F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

23Untersuchung der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens (Tetracyclin),Streptomyces griseus (Streptomycin), Streptomyces venezuelae (Chloramphenicol) undStreptomyces rimosus (Oxytetracyclin)Die wichtigste Stoffwechselleistung der Streptomyceten ist ihre Fähigkeit, chemisch sehrunterschiedliche antibiotisch wirkende Substanzen zu synthetisieren. Etwa 80% dertherapeutisch eingesetzten Antibiotika werden aus Streptomyceten isoliert.Aufgabe:Biologischer Nachweis der Antibiotikaproduktion bei Streptomyces aureofaciens,Streptomyces griseus und Streptomyces venezuelae.Streptomyceten-Stämme:Testkeime:Streptomyces aureofaciensStreptomyces griseus subsp. griseusStreptomyces venezuelaeE. coli K-12 (in 2xYT, 37°C)Bacillus megaterium (in 2xYT, 30°C)Bacillus subtilis (in 2xYT, 30°C)Pseudomonas fluorescens (in 2xYT, 24°C)Serratia marcescens (in 2xYT, 30°C)(1) Agarstrichtest:Die Streptomycetenstämme werden jeweils in der Form eines dicken Impfstrichs in der Mittevon GYM-Agarplatten ausgestrichen (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Platten werden ca. 4Tage bei 30°C inkubiert. Anschließend werden die versch. Testkeime senkrecht zumAntibiotika-Produzenten hin ausgestrichen (jeweils 1 Tropfen ÜN-Kultur der Teststämmeausstreichen). Die Platten werden danach 1-2 Tage bei 30°C bebrütet. Mikroorganismen, diesensitiv gegenüber der (den) antibiotisch wirksamen Substanz(en) des jeweiligenStreptomycetenstammes sind, können in seiner unmittelbaren Nachbarschaft nicht wachsen.(2) Agarzylindertest:Jeweils 100 µl von stationären Kulturen der Streptomycetenstämme in GYM-Medium werdenauf GYM-Agarplatten ausplattiert (je 1 Platte für jede Gruppe). Die Agarplatten werden für 2-5 Tage bei 30°C inkubiert. Danach werden aus den Platten Agarzylinder ausgestochen. Diemit den verschiedenen Streptomycetenstämmen bewachsenen Agarzylinder werden in eineleere Petrischale gesetzt (bewachsene Seite nach oben) und mit ca. 20 ml geschmolzenem,0,75 %igem YT-Weichagar (ca. 42°C) umgossen, der zuvor mit einem der oben angegebenenTestkeime angeimpft wurde (0.5 ml ÜN-Kultur des Testkeims pro 20 ml Weichagar). Nachdem Erstarren des Weichagars werden zur Kontrolle Papierplättchen auf die Agarplattengelegt, die mit 50 μg der von dem jeweiligen Streptomyceten produzierten Antibiotikagetränkt wurden (S. aureofaciens: Tetracyclin; S. griseus: Streptomycin; S. venezuelae:Chloramphenicol). Die Petrischalen werden dann ÜN bei 30°C bzw. 37°C (siehe Testkeime)inkubiert. Es bilden sich Hemmzonen um die Agarzylinder bzw. Kontrollplättchen, wenn der