F1-Praktikum in Mikrobiologie - Universität Würzburg

13Assimilation von Stickstoff: Regulation von Expression und Aktivitätder Glutamin-Synthetase von Escherichia coliDie meisten Mikroorganismen assimilieren Stickstoff durch Einbau von NH 3 in α-Ketoglutarat und Glutaminsäure. Ist NH 3 in hohen Konzentrationen (> 1 mM) verfügbar, wirdα-Ketoglutarat durch die Glutamat-Dehydrogenase unter Verbrauch von NAD(P)H + H +direkt zu Glutaminsäure umgesetzt.(I)GlutamatdehydrogenaseNH Glutaminsäure + NAD(P) + 3 + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H ++Unter Stickstoff-Mangelbedingungen werden durch die Glutamin-Synthetase unter ATP-Verbrauch NH 3 und Glutaminsäure zu Glutamin umgesetzt. Bei der durch die Glutamin-2-oxoglutarat-aminotransferase (GOGAT) katalysierten Reaktion von Glutamin und α-Ketoglutarat entsteht dann unter Verbrauch von NAD(P)H + H + Glutaminsäure.(II)NH 3 + Glutaminsäure + ATPGlutamin-SynthetaseGlutamin + ADP + P iGOGAT(III) Glutamin + α-Ketoglutarat + NAD(P)H + H + 2 Glutaminsäure + NAD(P) +Glutaminsäure und Glutamin sind wichtige Vorstufen zur Biosynthese von Aminosäuren undNucleotiden. Die Glutamin-Synthetase als Schlüsselenzym für ihre Synthese unterliegtvielfältigen Regulationsmechanismen, sowohl hinsichtlich ihrer Expression als auch derEnzymaktivität.Die Transkription des glnA-Gens, das die Glutamin-Synthetase codiert, wird durch dasNtrB/NtrC Zweikomponenten-System in Abhängigkeit vom Glutamin- und α-Ketoglutarat-Spiegel in der Zelle reguliert. Der phosphorylierte Response-Regulator NtrC~P wirkt dabeials Transkriptionsaktivator für glnA. Der Phosphorylierungszustand von NtrC wird durch diebifunktionelle Kinase/Phosphatase NtrB kontrolliert. Die Aktivität von NtrB wird wiederumdurch ein weiteres Protein, PII (GlnB), reguliert. Unter Stickstoff-Mangelbedingungen wirdPII durch das UTase/UR-Enzym (GlnD) reversibel an einem Tyrosin-Rest uridyliert, währendin Gegenwart hoher Glutamin-Konzentrationen vom selben Enzym der UMP-Rest wieder vonPII abgespalten wird. Das UTase/UR-Enzym sellt somit den eigentlichen Sensor für dasVerhältnis von Glutamin und α-Ketoglutarat in der Zelle dar. Das unmodifizierte PIIinteragiert mit NtrB, was die Inhibition der Autokinase-Aktivität von NtrB bei gleichzeitigerStimulierung der Phosphatase-Aktivität von NtrB gegenüber NtrC~P bewirkt. Folglich liegtNtrC bei Stickstoff-Überschuß in der unphosphorylierten Form vor und die Transkription vonglnA unterbleibt. PII-UMP interagiert nicht mit NtrB. Demzufolge überwiegt bei Stickstoff-Mangel die Autokinase-Aktivität von NtrB, was zur Phosphorylierung von NtrC und zurTranskription von glnA führt.