F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

15Aufgabe:Bestimmung der Aktivität der Glutamin-Synthetase von Escherichia coli bei Anzucht inNährmedien mit unterschiedlichem Stickstoff-AngebotVerwendete E. coli-Stämme:E. coli YMC10, E. coli RB9060 (ΔglnB), E. coli YMC26 (ΔglnD), E. coli NCM1850(ntrC::Tn5)Versuchsdurchführung:- 50 ml Kulturen mit Ggln bzw. GLBgln-Medium werden mit Übernacht-Kulturen der E. coliStämme YMC10, RB9060,YMC26 bzw. NCM1850 zu einer Start-OD 600 von ca. 0.08 – 0.1beimpft und unter Schütteln bei 37°C inkubiert bis eine OD 600 von ca. 0.5 erreicht ist. ProKultur werden zwei 2 ml-Aliquots in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und dieBakteriensuspensionen werden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 5 secschockgekühlt. Die Bakterien werden durch Zentrifugation sedimentiert (1 min, 12000 rpm),der Überstand wird verworfen. Die Zellpellets werden sofort in flüssigem Stickstoffeingefroren.Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Glutamin-Synthetase (GS)Der Test beruht auf der Fähigkeit der Glutamin-Synthetase, statt NH 3 auch NH 2 OHumzusetzen. In der Umkehrung der eigentlichen Reaktion wird Glutamin quantitativ in N-Glutamylhydroxamsäure überführt.O NH 2CCH 2+ NH 2 OH+ CH 2H 3 N CHCOO -O NHOHGlutamin-CSynthetaseCH 2+ NH 3ADP, AsO 2- 4 , Mn 2+ + CH 2H 3 N CHCOODer Test ist sehr einfach, kann im Rohextrakt angewendet werden und zeigt die Aktivität desEnzyms genau an.Das entstehende N-Glutarhydroxamat gibt zusammen mit Fe(III)-Salzen einen stark gefärbtenKomplex. Seine Konzentration kann bei 546 nm photometrisch bestimmt werden.- Die Zellpellets werden auf Eis aufgetaut und in 1 ml eiskalter Waschlösung (1% KCl)resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation (1 min, 12000 rpm) werden die Zellen in 1 mlPermeabilisierungslösung (1% KCl, 0.1 mg/ml CTAB) resuspendiert. Die Proben, dieidentische Zellsuspensionen enthalten (siehe oben) werden nun vereinigt und dieZellsuspensionen werden für 3 min auf Eis inkubiert. Die Zellen werden durch erneuteZentrifugation geerntet und in 1 ml Reaktionsmix resuspendiert. Zwei mal 450 μl derSuspension werden für den enzymatischen Test verwendet und in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, der Rest dient zur Bestimmung der Proteinkonzentration im Zell-Lysat.