cerevisiae HK 11 ( " )S. cerevisiae HK 51 ( " )S. cerevisiae HK 78 ( " )S. cerevisiae HK 99 ( " )S. cerevisiae HK 145 ( " )S. cerevisiae KP 171-1 ( " )1.0 l YEPD-Medium: 10.0 g Yeast extract20.0 g Bacto-Pepton960 ml H 2 Onach dem Autoklavieren 40 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben.1.0 l YNB-Minimalmedium: 6.7 g Yeast nitrogen base (YNB) w/o amino acids5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose)H 2 O ad 100 ml;sterilfiltrieren, bei 4°C lagern;vor Gebrauch 1:10 mit H 2 O verdünnen.1.0 l YNB-Minimalmedium-Agar: (a) 6.7 g YNB w/o amino acids5.0 g D(+)-Glucose (Dextrose)H 2 O ad 100 ml;sterilfiltrieren, bei 4°C lagern;(b) 900 ml H 2 O + 15 g Agar;autoklavieren;Ansätze (a) und (b) mischen.1.0 l Saline (5.0 g NaCl; 0.12 g MgSO 4 x 7 H 2 O; 1.0 l H 2 O)

28Je 100 ml: Tyrosin (1 mg/ml)Phenylalanin ( " )Tryptophan ( " )Indol ( " )Anthranilsäure ( " )Shikimisäure ( " )p-Aminobenzoesäure (0.1 mg/ml)Regulation von Expression und Enzymaktivität der Glutamin-Synthetase vonEscherichia coli:E. coli YMC10 (auf LB-Platte, 37°C)E. coli RB9060 (ΔglnB) (auf LB-Platte, 37°C)E. coli YMC26 (ΔglnD) (auf LB-Platte, 37°C)E. coli NCM1850 (ntrC::Tn5) (auf LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin, 37°C)1.0 l GLBgln: 10 g Bacto Pepton5 g Bacto Yeast Extract10 g NaClH 2 O ad 870 mlnach dem Autoklavieren 20 ml 20% Glucose-Lösung und 100 ml Glutamin-Lösung (20 mg/ml) zugeben.1.0 l Ggln: 10.5 g K 2 HPO 44.5 g KH 2 PO 40.246 g MgSO 4 x 7 H 2 OH 2 O ad 870 mlnach dem Autoklavieren 20 ml 20% Glucose-Lösung und 100 ml Glutamin-Lösung (20 mg/ml) zugeben.1 l Waschlösung: 1% KCl500 ml Permeabilisierungslösung: 1% KCl, 0.1mg/ml CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid)Reaktionsmix:benötigt werden bei Durchführung aller Experimente 15 mlReaktionsmix pro Gruppe2.25 ml 1 M Imidazol, pH 7.00.37 ml 0.8 M Hydroxylamin pH 7*45 μl 0.1 M MnCl 21.5 ml 0.28 M Na-Arsenat0.15 ml 0.04 M Na-ADP9 ml H 2 O* Hydroxylamin bei pH 7 ist instabil, es muß daher unmittelbar vorGebrauch durch Mischen gleicher Volumenteile einer 1.6 M

29Hydroxylammoniumchlorid-Lösung und einer NaOH-Lösunghergestellt werden. Die NaOH-Lösung wird vorher so eingestellt (1.4M), dass der pH-Wert der Mischung etwa 7 beträgt.Stopp-Lösung:Glutamin-Lösung:55 g FeCl 3 x 6 H 2 O20 g Trichloressigsäure21 ml konz. HClH 2 O ad 1 l2.92 g ad 100 ml H 2 O (0.2 M), frisch hergestelltInhibitor-Lösungen: 300 bzw. 600 mM Glycin (10 ml)300 mM Alanin (10 ml)100 bzw. 200 mM CTP (2 ml)Antibiotika:Escherichia coli K12(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,37°C)E. coli W945 (R1drd16) (Km r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,37°C)E. coli K12 (R1drd19) (Cm r , Sm r , Ap r , Km r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,37°C)E. coli EndoI (R64) (Sm r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,37°C)E. coli DH5α (pACYC184) (Cm r , Tc r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,37°C)Bacillus subtilis (Sm r )(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,30°C)Bacillus subtilis 1E7 (pE194 cop6) (Em r , Sm r ) (auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,30°C)Bacillus megaterium(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,30°C)Pseudomonas fluorescens(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,24°C)Serratia marcescens(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,30°C)Streptomyces aureofaciens(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Tetracyclinbzw. in GYM-Medium, 30°C)Streptomyces griseus subsp. griseus(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Streptomycinbzw. in GYM-Medium, 30°C)Streptomyces rimosus(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Oxytetracyclinbzw. in GYM-Medium, 30°C)Streptomyces venezuelae(auf BHI-Platte mit 200 µg/ml Chloramphenicolbzw. in GYM-Medium, 30°C)Micrococcus luteus oder M. flavus(auf YT-Platte bzw. in 2xYT-Medium,30°C)

301.0 l 2xYT-Medium: 16.0 g Bacto-Trypton10.0 g Yeast extract10.0 g NaCl1.0 l H 2 O10 l YT-Agarplatten: 8 g Bacto-Trypton5.0 g Yeast extract5.0 g NaCl15.0 g Agar1.0 l H 2 O8 x 200 ml 0.75 % YT-Weichagar1.0 l GYM-Medium: 10.0 g Maltose4.0 g Yeast extract2.0 g CaCO 3pH 7.2H 2 O ad 992 mlnach dem Autoklavieren 8 ml 50 %ige Glucoselösung zugeben.2.0 l GYM-Agarplatten: GYM-Medium mit 15.0 g Agar pro 1.0 l.500 ml Vorzuchtmedium für Streptomyces rimosus:für 1.0 l: 7.0 g CaCO 316.0 g Corn steep40.0 g Dextrin2.0 g (NH 4 ) 2 SO 41.4 ml D/L-MilchsäurepH 7.1-7.2 mit NaOHH 2 O ad 1.0 l1.0 l Produktionsmedium für Streptomyces rimosus:70.0 g Maltose9.0 g Corn steep6.0 g CaCO 33.5 g (NH 4 ) 2 SO 43.0 g NH 4 Cl1.0 g MgSO 4 x 7 H 2 O0.1 g MnSO 4 x H 2 O5 mg CoCl 2 x 6 H 2 OH 2 O ad 1.0 l.

31Antibiotika-Stammlösungen (je 10 ml, bei Oxytetracyclin 1 ml):Penicillin G (Na-Salz) (10 mg/ml; 100 mg/ml in H 2 O)Ampicillin (1 mg/ml; 10 mg/ml; 100 mg/ml in H 2 O)Kanamycin (1 mg/ml; 10 mg/ml in H 2 O)Streptomycin (1 mg/ml; 10 mg/ml in H 2 O)Tetracyclin(1 mg/ml; 10 mg/ml in 50 % Ethanol)Chloramphenicol (1 mg/ml; 10 mg/ml in Ethanol)Erythromycin(1 mg/ml; 10 mg/ml in Ethanol)Oxytetracyclin(0.1 mg/ml; 1 mg/ml in Methanol/HCl pH2)

32Zeitplan:Montag, 04.12.2006Induktion und Katabolitrepression (S. 5): Versuchsdurchführung.Wachstumstest (S. 10): Herstellung der Versuchsansätze.Kreuzfütterungstest (S. 11): Herstellung der Versuchsansätze.Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (24h-Wert).Diauxie (S. 3): Kultur von E. coli B leu3 in CM mit Glycerin ansetzen.Alkoholische Gärung (S. 8, 9): ÜN-Kulturen der Saccharomyces cerevisiae-Stämme in YNBansetzen.Dienstag, 05.12.2006Diauxie (S. 3): Versuchsdurchführung.Alkoholische Gärung (S. 8, 9): Versuchsdurchführung.Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (48h-Wert).Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): ÜN-Kulturen der Testkeime ansetzen.Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): ÜN-Kulturen derStämme in 2xYT ansetzen.Regulation von Expression und Aktivät der Glutamin-Synthetase (S. 15): ÜN-Kulturender Teststämme in Ggln- und GLBgln- Medium ansetzen.

33Mittwoch, 06.12.2006Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (72h-Wert).Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): Herstellung der Testansätze.Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21):Versuchsdurchführung.Regulation von Expression und Aktivität der Glutamin-Synthetase (S. 15): Teststämmein Ggln- und GLBgln-Medium kultivieren, Zellpellets einfrieren.Donnerstag, 07.12.2006Regulation von Expression und Aktiviät der Glutamin-Synthetase:- Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht inNährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-Angebot (S. 15)- Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwart vonInhibitoren (S. 17)Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Probenentnahme (96h-Wert).Resistenz R-Faktor-tragender E. coli- und B. subtilis-Stämme (S. 21): Auswertung.Freitag, 08.12.2006Oxytetracyclinproduktion (S. 24): Auswertung.Agarstrichtest und Agarzylindertest (S. 23): Auswertung.Wachstumstest (S. 10): Auswertung.Kreuzfütterungstest (S. 11): Auswertung.Kolloquium