peqGOLD HP Total RNA Kit - PEQLAB Biotechnologie GmbH

PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE
Eukaryotische Zellen und Gewebe
Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:
! Chloroform
! 100 % Ethanol
! 70 % Ethanol in sterilem DEPC-dH 2O
! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen
1. Homogenisierung und Lyse
a. a. a. Gewebe Gewebe
Gewebe
50 - 100 mg Gewebe werden mit je 1 ml peqGOLD TriFast homogenisiert. Um eine
gute Lyse zu erreichen, sollte ein Glas-, ein Teflon- oder ein elektrischer Homogenisator
verwendet werden. Das Probenvolumen sollte nicht mehr als 10 % des verwendeten
peqGOLD TriFast-Volumens betragen.
b. b. b. Monolayer Monolayer-Ze
Monolayer Monolayer Ze Zellen Ze llen
Die Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch die Zugabe von 1 ml peqGOLD
TriFast je 3.5-cm-Schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die
Menge an benötigtem peqGOLD TriFast ist nicht von der Zellzahl, sondern von der
Größe der Zellkulturschale (in der Regel 1 ml pro 10 cm 2 ) abhängig. Eine unzureichende
Menge an peqGOLD TriFast kann zur Kontamination der extrahierten RNA mit DNA
führen.
c. Zellsuspensionen
Zellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml peqGOLD TriFast je 5 - 10 x 10 6 Zellen
resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau der RNA und sollte
vermieden werden.
2. Phasentrennung
Die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation der
Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Je eingesetztem Milliliter peqGOLD TriFast 0.2 ml
Chloroform zugeben und die Proben für 15 Sekunden kräftig schütteln. Danach 3 - 10
Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend die Probe für 5 Minuten bei
12.000 x g zentrifugieren um eine Phasenauftrennung zu bekommen. Es bilden sich drei
Phasen: eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine obere farblose wässrige Phase
und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wässrigen
Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine in der Interphase und der
Phenolphase befinden. Die wässrige Phase nimmt dabei ca. 60 % des Probenvolumens
ein.
Das verwendete Chloroform sollte von Zusätzen wie z.B. Isoamylalkohol frei sein.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
V.0111 PEQLAB Biotechnologie GmbH 4