Pflanzenzellen als Produktionssystem zur Gewinnung von ...

ii Inhaltsverzeichnis
II.2.7.2 Anzucht von A. tumefaciens und Herstellung von Stammkulturen.......................................36
II.2.8 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien.............................................................................37
II.2.8.1 Herstellung Hitzeschock-kompetenter E. coli.......................................................................37
II.2.8.2 Hitzeschock-Transformation von E. coli ..............................................................................38
II.2.8.3 Herstellung elektrokompetenter A. tumefaciens....................................................................38
II.2.8.4 Elektrotransformation von A. tumefaciens............................................................................38
II.2.9 Kultivierung und Transformation von Pflanzenzellen ....................................................................39
II.2.9.1 Kultivierung von N. tabacum................................................................................................39
II.2.9.1.1 Allgemeine Kultivierungsbedingungen ......................................................................39
II.2.9.1.2 Anzucht steriler Tabakpflanzen ..................................................................................39
II.2.9.2 Anzucht von A. tumefaciens zur Pflanzentransformation .....................................................39
II.2.9.3 Transiente Transformation von Tabakblättern......................................................................40
II.2.9.4 Stabile Kerntransformation von N. tabacum cv. Petit Havana SR1......................................40
II.2.9.5 Plastomtransformation von N. tabaccum cv. Petit Havana...................................................41
II.2.9.6 Stabile Kerntransformation von N. tabacum BY-2 Suspensionszellen.................................43
II.2.9.7 Kultivierung von N. tabacum BY-2 Suspensionszellen........................................................43
II.2.9.8 Fermentation von N. tabacum BY-2 Suspensionszellen.......................................................44
II.3 Biochemische und immunologische Methoden...................................................................................44
II.3.1 Isolierung rekombinanter Proteine aus Pflanzenzellen ...................................................................44
II.3.1.1 Isolierung rekombinanter Proteine aus Tabakblättern ..........................................................45
II.3.1.2 Isolierung rekombinanter Proteine aus BY-2 Suspensionszellen..........................................46
II.3.1.2.1 Isolierung rekombinanter Proteine aus BY-2 Kalli und Schüttelkolbenkulturen........46
II.3.1.2.2 Isolierung von IL-4 DM aus Fermentationsernten......................................................46
II.3.2 Chloroplastenisolierung aus Tabakblättern.....................................................................................47
II.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Coomassie Brilliant Blue Färbung............................47
II.3.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................................................................47
II.3.3.2 Coomassie Brilliant Blue Färbung........................................................................................48
II.3.4 Western-Blot Analysen ...................................................................................................................48
II.3.4.1 Immunologischer Nachweis rekombinanter Proteine ...........................................................48
II.3.4.2 Immunologische Charakterisierung des Glykosylierungsmusters von IL-4 DM..................49
II.3.4.3 Densitometrische Abschätzung der IL-4 DM Konzentration................................................50
II.3.5 Dot-Blot Analysen stabil transformierter Tabakpflanzen und BY-2 Kalli......................................50
II.3.6 Konzentrationsbestimmung von IL-4 DM durch Oberflächenplasmonresonanzmessungen ..........50
II.3.7 Durchflußzytometrische Messungen...............................................................................................51
II.3.8 Reinigung von IL-4 DM .................................................................................................................52
II.3.8.1 Kationenaustauschchromatographie .....................................................................................52
II.3.8.2 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC)............................................53
II.3.8.3 Konzentrierung von Proteinproben über Nanosep Säulen ....................................................54
II.3.8.4 Dialyse von Proteinproben....................................................................................................54
II.3.9 Bestimmung des N- und C-Terminus von IL-4 DM .......................................................................55
II.3.10 Analyse des Glykosylierungsmusters von IL-4 DM .......................................................................55
II.3.11 Messung der Fluoreszenz von DsRed .............................................................................................56
III Ergebnisse ........................................................................................................................ 57
III.1 Herstellung von IL-4 DM Konstrukten zur Expression in pflanzlichen Systemen.........................57
III.1.1 Herstellung von IL-4 DM Konstrukten zur apoplasmatischen und ER-retardierten Expression ....57
III.1.2 Herstellung kodonoptimierter IL-4 DM cDNAs.............................................................................60
III.1.3 Klonierung der kodonoptimierten IL-4 DM cDNAs in Pflanzenexpressionsvektoren ...................66
III.1.3.1 Klonierung in den Pflanzenexpressionsvektor pSPAMks ....................................................66