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60 Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie Zell-autonome Funktionen von c-Jun, c-Fos und FosB bei der Regulation von Zellproliferation und Antwort auf genotoxische Substanzen A. Kolbus, H. Bierbaum In Kollaboration mit Ingrid Herr, Klaus-Michael Debatin, Sven Baumann, Sören Eichhorst, Sabine Kirchhoff, Peter Krammer, DKFZ; Martin Schreiber und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich; Michael Karin, UC San Diego, La Jolla, USA Die Synthese der Fos und Jun Proteine wird nach Behandlung von Zellen mit DNA-schädigenden Substanzen (Strahlung, chemische Karzinogene, z.B. alkylierende Agenzien) stark erhöht [1,3]. Dies lässt darauf schließen, dass diese Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der zellulären Antwort auf solche Stressfaktoren spielen. In Fibroblasten, die aus c-Jun oder c-Fos Knockout-Mäusen etabliert wurden, konnte diese Annahme experimentell bestätigt werden. c-Fos-defiziente Zellen weisen eine Hypersensitivität gegenüber UV Strahlung und chemischen Mutagenen (z.B. Alkylantien) auf. Dieser Effekt scheint jedoch auf Fibroblasten beschränkt zu sein, da verschiedenste Mutagene und physiologische Induktoren von Apoptose in Thymozyten und aktivierten T-Zellen aus Wildtyp und c-Fos-defizienten den programmierten Zelltod mit vergleichbarer Effizienz induzieren [5,6]. Zellen aus c-Jun-defiziente Mäusen verlieren die Fähigkeit, nach Behandlung mit UV Strahlung oder chemischen Mutagenen in Apoptose zu gehen [7]. Die Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutantenzelle beruht auf dem Verlust der Induktion von Fos/Jun-abhängigen Genen, darunter das Gen, das für CD95-L kodiert. CD95-L bindet an das Zelloberflächenantigen CD95 und es kommt nachfolgend zur Aktivierung einer Serie von Caspasen, an deren Ende die DNA Fragmentierung und Zelltod steht. c-Jun spielt daher eine essentielle Rolle bei der Synthese von Apoptose-auslösenden Proteinen (z.B. CD95-L), während die Komponenten des CD95-spezifischen Signalwegs, der zur Auslösung von Apoptose führt, unabhängig von c- Jun exprimiert werden [7]. Neben der „Stress“-induzierten Apoptose in Fibroblasten spielt AP-1-abhängige Induktion von CD95-L auch bei der induzierten Apoptose in aktivierten T-Zellen eine wichtige Rolle, wobei hier FosB als entscheidender Dimerisierungspartner zu fungieren scheint [8]. Funktion von JunB in vivo und in vitro M. Schorpp-Kistner, S. Andrecht, D. Schmidt, B. Hartenstein, J. Hess, N. Keon, S. Gack, M. Sator-Schmitt, T. Raubinger, S. Teurich In Kollaboration mit Norbert Fusenig, DKFZ; Emanuelle Passegue und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien, Österreich Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle Die Ergebnisse unserer bisherigen Arbeiten ergaben deutliche Hinweise darauf, dass die verschiedenen Mitglieder der Jun Proteinfamilie (c-Jun, JunB, JunD) spezifische, zum Teil nicht-überlappende Funktionen in AP-1-abhängigen Prozessen spielen. Diese Annahme wurde durch den spezifischen Phänotyp der JunB knockout Mäuse unterstrichen, der sich deutlich von denjenigen unterscheidet, die durch den Verlust anderer AP-1 Untereinheiten (z.B. c-Jun, JunD, Fos Proteine) hervorgerufen werden [3]. Die junB -/- Embryonen entwickeln sich normal bis zum Tag 7.5 der Embryogenese und sterben dann innerhalb von zwei Tagen auf Grund von Fehlentwicklungen bei der Blutgefäßbildung der extraembryonalen Gewebe (Dottersack, Plazenta), wodurch der notwendige Transport von Nährstoffe von der Mutter zum Embryo nicht im ausreichenden Umfang stattfindet. Um die molekularen Grundlagen für diesen Phänotyp aufzuklären, haben wir verschiedene in vitro Zellkultursysteme mit Zellen aus Wildtyp und mutierten Mäusen etabliert, darunter Fibroblasten, primäre Endothelzellen, die anschließend durch stabile SV40 T-Antigen Expression immortalisiert wurden (Endothelioma), und JunB-defizienten embryonale Stammzellen (ES). Vor allem mit dem in vitro Differenzierungssystem der ES Zellen zu sog. „embryoid bodies“, bei denen die in vivo Defekte bei der Ausbildung von Blutgefäßen nachgeahmt werden konnten, war es möglich VEGF (ein Hauptregulator der Vaskulogenese und Angiogenese) als JunB-abhängiges Zielgen zu identifizieren [9,10]. Es zeigte sich, dass die Expression dieses Gens unter vermindertem Sauerstoffdruck (Hypoxie), dem Hauptstimulus von Angiogenese und Vaskulogenese, in JunBdefizienten ES Zellen, Fibroblasten und Endothelioma fast vollständig aufgehoben ist. Dies beruht darauf, dass JunB direkt an den VEGF Promotor bindet, und zusammen mit dem Transkriptionsfaktor HIF1α für die positive VEGF Expression benötigt wird [9,10]. Neben der physiologischen Funktion von JunB in der Vaskulogenese und Angiogenese haben unsere Arbeiten auch deutliche Hinweise auf eine wichtige Rolle von JunB bei der Tumorangiogenese erbracht. Nach Injektion von ES Zellen und nachfolgender Ausbildung von Teratokarzinomen zeigte es sich, dass Tumore, die sich von JunB-defizienten Zellen ableiten, ein geringeres Tumorvolumen und kaum vaskuläre Strukturen aufwiesen. Dies ging einher mit einer stark reduzierten Expression von VEGF in den Tumorzellen, was die Ursache für das stark verminderte Einwandern von Blutgefäßen in den Tumor sein könnte [9,10]. Obwohl junB -/- Embryonen in der frühen Phase der Embryonalentwicklung sterben, ist es uns gelungen daraus primäre Fibroblasten zu isolieren und durch spontane Immortalisierung permanente Linien zu generieren [11,12]. Diese Zellen wurden für die Aufklärung der Rolle von JunB in der Proliferationskontrolle und Antwort auf Strahlung und Oncoproteine untersucht. JunB greift an zwei Stellen im Zellzyklus regulatorisch ein: zum einen führt das Fehlen von JunB zu einem beschleunigten Übergang der Zellen von der G1 in die S-Phase. Dies beruht auf einer reduzierten Expression des CDK Inhibitors p16 ink einer spontan erhöhten Expression von c-Jun. Im weiteren Verlauf der Zellzyklusprogression kommt es in JunB-defizienten Zellen zu einem verzögerten Übergang von S nach G2/M was mit einer verringerten Expression und Kinaseaktivität von Cyclin A assoziiert ist. Alle Defekte können durch Einbringen eines JunB-ER Expressionsvektors Hormon-abhängig revertiert werden [11,12]. Durch den Nachweis i) der Bindung von JunB in vitro an eine CRE Sequenz im Cyclin A Promotor, ii) der CRE-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Cyclin A Promotors durch Überexpression von JunB (zusammen mit ATF2) und iii) der verringerten AP-1 Bindungsaktivität an das CRE Element in JunB-defizienten Zellen konnten wir erstmals Cyclin A als direktes und positiv reguliertes JunB Zielgen identifizieren [11,12]. Veränderte Expression von Zellzyklusregulatoren (Cyclin D1, Cyclin A, p16) ist auch die Ursache für pathologische Veränderungen bei der Knochenentwicklung und -homöostase in sog. „JunB rescue“ Mäusen, die durch Einkreuzen einer junB transgenen Mauslinie in den junB -/- Hintergrund generiert wurden, wodurch der embryonal letale Phänotyp wieder revertiert werden kann [13,14]. Die adulten Tiere DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Forschungsschwerpunkt A Zell- und Tumorbiologie weisen eine ubiquitäre, jedoch stark verringerte Expression von JunB auf. In vivo sind deutliche Veränderungen in der Anordnung und Differenzierungsgrad der Zellen in der Wachstumszone der Röhrenknochen zu erkennen, was zu einer deutlichen Verringerung der Körperlänge der Mäuse und zur Ausprägung von Osteoporose führt. Auch in in vitro Knochenzellkulturen sind diese Veränderungen der Zellproliferation sichtbar, was JunB als wichtigen Regulator der Knochenzellproliferation und Differenzierung ausweist [14,15]. Die „JunB rescue“ Mäuse wurde auch verwendet, um die kritische Rolle von JunB bei der Differenzierung von T-Helferzellen (Th) zu identifizieren [13]. Hier zeigte sich, dass das Fehlen von JunB die Differenzierung von CD4+ Th Zellen in die Th2 Linie blockiert. Dies beruht auf einer fehlenden transkriptionellen Aktivierung des IL-4 Gens; -einem Schlüsselregulator der Differenzierung von T-Zellen in die Th2 Linie [13]. Um diese in vitro Befunden an isolierten T - Zellen auf ihre in vivo Relevanz zu überprüfen, wurde die Ausprägung einer Th2-abhängigen, experimentell-induzierten allergischen Asthmareaktion in Wildtyp und JunBdefizienten Mäusen bestimmt. Es zeigte sich, dass in den mutierten Mäusen die dafür typischen Symptome (Infiltration von eosinophilen Zellen und Schleimbildung in den Bronchien) in weitaus geringerem Maß ausgeprägt sind, was die Rolle von JunB bei diesem Aspekt der Immunantwort unterstreicht [13]. Mit zunehmendem Alter entwickeln „JunB rescue“ Mäuse einen myeloproliferativen Defekt, der einer chronischen myeloiden Leukämie (CML) beim Menschen ähnelt [3,16]. Der pathologische Phänotyp ist durch eine erhöhte Anzahl von Granulozyten Vorläuferzellen und reifen neutrophilen Granulozyten, die keine JunB Expression aufweisen gekennzeichnet. Diese Daten weisen JunB als kritischer Regulator der Differenzierung von Blutzellen aus und unterstreichen die postulierte Funktion von JunB als Tumorsupressor [3,16]. Trans-regulatorische Funktionen der Jun Proteine in Zellproliferation und Differenzierung A. Szabowski, L. Florin, W. Lips, S. Andrecht, M. Schorpp-Kistner In Kollaboration mit Nicole Maas-Szabowski, Norbert Fusenig, Gunnar Wrobel, Peter Lichter, DKFZ Abteilung A100 Signaltransduction und Wachstumskontrolle Neben der Aufklärung der Zell-autonomen Funktion der Jun Proteine in der Zellzykluskontrolle und bei positiven oder negativen Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren (z.B. TAF7/TAFii55, [17]; Glucocorticoid Rezeptor und NFκB, [18]; Cbfa1, [19]] konnten wir durch Verwendung der junB -/- und c-jun -/- Fibroblasten erstmals den Einfluss von c-Jun und JunB bei der Regulation der Proliferation und Differenzierung in trans identifizieren [20-22]. Unter Verwendung eines Co-Kultursystems mit primären menschlichen Keratinozyten und murinen Fibroblasten in einem 3-dimensionalen organotypischen in vitro Hautmodell haben wir den Beitrag von c-Jun und/oder JunB Zielgenen in Fibroblasten zum Zytokin-abhängigen regulatorischen Wechselspiel zwischen dem dermalen und epidermalen Kompartiment der Haut beschäftigt. Durch Verwendung der genetisch veränderten c-jun -/- und junB -/- Fibroblasten wird die Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten massiv verändert. Dies beruht darauf, dass c-Jun und JunB gegenläufig die Il-1-abhängige Expression von KGF und GM- CSF regulieren. Den direkten Nachweis der kausalen Rolle dieser AP-1-abhängigen Zytokine konnten wir durch Verwendung von neutralisierenden GM-CSF Antikörper erbringen, die die Epithelbildung in Gegenwart von Wildtyp Fibroblasten drastisch reduzierte und den pathologischen Phänotyp der junB -/- Co-Kulturen fast völlig aufhob. In Übereinstimmung mit früheren Vermutungen führt die Verwendung von neutralisierenden Antikörper gegen IL-1 ebenfalls zu einer partiellen Reversion des Phänotyps der junB -/- Fibroblasten organotypischen Kultur und Kulturen, die auf Wildtyp Fibroblasten basieren, zeigen nur noch eine geringe Epithelbildung [20-22]. Diese Daten unterstreichen noch einmal das Modell des doppelt-parakrinen Wirkmechanismus z.B. bei der Wundheilung, wo durch Synthese und Ausschüttung von IL-1 durch Keratinozyten die Produktion von Zytokinen in Fibroblasten (darunter KGF und GM-CSF) gesteuert wird, die dann parakrin wieder auf Keratinozyten wirken und Proliferation und Differenzierung regulieren. Wir haben jetzt begonnen, durch umfassende Genexpressionsanalyse („expression profiling“) von Wildtyp und c-jun -/- bzw. junB -/- Fibroblasten bisher unbekannte Zielgene zu identifizieren, deren Expression c-Jun und JunBabhängig verläuft und durch IL-1 reguliert wird. Wir konzentrieren uns dabei auf sezernierte Proteine (z.B. „stromaderived factor“, SDF), die wir jetzt einer funktionellen Analyse in der 3-dimensionalen organotypischen Co-Kultur unterziehen. Parallel dazu haben wir begonnen ein in vivo Mausmodell zu etablieren, um den Beitrag von Genprodukten aus dem Stroma für die Ausbildung oder Reparatur der Epidermis zu untersuchen. Dazu haben wir transgene Mauslinien hergestellt, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des Kollagen(I)α2 Gens exprimieren. Nach Kreuzung dieser Linie mit einer ROSA26R Reportermaus, die ein induzierbares LacZ Gen trägt, zeigte es sich, dass Cre Aktivität tatsächlich auf Zellen mit mesenchymalem Ursprung (Fibroblasten, Osteoblasten, Zellen im Bindegewebe verschiedener Organe) beschränkt ist [23]. Diese Mäuse werden jetzt mit „floxed c-jun“ und „floxed junB“ Mäusen (die kürzlich in Zusammenarbeit mit dem Labor von Erwin F Wagner etabliert wurden) verpaart, um den spezifischen Beitrag von c-Jun und JunB-abhängigen Genen in vivo zu bestimmen. Wir glauben, dass die weiteren Analysen dieser Mäuse, als auch der Jun-defizienten Fibroblasten (und hier vor allem die junB -/- Fibroblasten) im in vitro 3D Hautmodell neben dem Verständnis der physiologischen Prozesse der Haut (Differenzierung, Wundheilung) auch die Etablierung molekularbiologischer Werkzeuge zur Analyse von pathologischen Veränderungen der Haut (Psoriasis, chronische Entzündungen, verzögerte Wundheilung; Tumorerkrankungen) bringen wird. Klonierung neuerTumor-assoziierter Gene in der Maus J. Hess, R. Müller, B. Dittrich, H. Richter, V. Proft, U. Breitenbach, C. Gebhardt, I. Vogt In Kollaboration mit Gerhard Fürstenberger, Gunnar Wrobel, Jörg Schlingemann, Lars Hummerich, Peter Lichter, DKFZ; Cornelia Mauch, Roswitha Nischt, Universitätsklinik Köln, Peter Steinlein, Institut für Molekulare Pathologie, Wien, Österreich, Babette Heyer, Zena Werb, University of California, San Francisco, USA Sequentielle Behandlung der Maushaut mit TPA führt zur Ausbildung von Papillomen und nachfolgend zum Auftreten von Karzinomen (Mehrstufenmodell der chemisch-induzierten Hautkarzinogenese). In Zellinien, die sich von den verschiedenen Tumorstadien ableiten, wurde eine Korre- 61 DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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