Pflanzenzellen als Produktionssystem zur Gewinnung von ...

Inhaltsverzeichnis iii
III.1.3.2 Klonierung der IL-4 DM cDNAs in den alternativen Expressionsvektor pTRA.................. 67
III.1.4 Herstellung einer kodonoptimierten IL-4 DM cDNA mit humaner Sekretionssequenz................. 69
III.1.5 Klonierung des di IL-4 DM Konstruktes in pTRA mit alternativem Selektionsmarker ................. 71
III.1.6 Herstellung von IL-4 DM DsRed Tandemkonstrukten................................................................... 72
III.1.7 Herstellung von IL-4 DM Konstrukten zur plastidären Lokalisation ............................................. 74
III.1.7.1 Herstellung des IL-4 DM Konstruktes mit Chloroplastentransitpeptid ................................ 74
III.1.7.2 Herstellung des pPAC-di IL-4 DM Konstruktes zur Plastomtransformation ....................... 75
III.1.8 Transformation der IL-4 DM Pflanzenexpressionsvektoren in A. tumefaciens .............................. 77
III.2 Sekretorische und ER-retardierte Expression von IL-4 DM............................................................ 78
III.2.1 Vakuuminfiltration von Tabakblättern zum Nachweis der IL-4 DM Proteinexpression ................ 78
III.2.2 Herstellung und Analyse stabil transformierter Tabakpflanzen...................................................... 82
III.2.3 Herstellung und Analyse stabil transformierter BY-2 Suspensionszellen ...................................... 85
III.3 Plastidäre Lokalisation und Expression von IL-4 DM in N. tabacum.............................................. 90
III.3.1 Plastidäre Lokalisation von IL-4 DM nach Kerntransformation..................................................... 90
III.3.2 Plastidäre Expression von IL-4 DM nach Plastomtransformation.................................................. 92
III.4 Klonierung und Expression des humanen IL-4 Rezeptors CD124................................................... 95
III.4.1 Herstellung von CD124ex Expressionskonstrukten......................................................................... 95
III.4.2 Transiente und stabile Expression von CD124ex in N. tabacum Petit Havana cv. SR1 .................. 97
III.4.3 Transiente Koexpression von CD124ex und IL-4 DM in N. tabacum cv. Petit Havana SR1........ 100
III.4.4 Stabile Koexpression von CD124ex und IL-4 DM in BY-2 Suspensionszellen ............................ 104
III.5 Entwicklung eines Nachweissystems zur Quantifizierung von IL-4 DM in Pflanzenextrakten... 105
III.6 Vergleichende Expression der verschiedenen IL-4 DM Konstrukte.............................................. 108
III.7 Produktion von IL-4 DM in pflanzlichen Systemen und Reinigung .............................................. 112
III.7.1 Proteinextraktionspuffer zur Isolierung von IL-4 DM aus Blattmaterial...................................... 112
III.7.2 Produktion von IL-4 DM in transient infiltrierten Tabakblättern ................................................. 114
III.7.3 Reinigung von IL-4 DM aus Proteinextrakt infiltrierter Tabakblätter .......................................... 115
III.7.3.1 Kationenaustauschchromatographie ................................................................................... 115
III.7.3.2 Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) ......................................... 118
III.7.4 Produktion von IL-4 DM in BY-2 Schüttelkolbenkulturen .......................................................... 120
III.7.5 Reinigung von IL-4 DM aus BY-2 Schüttelkolbenkulturen ......................................................... 122
III.7.6 Produktion von IL-4 DM in Bioreaktoren .................................................................................... 125
III.7.7 Reinigung von IL-4 DM aus dem Fermentationsüberstand von BY-2 Suspensionszellen ........... 126
III.8 Überprüfung der Funktionalität von IL-4 DM in durchflußzytometrischen Messungen ............ 131
III.9 Biochemische Charakterisierung der Struktur von pflanzlich produzierten IL-4 DM................ 134
III.9.1 Bestimmung der Sequenz des N-und C-Terminus von IL-4 DM ................................................. 134
III.9.2 Analyse der Glykosylierung von IL-4 DM über Lektine und Nachweisantikörper...................... 135
III.9.3 Massenspektroskopische Analyse der Glykosylierungsmuster von IL-4 DM .............................. 137
IV Diskussion .......................................................................................................................141
IV.1 Ansätze zur Optimierung der Expression von IL-4 DM in pflanzlichen Systemen...................... 141
IV.1.1 Kodonoptimierung........................................................................................................................ 141
IV.1.2 Subzelluläre Lokalisation ............................................................................................................. 142
IV.1.3 Plastidäre Lokalisation von IL-4 DM und Plastomtransformation ............................................... 145
IV.1.4 Koexpression von IL-4 DM und IL-4 Rezeptor (CD124)............................................................. 148
IV.1.5 Produktion und Reinigung von IL-4 DM in Tabakblättern und Suspensionskulturen.................. 149
IV.2 Nachweis der Funktionalität von IL-4 DM....................................................................................... 155
IV.3 Biochemische Charakterisierung des pflanzlichen IL-4 DM .......................................................... 156
IV.4 Bewertung der pflanzlichen Expressionssysteme zur Produktion von IL-4 DM .......................... 158
IV.5 Ausblick ............................................................................................................................................... 161