Pflanzenzellen als Produktionssystem zur Gewinnung von ...

Ergebnisse 97
nie-PCR unter Verwendung konstruktspezifischer Primer identifiziert, in Stammkultur
genommen und zur Transformation von Pflanzenzellen eingesetzt.
III.4.2 Transiente und stabile Expression von CD124ex in N. tabacum Petit Havana cv.
SR1
Die Expression des IL-4 Rezeptorsex wurde zunächst in transienten Expressionsstudien an
infiltrierten Tabakblättern überprüft, um routinemäßig die Funktionalität der vier hergestellten
Konstrukte aus III.4.1 zu bestätigen. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob das Protein
überhaupt in nachweisbaren Mengen von den Pflanzenzellen produziert wird, da bekannt war,
daß CD124ex in mikrobiellen Standardexpressionssystemen – wie E. coli und P. pastoris –
nicht bzw. nur mit geringen Ausbeuten an funktionalem Protein hergestellt werden konnte, so
daß die Produktion des Rezeptors in Insektenzellen (Sf-9) in der Regel favorisiert wurde (Dr.
Heiner Apeler, Bayer HealthCare Wuppertal, pers. Mitteilung).
Die Durchführung der Agroinfiltration von Tabakblättern im analytischen Maßstab
erfolgte wie unter II.2.9.3 beschrieben. Nach einer Inkubation von drei Tagen wurden die
Blätter geerntet und durch Mörsern mit zwei Volumen Proteinextraktionspuffer aufge-
schlossen (II.3.1.1). Die löslichen Proteine wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und nach
Transfer auf Nitrocellulosemembran immunologisch detektiert. Der Nachweis des IL-4
Rezeptors wurde durch Inkubation mit rezeptorspezifischen Antikörpern (M-α-CD124) und
mit Antikörpern, die gegen das C-terminale His6-Motiv (M-α-penta His) gerichtet waren,
erreicht. Das Ergebnis der transienten Expressionsversuche mit den Konstrukten
pTRAkc-CD124ex AH und pTRAkc-CD124ex ERH wird in Abb. 28 dargestellt.