Fermentative Produktion von L-Phenylalanin m i t Escherichia coli

3.1 Biologische Grundlagen
Über den oxidativen Pentosephosphatweg werden Hexosephosphate und Pentosephosphate
ineinander umgewandelt. Reduktionsäquivalente (NADPH) und Pentosen für die
Biosynthese, wie das für die Nucleotidsynthese wichtige Ribose-5-Phosphat werden gebildet.
Zudem entsteht Erythrose-4-Phosphat, das für die Synthese aromatischer Metabolite
verwendet wird.
Unter anaeroben Bedingungen ist kein Sauerstoff als Elektronenakzeptor vorhanden.
E. coli gewinnt unter diesen Bedingungen Energie durch gemischte Säuregärung. Die
Spaltprodukte der Glucose dienen dabei zugleich als Elektronendonatoren und -akzeptoren.
Aus Pyruvat werden Lactat und Formiat gebildet. Formiat wird zu Kohlendioxid und
Wasserstoff umgewandelt. Acetyl-CoA wird zu Acetat und Ethanol metabolisiert. Bei
der Bildung von Acetat entsteht ATP. Aus Phosphoenolpyruvat wird Succinat gebildet
[Boeck und Sawers 1996]. Pro mol Glucose werden nur 1–4 mol ATP gebildet. Um
ausreichend Energie zu gewinnen, muss daher mehr Substrat umgesetzt werden als bei
aerobem Stoffwechsel [Schlegel 1992].
Auch unter aeroben Bedingungen und dabei hohen Glucosekonzentrationen kann Acetat
gebildet werden. Die aerobe Acetatbildung wird als Glucose-Überschussstoffwechsel
oder bakterieller Crabtree-Effekt bezeichnet. Abbauprodukte aus der Glycolyse akkumulieren.
Acetyl-CoA wird über Acetyl-Phosphat zu Acetat umgesetzt. Der Überschussstoffwechsel
kann auch als Ungleichgewicht zwischen Substrataufnahme und dem Bedarf
der Zelle für Biosynthese und Energieproduktion beschrieben werden [Holms 1996].
Durch die Acetatbildung wird Energie gewonnen. Pro mol Acetat wird ein mol ATP
gebildet [Ko u. a. 1993]. Damit könnte der Zelle eine zusätzliche Möglichkeit zur ATP-
Gewinnung zur Verfügung stehen, wenn die respiratorische Kapazität der Zelle erschöpft
ist [Andersen und von Meyenburg 1980]. Die aerobe Acetatproduktion inhibiert jedoch
Wachstum und Proteinproduktion [Luli und Strohl 1990], [Shimizu u. a. 1988]. Eine Reduzierung
der Acetatbildung kann durch genetische Veränderungen der Zellen erreicht werden.
So wurde bei Zellen mit inaktivem PT-System keine Acetatproduktion beobachtet,
jedoch war die Wachstumsrate gleichzeitig um 50 % reduziert [Ponce u. a. 1998]. Daneben
kann eine Reduzierung der aeroben Acetatbildung durch die Erhöhung der anaplerotischen
Flüsse erreicht werden [Farmer und Liao 1997].
Aromatenbiosynthese
Die aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan werden über
den Aromatenbiosyntheseweg gebildet, der in Abb. 3.4 dargestellt ist. Phosphoenolpyruvat
(PEP) aus der Glycolyse und Erythrose-4-Phosphat (E4P) aus dem Pentosephosphatweg
werden in der Eingangsreaktion des Aromatenbiosyntheseweges durch drei Isoenzyme
der 3-Desoxy-D-Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat-Synthase (DAHP-Synthase) zu DAHP
kondensiert. Daraus entsteht über Shikimat und mehrere Zwischenschritte unter Einbau
eines zweiten PEP-Moleküls Chorismat. Aus Chorismat wird über Anthranilat in mehreren
Schritten L-Tryptophan gebildet. L-Tyrosin und L-Phenylalanin werden über Prephenat
und Phenylpyruvat, bzw. 4-Hydroxyphenylpyruvat aus Chorismat gebildet. Neben
den aromatischen Aminosäuren werden Ausgangsmetabolite für die Synthese von para-
Aminobenzoesäure, Folsäure, Menachinon und weiterer Metabolite gebildet [Pittard 1996].
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