F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

10Untersuchung von Aminosäure-Biosynthesen mit Hilfe auxotropherMutantenWildstämme von Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae wachsen in einemgepufferten Mineralsalzmedium, das Glucose als einzige organische Verbindung enthält, dieals C- und Energiequelle benutzt wird. Auxotrophe Mutanten (Mangelmutanten) benötigendagegen zusätzlich einen oder mehrere organische Stoffe (z.B. bestimmte Aminosäuren), diesie nicht mehr selbst synthetisieren können, weil durch eine Mutation ein Enzym defekt istoder ganz fehlt. Diese Mangelmutanten wachsen jedoch je nach der Lage des genetischenBlocks nicht nur bei Zugabe des Endprodukts der unterbrochenen Biosynthesekette zumNährmedium, sondern auch mit Zwischenprodukten, nämlich mit solchen, deren Syntheseaufbauend auf dem Produkt erfolgt, dessen Synthese durch die Mutation verhindert wird.Befindet sich der genetische Block in einer verzweigten Biosynthesekette, so benötigenauxotrophe Mutanten unter Umständen mehrere Stoffe zum Wachstum (Polyauxotrophie).Aus der Art und Zahl der wachstumswirksamen Substanzen lassen sich Rückschlüsse auf dieLage des genetischen Blocks ziehen.Auxotrophe Mutanten akkumulieren oftmals das Zwischenprodukt der Biosynthesekette, daswegen des genetischen Blocks nicht mehr weiterverarbeitet werden kann. In vielen Fällenermöglicht das akkumulierte Produkt anderen Mutanten, die ihren genetischen Block an einerfrüheren Stelle in der gleichen Biosynthesekette haben, das Wachstum ("Kreuzfütterung").Aufgabe:Bei drei Tryptophan-Mangelmutanten von Saccharomyces cerevisiae ist die Lage desgenetischen Blocks in der Tryptophan-Biosynthesekette durch einenKreuzfütterungstest zu bestimmen.Versuchsdurchführung:- Jeweils 100 ml YEPD-Medium werden mit einer der drei Trp-Mangelmutanten von S.cerevisiae (HK51, HK78, HK145) angeimpft und über Nacht bei 30°C geschüttelt.- Jede Gruppe pipettiert von den 3 Kulturen jeweils 5 ml in je ein Zentrifugenröhrchen(Plastik).- Die Hefezellen werden abzentrifugiert (3 min), 2x mit je 5 ml Saline gewaschen undschließlich in 4 ml Saline suspendiert.- Jeweils 3 ml der Zellsuspensionen werden zusammen mit 15 ml geschmolzenem YNB-Minimalmedium-Agar (40-45°C) in sterile Petrischalen gegossen. In eine vierte Petrischalewerden 18 ml YNB-Minimalmedium-Agar ohne Zellen gegossen (Negativkontrolle). Durchleichtes Bewegen der Petrischalen wird der Agar gleichmäßig verteilt.- Die restlichen 1 ml Zellsuspension werden mit 5 ml Saline verdünnt. Ca. 50 μl der dreiverdünnten Zellsuspensionen werden nach dem Erstarren des Agars auf jeder Agaroberflächemit einer 1 ml-Glaspipette zickzackförmig ausgestrichen. Die Platten werden anschließendbei 30°C inkubiert.