Zentrifugenjournal ROTOR 7-2008 - Beckman Coulter

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Grundlagen Einführung in die Ultrazentrifugation (Teil 3) Nach dem im letzten Rotor erschienen Artikel über Gradientenmaterialien, Arten von Gradienten und ihrer Herstellung, möchten wir in diesem Teil der Einführung die Rotoren für Gradientenzentrifugation sowie deren Vor- und Nachteile vorstellen. Rotoren für die Gradientenzentrifugation Grundsätzlich ist die Verwendung aller Rotorenarten denkbar - und in der Tat können Gradienten in Festwinkel-, Vertical-, „Near- Vertical“- und Ausschwingrotoren zentrifugiert werden. Und reicht deren Fassungsvermögen für die Probenmenge nicht aus, kann ein „Scale-Up“ auf Zonal- und Durchflussrotoren erfolgen. In diesen beiden Rotorentypen kann die Probe während der Zentrifugation zugeführt und entnommen werden. Abhängig vom Experiment sind die Rotoren entweder als Ausschwingrotoren oder als Festwinkelrotoren zu betrachten. Wichtig ist, dass die Qualität der Aufreinigung der Proben durch eine Gradientenzentrifugation von der Art des verwendeten Rotors abhängt. schwingen und dann im Winkel von 90° zur Rotorachse orientiert sind (Abb. 1). Die Zentrifugengefäße sind so immer genau im jeweiligen Beschleunigungsfeld ausgerichtet (also im Stillstand im Schwerefeld und während der Zentrifugation im Zentrifugalfeld). Kräfte wirken immer in Richtung der Röhrchenachse. 1.2 Zonalrotoren Zonalrotoren werden direkt während der Zentrifugation befüllt und geleert. Dies ersetzt im Falle einer Gradientenzentrifugation das Ausschwingen von Buckets, so dass ein Zonalrotor zwar wie ein Festwinkelrotor aussieht, für die Gradientenzentrifugation aber ähnlich wie ein Ausschwingrotor funktioniert. Abb. 3: Querschnitt durch einen Festwinkelrotor Festwinkelrotoren haben gegenüber den Ausschwingrotoren eine geringere Trennstrecke, was in einer verkürzten Trennzeit resultiert. 1.4 Vertical-Rotoren Entwickelt für eine minimale Trennzeit, ist bei diesen Rotoren aufgrund der besonderen Geometrie die Trennstrecke und damit auch die Trennzeit so klein wie möglich. Abb. 4: Querschnitt durch einen Vertical-Rotor Die Bohrungen für die Zentrifugengefäße sind genau parallel ausgerichtet, die Röhrchen stehen also während der Zentrifugation vertikal zum Zentrifugalfeld (Abb. 4). 1.5 „Near-Vertical“-Rotoren „Near-Vertical“-Rotoren sind eigentlich auch Festwinkelrotoren, bei ihnen ist der Winkel zur Rotorachse allerdings deutlich kleiner, er liegt bei 7°-9°. Damit liegen diese Rotoren näher an den Vertical-Rotoren als an den Festwinkelrotoren, daher ihr Name. „Near- Vertical“-Rotoren wurden von Beckman Coulter entwickelt, um die Vorteile der Festwinkelrotoren mit den Vorteilen der Vertical- Rotoren zu verbinden. Sie sind ausschließlich über Beckman Coulter erhältlich. Die Winkel der Zentrifugegefäße ist so ausgelegt, dass sich wie in einem Festwinkelrotor ein Pellet ausbildet, und andererseits die Trennstrecke und damit die Trennzeit ähnlich der von Vertical- Rotoren ist. 1) Verfügbare Rotortypen 1.1 Ausschwingrotoren Bei Ausschwingrotoren befinden sich die Zentrifugengefäße in Schwenkbechern (Buckets), die im Stillstand des Rotors – also vor der Zentrifugation und nach der Abbremsung im Schwerefeld der Erde – nach unten hängen und bei der Zentrifugation aus- Abb. 2: Zonalrotor Ti 15 Abb. 1: Querschnitt durch Ausschwingrotor 4 1.3 Festwinkelrotoren: In Festwinkelrotoren stehen die Zentrifugengefäße in einen festen Winkel zur Rotorachse (Abb. 3). Von Rotor zu Rotor ist der Winkel unterschiedlich – bei Ultrazentrifugenrotoren liegen die Winkel meist im Bereich von 20°-35°. Abbildung 6: Trennstrecken und Pelletpositionen in Ausschwing-, Festwinkel, Vertical- und „Near-Vertical“- Rotoren
Grundlagen 2) Gradientenzentrifugation mit unterschiedlichen Rotortypen 2.1 Ausschwingrotoren und Zonalrotoren Bei Ausschwingrotoren laufen die aufzutrennenden Moleküle, Molekülkomplexe oder Partikel immer entlang der Achse der Abb. 5: Querschnitt durch einen „Near-Vertical“- Rotor Zentrifugengefäße und kommen damit mit diesem nicht in Berührung. Wandeffekte sind hier vernachlässigbar klein. Das Ausrichten der Zentrifugengefäße im Beschleunigungsfeld hat noch einen weiteren Vorteil: es schlägt sich positiv auf die Qualität der Auftrennung nieder, da die Gradienten (s. Artikel in Rotor 6 zur Gradientenbildung) zu dem jeweiligen Beschleunigungsfeld immer gleich orientiert bleiben. Sie sind also nach Ausbildung „stationär“, bewegen sich in dem Zentrifugengefäß also nicht. Eine Verschlechterung der bei der Zentrifugation erreichten Auftrennung durch ein Umorientieren des Gradienten ist hier ausgeschlossen. Auch in punkto Wanderungsstrecke sind Ausschwingrotoren erste Wahl. Denn die ist hier maximal, da die komplette Länge der Zentrifugengefäße durchlaufen wird bzw. werden kann. Dies ist der Grund dafür, dass diese Rotoren für Sedimentationen nur selten genutzt werden, da Zentrifugationsschritte in diesem Rotortyp sehr lange dauern. Dies ist natürlich auch bei Gradientenzentrifugation der Fall. Da durch die lange Trennstrecke aber eine extrem hohe Qualität in der Aufreinigung erreicht werden kann, nehmen viele Anwender die längeren Zentrifugationszeiten gerne in Kauf. Zonalrotoren sehen zwar von außen einem Festwinkelrotor ähnlich, bei der Gradientenzentrifugation ist die Situation aber mit der bei Ausschwingrotoren vergleichbar. Da der Gradient hier eingefüllt und eine Probe entnommen wird während sich der Rotor dreht, findet auch bei diesen Rotoren keine Umorientierung der Gradienten statt. Wandeffekte gibt es hier ebenfalls nicht, solange man die Probe nicht an die Außenwand des Rotors sedimentiert. 2.2 Festwinkel-, Vertical- und „Near-Vertical“-Rotoren Die anderen Rotorentypen, Festwinkel-, Vertical- und „Near-Vertical“-Rotoren, sind attraktiv aufgrund deutlich verkürzter Zentrifugationszeiten und der Möglichkeit der Aufspreizung erreichter Trennergebnisse. Die Reduzierung der Zentrifugationszeiten ist signifikant, sie kann durchaus bei nur 1/3 - 1/6 der bei Ausschwingrotoren benötigten Zeit liegen. Allerdings sind hier Wandeffekte unvermeidlich (s.u.). Umorientierung von Gradienten und Aufspreizung der Trennungen In Rotoren, die keine Schwenkbecher haben oder während der Zentrifugation befüllt und entleert werden, muss sich ein Gradient im Zentrifugengefäß umorientieren. Ein Gradient richtet sich immer zum Beschleunigungsfeld aus und dessen Orientierung zum Zentrifugengefäß ändert sich zwischen Stillstand des Rotors und Zentrifugation. Das Umorientieren der Gradienten während der Zentrifugation sieht möglicherweise auf den ersten Blick wie ein Nachteil aus, kann aber als Vorteil genutzt werden, denn bei der Umorientierung nach Zentrifugation findet eine Spreizung der Auftrennung statt. Banden sind dadurch weiter voneinander entfernt und lassen sich besser getrennt voneinander „ernten“. Wandeffekte Da das Beschleunigungsfeld während der Zentrifugation senkrecht Abb. 8: Umorientieren des Gradienten in Festwinkel-, Vertical- und „Near-Vertical“-Rotoren zum Stillstand des Rotors führt zu einer Spreizung der erreichten Auflösung. Bei Ausschwingrotoren findet keine Umorientierung statt und damit auch keine Spreizung der Auftrennung. zur Zentrifugenachse wirkt und die Wände der Zentrifugengefäße einen anderen Winkel zur Zentrifugenachse haben, werden sedimentierende Teilchen zunächst gegen die Wand des Zentrifugeröhrchens zentrifugiert. Dann „laufen sie entlang der Röhrchenwand hinunter“ - im Idealfall. Tatsächlich wird oft dieser Idealfall nicht vorliegen und ein Teil des nach unten wandernden Materials an der Röhrchenwand kleben bleiben. Für Teilchen, die leichter sind als das Lösungsmittel, gilt das Gegenteil: sie wandern an die innere Röhrchenwand und dann die Wand hinauf. Auch bei ihnen besteht die Gefahr an der Wand hängenzubleiben. Die Wanderung das Röhrchen hinauf machen übrigens nicht nur Teilchen, die leichter sind als das Lösungsmittel, sondern auch Teilchen, die von den nach unten wandernden Teilchen verdrängt werden. Durch diese Wanderung von Teilchen an der jeweiligen Röhrchenwand (außen hinunter und innen hinauf) entsteht eine Bewegung, die natürlich in einer gewissen Vermischung des Gradienten und damit in einer Verschlechterung der Auflösung resultieren kann. Ebenfalls kann ein Teil der Probe an der Wand hängenbleiben und ist damit verloren. Abb. 7: Wandeffekte und resultierende Teilchenbewegungen im Gradienten Aus applikativer Sicht schlimmer als ein möglicher Verlust eines Teils der Probe oder die Vermischung des Gradienten, ist die Gefahr der Kontamination einer Bande, in der das aufzureinigende Material konzentriert wird mit dem Material, das man davon abtrennen wollte. Hier spielt das Material der Zentrifugenröhrchen eine Rolle – man nimmt idealerweise das Material, an dem die Probe am wenigsten anhaftet. Man wird außerdem immer versuchen, den Gradienten so zu gestalten, dass die Lage der Bande nach Zentrifugation nicht in Kontakt mit sedimentiertem oder aufgeschwommenem (flotiertem) Material in Berührung kommt. Bei Festwinkelrotoren liegen die Pellets im unteren Teil auf der äußeren Seite und das flotierte Material auf der Innenseite oben. Anders bei Vertical-Rotoren, dennhier ist das pelletierte Material komplett über die Außenseite verteilt und das flotierte Material überall auf der Innenseite zu finden. Bei diesem Rotortyp ist es deshalb gar nicht möglich, die Banden vor Kontakt mit sedimentiertem oder flotiertem Material zu schützen. Das ist natürlich ein signifikanter Nachteil der Vertical-Rotoren. Lange Zeit nahm man diesen in Kauf, da – und darum wurden die Vertical-Rotoren entwickelt – die Trennungen in Vertical-Rotoren sehr viel schneller stattfinden als in Festwinkelrotoren. 5
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