F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

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16- GS-Enzymtest:Die Eppendorf-Gefäße, die 450 μl der Zellsuspensionen enthalten, werden 5 min bei 37°Cvorinkubiert. Die Transferase-Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösunggestartet. Nach 10- bzw. 30-minütiger Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch dieZugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt. Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000rpm) und die optische Dichte des Überstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatzohne Zellsuspension) gemessen. Die Konzentration an γ-Glutamylhydroxamat in den Probenwird mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes bestimmt:P(λ) = P 0 (λ)e -ε(λ)cxP: Strahlungsleistungλ: Wellenlängeε: Extinktionskoeffizientc: Konzentrationx: KüvettendickeAm Photometer wird die dekadische Extinktion -log(P/P 0 ) bestimmt. Der dekadischeExtinktionskoeffizient des Komplexes aus Fe(III) und N-Glutarhydroxamat (ε 546 ) beträgt 436cm 2 /mmol. Die Dicke der Küvette beträgt 1 cm. Daraus ergibt sich:c (mmol/cm 3 ) = - log(P/P 0 ) / ε 546Die Glutaminsynthetase-Aktivität wird in nmol γ-Glutamylhydroxamat min -1 (mg Protein) -1angegeben.-Bestimmung der Proteinkonzentration der Zell-Lysate:Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe des „Bio-Rad Protein Assay“ ermittelt, der daraufberuht, dass sich das Absorptionsmaximun einer sauren Lösung von Coomassie Brilliant BlueG-250 von 465 nm nach 595 nm verschiebt, wenn die Substanz an Protein bildet. ZurErstellung einer Eichgeraden werden 1, 2, 4, 6, 8 und 10 μl einer BSA-Lösung (1μg/μl) zu je800 μl Wasser gegeben, das in 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße vorgelegt wurde.Anschließend werden die Ansätze mit 200 μl „Bio-Rad Protein Assay“-Lösung versetzt undgemischt. Nach fünf Minuten wird die OD 595 der Ansätze gegen einen Leerwert (800 μl dH 2 O, 200 μl Bio-Rad Assay-Lösung) bestimmt. Von den Zell-Lysaten werden jeweils 10 und20 μl entsprechend vermessen. Die Proteinkonzentration wird in mg/ml angegeben.
17Aufgabe:Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli in Gegenwartvon InhibitorenVersuchsdurchführung:In diesem Experiment wird gereinigte Glutamin-Synthetase aus E. coli verwendet. Der GS-Enzymtest wird im wesentlichen durchgeführt wie oben beschrieben. Dazu wird folgenderAnsatz in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert und 5 min bei 37°Cvorinkubiert:450 μl Reaktionsmix20 μl Glutamin-Synthetase-Lösung (1.7 μg/μl)50 μl dH 2 O bzw. Inhibitor-LösungAls Inhibitoren werden verwendet: Glycin (Stocklösung: 300 mM)Alanin (Stocklösung: 300 mM)CTP (Stocklösung: 100 mM)Glycin + CTP (1:1 Gemisch aus 600 mM Glycin und200 mM CTP)Die Transferase-Reaktion wird wiederum durch Zugabe von 50 μl 0.2 M Glutaminlösunggestartet. Nach 10 min wird die Reaktion durch die Zugabe von 1 ml Stopplösung abgestoppt.Die Ansätze werden zentrifugiert (3 min, 12000 rpm) und die optische Dichte desÜberstandes bei 546 nm gegen eine Leerreaktion (Ansatz ohne Enzym) gemessen.Die Glutaminsynthetase-Aktivität für die einzelnen Ansätze wird bestimmt und in nmol γ-Glutamylhydroxamat min -1 (mg Protein) -1 angegeben.
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