peqGOLD HP Total RNA Kit - PEQLAB Biotechnologie GmbH

Arbeitsanleitung – Instruction Manual
peqGOLD HP Total RNA Kit
(Classic-Line & Safety-Line)
V0111 Creating the future together.

INHALT
EINLEITUNG 1
FUNKTIONSPRINZIP 1
KITBESTANDTEILE 2
LAGERUNG 2
WICHTIGE HINWEISE 3
PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE 4
DNA-KONTAMINATIONEN 7
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA 7
RNA-QUALITÄT 8
BESTELLINFORMATIONEN 8
TROUBLESHOOTING TIPS 9
CONTENT
INTRODUCTION 10
THEORY 10
KIT COMPONENTS 11
STORAGE AND STABILITY 11
BEFORE STARTING 12
PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL 13
DNA CONTAMINATION 16
QUANTITATION AND STORAGE OF RNA 16
RNA QUALITY 17
ORDERING INFORMATION 17
TROUBLESHOOTING TIPS 17

EINLEITUNG
Der peqGOLD HP Total RNA Kit kombiniert eine auf Phenol und Guanidinisothiocyanat
basierende Einschritt-Flüssigphasen-Separation mit einer silikatmembran-basierenden
Zentrifugationssäulenmethode, für eine einfache und effiziente Isolierung von Gesamt-RNA
aus eukaryotischen Zellen und Geweben. Das im Kit enthaltene peqGOLD TriFast ist ein
gebrauchsfertiges Reagenz optimal geeignet für die Lyse von verschiedenen Geweben,
vor allem für fettreiche Gewebe wie z.B. Gehirn oder Fettgewebe, und inhibiert
gleichzeitig effizient RNasen. Ein optimiertes Puffersystem erlaubt dabei die Aufreinigung
von bis zu 100 µg nicht degradierter Gesamt-RNA mit Moleküllängen ab 200 Basen
aufwärts.
RNA, die mit den peqGOLD HP Total RNA Kits isoliert wurde, kann für alle Arten von
Folgeexperimenten, wie RT-PCRs, Poly(A) + -RNA-Extraktionen, Northern Blots, Nuclease
Protection Assays und in vitro-Translationen, weiterverwendet werden.
peqGOLD HP Total RNA Kits werden wahlweise mit S- oder mit C-Säulen geliefert (Safety-
Line, Best.-Nr. 12-6935-xx oder Classic-Line, Best.-Nr. 12-6936-xx). Schnappdeckel
sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz
vor Kreuzkontaminationen. Classic-Line Säulen haben keinen Deckel und erleichtern so das
Handling.
FUNKTIONSPRINZIP
Aufzuarbeitende Zellen und Gewebe werden zunächst in TriFast Reagenz homogenisiert,
wobei alle vorhandenen RNasen und sonstige Enzyme effizient inhibiert werden. Durch
die Verwendung von TriFast Reagenz ist es möglich auch größere Mengen Gewebe
(bis zu 100 mg Gehirn oder Fettgewebe) auf eine peqGOLD PerfectBind RNA Column zu
laden und damit die RNA-Ausbeute zu erhöhen. Nach der Zugabe von Chloroform und
anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf. Die RNA ist
in der wässrigen Phase enthalten, die DNA in der organischen und der Interphase. Die
Proteine befinden sich in der organischen Phase. Die wässrige Phase wird anschließend
auf eine PerfectBind RNA Column geladen, in der die RNA-Moleküle an die enthaltene
Silikamembran binden.
Phenol und andere Kontaminationen können durch Waschen mit speziellen Puffern
schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA
wird abschließend in sterilem RNase-free Water eluiert.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
V.0111 PEQLAB Biotechnologie GmbH 1

KITBESTANDTEILE
peqGOLD HP Total RNA Kits 5 Reinigungen 50 Reinigungen 200 Reinigungen
Bestellnummer Classic-Line 12-6936-00 12-6936-01 12-6936-02
Bestellnummer Safety-Line 12-6935-00 12-6935-01 12-6935-02
Bestandteile
PerfectBind RNA Columns 5 50 200
2 ml Collection Tubes 15 150 600
TriFast Reagenz 6 ml 55 ml 220 ml
RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml
RNA Wash Buffer II (Konz.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml
RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml
Arbeitsanleitung 1 1 1
LAGERUNG
Alle Komponenten des peqGOLD HP Total RNA Kits, mit Ausnahme des TriFast Reagenz,
sollten bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Lagerung des TriFast Reagenz sollte bei
4 °C erfolgen.
Bei Lagerung unter den angegebenen Bedingungen bleiben die Komponenten des Kits für
mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
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WICHTIGE HINWEISE
Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig
durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien
bereit, um durch unnötige Zeitverzögerungen verursachte RNA-Degradationen zu
vermeiden.
! Bei allen Arbeiten mit RNA sollten zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen
Einmalhandschuhe getragen werden. Zum Pipettieren der im Kit enthaltenen Puffer
sollten ausschließlich saubere, RNase-freie Einmalpipettenspitzen verwendet werden.
! RNA-Präparationen sollten besonders sorgfältig, daneben aber auch so zügig wie
möglich durchgeführt werden.
! Es ist unbedingt zu empfehlen, dass vor Beginn des Experimentes, die optimale Menge
des Ausgangsmaterials definiert wird.
Die maximale Bindekapazität der peqGOLD PerfectBind RNA Column beträgt 100 µg.
Bei Proben mit hohem RNA-Gehalt empfehlen wir deshalb mit 30 mg Gewebe zu
starten. Bei Proben mit geringem RNA-Gehalt empfehlen wir bis zu 100 mg Gewebe
einzusetzen.
! RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten
Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden:
Kit 12-6936-00 2 ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-6936-01 20 ml RNA Wash Buffer II mit 80 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-6936-02 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II mit 3 x 80 ml 100 % EtOH mischen.
! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei 22 – 25 °C ausgeführt werden.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
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PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLIERUNGSPROTOKOLLE
Eukaryotische Zellen und Gewebe
Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:
! Chloroform
! 100 % Ethanol
! 70 % Ethanol in sterilem DEPC-dH 2O
! Sterile RNase-freie Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen
1. Homogenisierung und Lyse
a. a. a. Gewebe Gewebe
Gewebe
50 - 100 mg Gewebe werden mit je 1 ml peqGOLD TriFast homogenisiert. Um eine
gute Lyse zu erreichen, sollte ein Glas-, ein Teflon- oder ein elektrischer Homogenisator
verwendet werden. Das Probenvolumen sollte nicht mehr als 10 % des verwendeten
peqGOLD TriFast-Volumens betragen.
b. b. b. Monolayer Monolayer-Ze
Monolayer Monolayer Ze Zellen Ze llen
Die Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch die Zugabe von 1 ml peqGOLD
TriFast je 3.5-cm-Schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die
Menge an benötigtem peqGOLD TriFast ist nicht von der Zellzahl, sondern von der
Größe der Zellkulturschale (in der Regel 1 ml pro 10 cm 2 ) abhängig. Eine unzureichende
Menge an peqGOLD TriFast kann zur Kontamination der extrahierten RNA mit DNA
führen.
c. Zellsuspensionen
Zellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml peqGOLD TriFast je 5 - 10 x 10 6 Zellen
resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau der RNA und sollte
vermieden werden.
2. Phasentrennung
Die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation der
Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Je eingesetztem Milliliter peqGOLD TriFast 0.2 ml
Chloroform zugeben und die Proben für 15 Sekunden kräftig schütteln. Danach 3 - 10
Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen. Anschließend die Probe für 5 Minuten bei
12.000 x g zentrifugieren um eine Phasenauftrennung zu bekommen. Es bilden sich drei
Phasen: eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine obere farblose wässrige Phase
und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wässrigen
Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine in der Interphase und der
Phenolphase befinden. Die wässrige Phase nimmt dabei ca. 60 % des Probenvolumens
ein.
Das verwendete Chloroform sollte von Zusätzen wie z.B. Isoamylalkohol frei sein.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
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3. Laden und Binden
Die obere wässrige Phase in ein neues 1.5 ml Tube überführen, mit einem identischen
Volumen 70 % Ethanol versetzen und durch Vortexen sorgfältig mischen. Eine PerfectBind
RNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und 750 µl Probe auf die Säule laden.
PerfectBind RNA Column im Tube für 15 Sekunden bei 10.000 x g zentrifugieren.
Säulendurchfluss verwerfen. Schritt wiederholen und restliche wässrige Phase auf die
PerfectBind RNA Column laden.
Nach der Zugabe von 70 % Ethanol kann sich ein Präzipitat bilden, das mit der Probe auf die Säule
gegeben werden muss. Das Fassungsvermögen der PerfectBind RNA Column beträgt 750 µl. Durch
wiederholtes Befüllen und Zentrifugieren können jedoch auch größere Volumina bearbeitet werden.
Dabei ist jedoch zu beachten, dass die maximale Bindekapazität der PerfectBind RNA Column bei
ca. 100 µg RNA liegt.
4. Waschen I
500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15
Sekunden bei 10.000 x g durch die Säule zentrifugieren. PerfectBind RNA Column auf ein
frisches 2 ml Collection Tube stecken. Säulendurchfluss und altes Collection Tube verwerfen.
5. 5. DNase I Verdau (optional)
Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt
wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht
erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die
verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll
beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column.
(Bestellnr.: 12-1091-01/02)
a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten:
DNase I Digestion Buffer 73.5 µl
RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl
Gesamtvolumen 75 µl
Hinweis: Hinweis: Hinweis: Hinweis:
1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I-
Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I
Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen.
2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard
DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet!
b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column
pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des
Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet.
c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 - 30 °C) für 15 Minuten inkubieren.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
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d. d. PerfectBind RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA
Wash Buffer I zugeben. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur für 5 Minuten
inkubieren. Anschließend bei 10.000 x g für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss
verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 6) weiterverwenden.
6. Waschen II
600 µl des komplettierten RNA Wash Buffers II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 %
Ethanol) auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei 10.000 x g
durch die Säule zentrifugieren. Waschschritt wiederholen. Säulendurchfluss verwerfen.
7. 7. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)
PerfectBind RNA Column in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch
einminütiges Zentrifugieren bei 10.000 x g vollständig trocknen.
8. 8. Elution
PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA
mit 50 µl bis 100 µl sterilem RNase-free Water eluieren. Dazu direkt auf die Matrix
pipettieren und 1 Minute bei 10.000 x g zentrifugieren.
Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite
Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag
verbessert wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als
80 % der gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf
70 °C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der PerfectBind RNA
Column können die Erträge noch weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die RNA
auch direkt in einem größeren Volumen RNase-free Water eluiert werden.
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DNA-KONTAMINATIONEN
Mit keinem der aktuell verfügbaren RNA-Extraktionssysteme ist es möglich, genomische
DNA vollständig zu entfernen. Für sensitive Experimente wie Differential Display oder RT-
PCRs muss deshalb ein DNase I Verdau durchgeführt werden. Eine einfache und
zeitsparende Möglichkeit bietet der DNase-Verdau direkt auf der Säule, der in das
bestehende Protokoll zwischen den Waschschritten integriert werden kann (s. Punkt 5:
DNase I Verdau). Alternativ kann auch eine Nachbehandlung der isolierten RNA mit
RNase-freier DNase durchgeführt werden.
Der Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens von DNA-Kontaminationen kann mit Hilfe
von intronüberspannenden Primern erfolgen, wobei das Entstehen von Banden Rückschlüsse
auf mögliche Kontaminationen zulässt.
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA
Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption
eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen
werden.
RNase-free Water ist leicht sauer und kann die gemessenen Absorptionswerte dramatisch herabsetzen.
Für die spektrophotometrische Analyse sollte die RNA deshalb besser in einer gepufferten
Lösung wie beispielsweise TE verdünnt werden.
Eine A 260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich
demnach wie folgt:
RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption 260 x 40 x Verdünnungsfaktor
Das A 260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqGOLD HP Total
RNA Kit erzielbare A 260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb RNA einer
Reinheit von 90 % bis 100 %.
RNA, die mit dem peqGOLD HP Total RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in sterilem RNasefree
Water für mindestens ein Jahr bei – 70 °C aufbewahrt werden.
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RNA-QUALITÄT
Vor ihrer Verwendung in Folgeexperimenten sollte durch denaturierende Agarosegelelektrophorese
und Ethidiumbromidfärbung zunächst noch die Qualität der extrahierten
RNA bestimmt werden. Auf dem gefärbten Gel müssen zwei scharfe Banden erkennbar
sein, die die ribosomalen 28 S und 18 S rRNAs repräsentieren. Sollten diese Banden in
Richtung niedermolekularer RNA-Größen schmieren, ist es während der Präparation,
Lagerung oder Weiterbearbeitung zu einer Degradation gekommen, die sich je nach
Folgeexperiment mehr oder weniger negativ auswirken kann.
Obwohl RNA-Moleküle < 200 Basen nur sehr ineffizient an die PerfectBind-Silikamatrix des
peqGOLD HP Total RNA Kits binden, kann auf dem Gel noch eine dritte distinkte Bande aus tRNAs
erscheinen. Diese Bande tritt vor allem dann auf, wenn die Zellzahl im Ausgangsmaterial besonders
hoch war.
BESTELLINFORMATIONEN
für die RNA-Isolierung aus Zellen, Geweben und Blut:
peqGOLD HP Total RNA Kit
(Classic-Line)
peqGOLD HP Total RNA Kit
(Safety-Line)
peqGOLD Total RNA Kit
(Classic-Line)
peqGOLD Total RNA Kit
(Safety-Line)
peqGOLD Blood RNA Kit
(Safety-Line)
12-6936-00 5 Reinigungen
12-6936-01 50 Reinigungen
12-6936-02 200 Reinigungen
12-6935-00 5 Reinigungen
12-6935-01 50 Reinigungen
12-6935-02 200 Reinigungen
12-6634-00 5 Reinigungen
12-6634-01 50 Reinigungen
12-6634-02 200 Reinigungen
12-6834-00 5 Reinigungen
12-6834-01 50 Reinigungen
12-6834-02 200 Reinigungen
12-6814-00 5 Reinigungen
12-6814-01 50 Reinigungen
12-6814-02 200 Reinigungen
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
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TROUBLESHOOTING TIPS
Problem Ursache Abhilfe
Wenig oder keine
RNA im Eluat
RNA bleibt auf der Säule
Elution wiederholen.
RNase-free Water vor dem Eluieren auf 70 °C
erwärmen.
Säule vor dem Eluieren für 10 min mit RNasefree
Water inkubieren.
Säule ist überladen Menge des Ausgangsmaterials reduzieren.
Säule verstopft Unvollständige Homogenisierung
RNA-Degradation
DNA-
Kontamination
Niedrige
Absorptionsraten
Probleme bei
Folgereaktionen
Schlechtes Ausgangsmaterial
RNase-Kontamination
Physikalische Ähnlichkeit von
RNA und DNA
RNA in saurem Puffer oder
Wasser verdünnt
Salzübertragung während
der Elution
Probe vollständig homogenisieren.
Zentrifugationszeit verlängern.
Menge des Ausgangsmaterials reduzieren.
Ausgangsmaterial sofort nach Probennahme in
Stickstoff einfrieren.
Ausgangsmaterial erst lysieren und dann
lagern.
Präparation zügiger und exakter nach
Vorschrift durchführen.
Nur RNase-freies Material verwenden und
Handschuhe tragen.
Puffer auf RNase-Kontaminationen überprüfen.
Verdau mit RNase-freier DNase. (5 min bei
37 °C inkubieren.)
RNase-free Water ist sauer und kann die A 260-
Werte dramatisch herabsetzen. Zum Messen in
TE-Puffer verdünnen.
Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II mit 4
Volumen 100 % EtOH verdünnt wurde.
Sicherstellen, dass RNA Wash Buffer II bei
Raumtemperatur gelagert und verwendet
wurde.
Waschschritt mit RNA Wash Buffer II
wiederholen.
peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936
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INTRODUCTION
peqGOLD HP Total RNA Kits integrate phenol/guanidine-based lysis and silicamembrane
purification of total RNA. TriFast Reagent, included in the kits, is a
monophasic solution of phenol and guanidine thiocyanate, designed to facilitate lysis of
different sources of samples especially for fatty tissues such as brain and adipose tissue
and inhibit RNases. With the peqGOLD HP Total RNA Kits, all RNA molecules longer
than 200 nucleotides are isolated.
RNA purified using the peqGOLD HP Total RNA Kit is ready for applications such as RT-
PCR, Northern blotting, poly(A) + -RNA (mRNA) purification, nuclease protection assays
and in vitro translation.
peqGOLD HP Total RNA Kits are available as S- or C-line columns (Safety-Line, # 12-
6935-xx or Classic Line, # 12-6936-xx). Safety-Line columns can be closed tightly by lids
to avoid cross-contamination more effectively. Classic-Line colums do not have lids for a
more comfortable handling.
THEORY
The high lysis efficiency of the TriFast Reagent enables use of larger amounts of tissue
(up to 100 mg of brain or adipose tissue) with the peqGOLD PerfectBind RNA Column.
Tissue samples are homogenized in TriFast Reagent. After addition of chloroform, the
homogenate is separated into aqueous and organic phases by centrifugation. RNA
partitions to the upper, aqueous phase while DNA partitions to the interphase and
proteins to the lower, organic phase or the interphase.
The upper, aqueous phase is extracted, and ethanol is added to provide appropriate
binding conditions. The sample is then applied to the PerfectBind RNA Column, where the
total RNA binds to the membrane and phenol and other contaminants are efficiently
washed away. High-quality RNA is then eluted in RNase-free Water.
peqGOLD HP Total RNA Kit Ord.-No.: 12-6935/12-6936
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KIT COMPONENTS
peqGOLD HP Total RNA Kits 5 Purifications 50 Purifications 200 Purifications
Product Number Classic-Line 12-6936-00 12-6936-01 12-6936-02
Product Number Safety-Line 12-6935-00 12-6935-01 12-6935-02
Bestandteile
PerfectBind RNA Columns 5 50 200
2 ml Collection Tubes 15 150 600
TriFast Reagent 6 ml 55 ml 220 ml
RNA Wash Buffer I 5 ml 50 ml 200 ml
RNA Wash Buffer II (Conc.) 2 ml 20 ml 3 x 20 ml
RNase-free Water 1 ml 5 ml 20 ml
Instruction manual 1 1 1
STORAGE AND STABILITY
All components except TriFast Reagent in peqGOLD HP Total RNA Kit should be stored
at room temperature. TriFast Reagent should be stored at 4 °C.
All peqGOLD HP Total RNA Kit components are stable for at least 12 months from the
date of purchase when stored at 22 - 25 °C.
peqGOLD HP Total RNA Kit Ord.-No.: 12-6935/12-6936
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BEFORE STARTING
Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components
and have the necessary materials ready before starting.
! Whenever working with RNA, always wear one-way gloves to minimize RNase
contamination. Use only fresh RNase-free disposable plastic pipette tips when using
the supplied reagents.
! Work carefully but as quickly as possible during the procedure.
! It It is is very very important important to to determine determine the the correct correct amount amount of of starting starting material material before before the
the
experiment experiment. experiment
The capacity of the PerfectBind RNA Column is 100 µg. For samples containing high
amount of RNA, we suggest using 30 mg tissue to start. For samples containing lower
level RNA, the maximum amount of starting material (100 mg) can be used.
! RNA Wash Buffer II is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as
follows:
Kit 12-6936-00 Add 8 ml 100 % EtOH to 2 ml RNA Wash Buffer II
Kit 12-6936-01 Add 80 ml 100 % EtOH to 20 ml RNA Wash Buffer II
Kit 12-6936-02 Add 3 x 80 ml 100 % EtOH to 3 x 20 ml RNA Wash Buffer II
! All steps must be carried out at room temperature (22 – 25 °C).
peqGOLD HP Total RNA Kit Ord.-No.: 12-6935/12-6936
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PEQGOLD HP TOTAL RNA ISOLATION PROTOCOL
Eucaryotic cells and tissue
Materials required, but not supplied:
! Chloroform
! 100 % Ethanol
! 70 % Ethanol in sterile DEPC-dH 2O
! Sterile RNase-free pipet tips and centrifuge tubes
1. 1. Homogenization Homogenization Homogenization and and and Lysis Lysis
Lysis
a. a. Tissue
Tissue
Homogenize tissue samples in 1ml TriFast per 50 - 100 mg tissue. For efficient lysis use
a glass-Teflon or power homogenizer. The sample volume should not exceed 10 % of the
volume of TriFast used for the homogenization.
b. b. b. Monolayer Monolayer Monolayer cells cells
cells
Lyse cells directly in a culture dish by addition of 1 ml TriFast to a 3.5 cm diameter dish
and passing the cell lysate several times through a pipette. The amount of TriFast
needed is based on the area of the culture dish (1 ml per 10 cm 2 ) and not on the number
of cells. An insufficient amount of TriFast may result in contamination of the isolated
RNA with DNA.
c. c. Suspension Suspension Suspension culture
culture
Pellet cells by centrifugation. Lyse cells in TriFast by pipetting. Add 1 ml reagent per
5 - 10 x 10 6 of cells. Washing cells before the addition of TriFast should be avoided as
this increases the possibility of RNA degradation.
2. 2. Phase Phase Separation Separation
Separation
For dissociation of the nucleoprotein complexes the samples should be kept for 5 minutes
at room temperature. Add 0.2 ml of chloroform per 1 ml of peqGOLD TriFast and
shake samples by hand vigorously for 15 seconds. Keep them for 3 - 10 minutes at room
temperature. During centrifugation at 12.000 x g for 5 minutes the mixture separates into
the lower red (phenol-chloroform phase), the interphase and the colourless upper
aqueous phase. RNA is forced exclusively into the aqueous phase whereas DNA and the
proteins partition into the interphase and lower phenol phase. The volume of the RNA
containing phase is about 60 % of the volume of the TriFast used for homogenization.
Chloroform used in this experiment should be free of additives like isoamyl alcohol or others.
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3. 3. Load Load and and bind
bind
Transfer the upper aqueous phase into a new 1.5 ml centrifuge tube. Add an equal
volume 70 % Ethanol to the lysate and mix thoroughly by vortexing. Place a PerfectBind
RNA Column in a 2 ml Collection Tube and add 750 µl of the lysate directly to the
membrane. Centrifuge the PerfectBind RNA Column/Collection Tube assembly at
10.000 x g for 15 sec. Pour off the flow-through liquid. Repeat this step by loading the
remaining lysate to the column.
A precipitate may form on addition of 70 % ethanol. This will not interfere with RNA purification.
Vortex and add the entire mixture to the column. The maximum capacity of the spin column is
750 µl, larger volumes can be loaded successively by repeating the loading procedure. However,
the total binding capacity of a spin column is 100 µg RNA.
4. 4. 4. Wash Wash Wash II
I I
Add 500 µl RNA Wash Buffer I to the PerfectBind RNA Column and centrifuge for 15 sec
at 10.000 x g. Place the PerfectBind RNA Column in a fresh 2 ml Collection Tube.
Discard the flow-throw liquid and the used Collection Tube.
5. DNase DNase I I Digestion Digestion (optional)
Since PerfectBind RNA resin and spin-column technology actually removes most of DNA
without the DNase treatment, it is not necessary to do DNase digestion for most
downstream applications. However, certain sensitive RNA applications might require
further DNA removal. Following steps provide on-membrane DNase I digestion (Order
No. 12-1091).
a. For each PerfectBind RNA Column, prepare this DNase I digestion reaction mix:
DNase I Digestion Buffer 73.5 µl
RNase-free DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl
Total volume 75 µl
Note:
1. DNase I is very sensitive for physical denaturation, so do not vortex this DNase I mixture!
Mix gently by inverting the tube. Prepare the fresh DNase I digestion mixture directly before
RNA isolation.
2. DNase I Digestion Buffer is supplied with RNase-free DNase set. Standard DNase buffers
are not compatible with on-membrane DNase digestion!
b. Pipet 75 µl of the DNase I digestion reaction mix directly onto the surface of
PerfectBind RNA resin in each column. Make sure to pipet the DNase I digestion
mixture directly onto the membrane. DNase I digestion will not be complete if some of
the mix stick to the wall or the O-ring of the PerfectBind RNA Column.
c. Incubate at room temperature (25 - 30 °C) for 15 minutes.
peqGOLD HP Total RNA Kit Ord.-No.: 12-6935/12-6936
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d. Place the PerfectBind RNA Column into a new 2 ml Collection Tube and add 400 µl
RNA Wash Buffer I. Place the PerfectBind RNA Column at benchtop for 5 minutes.
Centrifuge at 10.000 x g for 5 minutes and discard flow-through. Re-use Collection
Tube in the next step. Continue with step 6.
6. 6. Wash Wash Wash II II
II
Add 600 µl completed RNA Wash Buffer II to the PerfectBind RNA Column and centrifuge
for 15 sec at 10.000 x g. Repeat this wash step and discard the flow-through liquid.
7. 7. Dry Dry Dry (Important, do not skip this step!)
Place the PerfectBind RNA Column containing your RNA in the Collection Tube and
centrifuge for 1 min at 10.000 x g to dry the column matrix.
8. Elution
Elution
Place the PerfectBind RNA Column into a fresh 1.5 ml microcentrifuge tube. Add
50 – 100 µl sterile RNase-free Water directly to the binding matrix in the PerfectBind
RNA Column and centrifuge for 1 min at 10.000 x g to elute RNA.
A second elution may be necessary if the expected yield of RNA is > 50 µg. Alternatively, RNA
may be eluted with a higher volume of water. While additional elution increase total RNA yield,
the concentration will be lowered since more than 80 % of RNA is recovered with the first elution.
Pre-heating RNase-free Water to 70 °C before adding to the PerfectBind RNA Column and
incubating the PerfectBind RNA Column for 5 min at room temperature before centrifugation may
increase yield. Instead of eluting twice, the RNA can directly be eluted in a bigger volume of
RNase-free Water.
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DNA CONTAMINATION
No RNA extraction procedure can completely remove genomic DNA. For sensitive work
(such as RT-PCR or differential display) we suggest that you treat the eluted RNA with
RNase-free DNase. On-membrane DNase I Digestion is a simple and fast method and
can be integrated into the standard protocol (see point 5). Alternatively, eluted RNA can
be treated with RNase-free DNase.
Also for RT-PCR, use intron-spanning primers that allow easy identification of DNAcontamination.
A PCR reaction, which uses the RNA as template, will also allow the
detection of DNA contamination.
QUANTITATION AND STORAGE OF RNA
Determine the absorption of an appropriate dilution (10- to 50-fold) of the sample at
260 nm and then at 280 nm.
RNase-free Water is slightly acidic and can dramatically lower absorption values. We suggest
that you dilute the sample in a buffered solution (TE) for spectrophotometric analysis.
One A 260-unit is about 40 µg RNA/ml. The RNA concentration is calculated as follows:
RNA conc. (µg /ml) = Absorption 260 × 40 × Dilution Factor
The ratio of A 260/280 is an indication of nucleic acid purity. A value higher than 1.8
indicates 90 % - 100 % nucleic acid.
Store RNA samples at – 70 o C in sterile RNase-free Water. Under such conditions RNA
prepared with the peqGOLD system is stable for at least one year.
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RNA QUALITY
It is highly recommended to determine the RNA quality prior to further applications.
Denaturing agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining can best assess
the quality of RNA. Two sharp bands should appear on the gel. These are the 28 S and
18 S ribosomal RNA bands. If these bands smear towards lower molecular weight RNA,
then the RNA has undergone major degradation during preparation, handling or
storage.
Although RNA molecules less than 200 bases in length do not efficiently bind the PerfectBind
matrix, a third RNA band, the tRNA band, may be visible when a large number of cells are used.
ORDERING INFORMATION
For RNA isolation from cells, tissues and blood:
peqGOLD HP Total RNA Kit 12-6936-00 5 Preparations
(Classic-Line) 12-6936-01 50 Preparations
12-6936-02 200 Preparations
peqGOLD HP Total RNA Kit 12-6935-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6935-01 50 Preparations
12-6935-02 200 Preparations
peqGOLD Total RNA Kit 12-6634-00 5 Preparations
(Classic-Line) 12-6634-01 50 Preparations
12-6634-02 200 Preparations
peqGOLD Total RNA Kit 12-6834-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6834-01 50 Preparations
12-6834-02 200 Preparations
peqGOLD Blood RNA Kit 12-6814-00 5 Preparations
(Safety-Line) 12-6814-01 50 Preparations
12-6814-02 200 Preparations
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TROUBLESHOOTING TIPS
Problem Problem
Likely Likely cause cause
Suggestion
Suggestion
Repeat elution.
Pre-heat RNase-free Water to 70 o Little or no RNA
eluted
RNA remains on the column
C prior to
elution.
Incubate column for 10 min with RNase-free
Water prior to centrifugation.
Column is overloaded Reduce quantity of starting material.
Clogged column Incomplete homogenization
Degraded RNA
Problem in
downstream
applications
DNA
contamination
Low Absorption
ratios
Source
RNase contamination
Salt carry-over during
elution
Completely homogenize sample.
Increase centrifugation time.
Reduce amount of starting material
Freeze starting material quickly in liquid
nitrogen.
Do not store tissue culture cells prior to
extraction unless they are lysed first.
Follow protocol closely, and work quickly.
Ensure not to introduce RNase during the
procedure.
Check buffers for RNase contamination.
Ensure RNA Wash Buffer II Concentrate has
been diluted with 4 volumes of 100 % ethanol
as indicated on the bottle.
RNA Wash Buffer II must be stored and used
at room temperature.
Repeat wash with RNAWash Buffer II.
Co-purification of DNA Digest with RNase-free DNase and incubate
at 37 o C for 5 min.
RNA diluted in acidic buffer
or water
RNase-free Water is acidic and can
dramatically lower Abs 260 values. Use TE
buffer to dilute RNA prior to
spectrophotometric analysis.
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D PEQLAB Biotechnologie GmbH, 91052 Erlangen, Freecall (D): 0800 100 20 16, info@peqlab.de, www.peqlab.de
AT PEQLAB Biotechnologie GmbH, 6404 Polling, Tel: +43 (0) 5238 84 169, info@peqlab.at, www.peqlab.at
UK PEQLAB Ltd., Southampton SO31 7ZN, Freecall (UK): 0808 202 1302, info@peqlab.co.uk, www.peqlab.co.uk
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