Fermentative Produktion von L-Phenylalanin m i t Escherichia coli
Fermentative Produktion von L-Phenylalanin m i t Escherichia coli
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1. L-<strong>Phenylalanin</strong>-<strong>Produktion</strong> mit E. <strong>coli</strong> Stämmen mit unterschiedlichen<br />
Glucoseaufnahmesystemen<br />
Stämme mit unterschiedlichen Glucoseaufnahmesystemen sollten zur L-<strong>Phenylalanin</strong>-<br />
<strong>Produktion</strong> eingesetzt, stoffwechselphysiologisch charakterisiert und schließlich der beste<br />
Produzent identifiziert werden. Die zur Verfügung stehenden Stämme waren L-Tyrosinauxotroph<br />
und enthielten Deregulierungen im Aromatenbiosyntheseweg. Enzyme aus dem<br />
Aromatenbiosyntheseweg wurden plasmidkodiert überexprimiert. Die Glucoseaufnahme<br />
erfolgte entweder über das Glucose-spezifische Phosphotransferase-System oder über<br />
ein heterologes System. Bei letzterem wurde die Glucose über den Glucose-Facilitator<br />
aus Zymomonas mobilis aufgenommen und durch eine Glucokinase phosphoryliert. Im<br />
Gegensatz zur Glucoseaufnahme über das Phosphotransferase-System wird dabei kein<br />
Phosphoenolpyruvat verbraucht. Eine verbesserte Bereitstellung dieses Vorläufermetaboliten<br />
sollte zu einer höheren L-<strong>Phenylalanin</strong>-<strong>Produktion</strong> führen.<br />
Die Kapazität der Glucoseaufnahme der Zellen mit heterologem Glucoseaufnahmesystem<br />
war sowohl für das Wachstum als auch die <strong>Produktion</strong> der Stämme essenziell. Daher<br />
sollte der Einfluss der Glucosekonzentration sowie der Einfluss der Induktion auf die <strong>Produktion</strong><br />
untersucht werden. Da die Glucoseaffinität der beiden Glucoseaufnahmesysteme<br />
unterschiedlich ist (Phosphotransferase-System: Km=3–10 µmol/l [Postma u. a. 1993];<br />
Glucose-Facilitator: Km=4,1 mmol/l [Weisser 1996]) war es möglich, dass der Einfluss<br />
der Glucosekonzentration bei beiden Systemen unterschiedlich war. Durch intensive<br />
Prozessanalytik sollte das Verständnis der ablaufenden Stoffwechselvorgänge verbessert<br />
werden. Der beste L-<strong>Phenylalanin</strong>-Produzent sollte für die weiteren Arbeiten zur Prozessverbesserung<br />
verwendet werden.<br />
2. Einfluss <strong>von</strong> Prozessparametern und Identifizierung einer Limitierung oder<br />
Inhibierung der L-<strong>Phenylalanin</strong>-<strong>Produktion</strong><br />
In Vitro-Experimenten zufolge war die Enzymaktivität der L-Tyrosin-sensitiven DAHP-<br />
Synthase (AroF), dem Eingangsenzym der Aromatenbiosynthese, bei einer Temperatur<br />
<strong>von</strong> 33 o C höher als bei 37 o C [Jossek 2000]. Dagegen ist das Wachstum <strong>von</strong> E. <strong>coli</strong> bei<br />
einer Temperatur <strong>von</strong> 37 ◦ C optimal. Bei niedrigerer Temperatur laufen chemische und<br />
enzymatische Reaktionen in der Zelle langsamer ab. Der pH-Wert beeinflusst ebenfalls<br />
die Reaktionsraten verschiedenster Reaktionen und Enzyme [Ingraham und Marr 1996].<br />
Unter Verwendung des besten L-<strong>Phenylalanin</strong>-Produzenten sollte daher der Einfluss<br />
der Prozessparameter Temperatur und pH-Wert auf den Fermentationsprozess und die<br />
L-<strong>Phenylalanin</strong>-<strong>Produktion</strong> untersucht werden.<br />
In der Arbeit <strong>von</strong> Gerigk wurde deutlich, dass die Produktbildung während des Prozesses<br />
nach 30-40 Stunden abnahm und in einigen Experimenten sogar abbrach [Gerigk 2001]. Als<br />
Ursache war eine Inhibierung der <strong>Produktion</strong> durch hohe L-<strong>Phenylalanin</strong>-Konzentrationen<br />
anzunehmen, aber auch eine Inhibierung oder Limitierung durch Mediumkomponenten<br />
oder eine Kombination mehrerer Einflussgrößen war möglich. Um die Einflüsse genauer<br />
zu untersuchen, sollten sowohl Untersuchungen zum Einfluss <strong>von</strong> Mediumbestandteilen als<br />
auch zum Einfluss hoher L-<strong>Phenylalanin</strong>-Konzentrationen auf die <strong>Produktion</strong> durchgeführt<br />
werden.<br />
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