peqGOLD HP Total RNA Kit - PEQLAB Biotechnologie GmbH

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3. Laden und Binden Die obere wässrige Phase in ein neues 1.5 ml Tube überführen, mit einem identischen Volumen 70 % Ethanol versetzen und durch Vortexen sorgfältig mischen. Eine PerfectBind RNA Column in ein 2 ml Collection Tube stecken und 750 µl Probe auf die Säule laden. PerfectBind RNA Column im Tube für 15 Sekunden bei 10.000 x g zentrifugieren. Säulendurchfluss verwerfen. Schritt wiederholen und restliche wässrige Phase auf die PerfectBind RNA Column laden. Nach der Zugabe von 70 % Ethanol kann sich ein Präzipitat bilden, das mit der Probe auf die Säule gegeben werden muss. Das Fassungsvermögen der PerfectBind RNA Column beträgt 750 µl. Durch wiederholtes Befüllen und Zentrifugieren können jedoch auch größere Volumina bearbeitet werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die maximale Bindekapazität der PerfectBind RNA Column bei ca. 100 µg RNA liegt. 4. Waschen I 500 µl RNA Wash Buffer I auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei 10.000 x g durch die Säule zentrifugieren. PerfectBind RNA Column auf ein frisches 2 ml Collection Tube stecken. Säulendurchfluss und altes Collection Tube verwerfen. 5. 5. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNase-Behandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column. (Bestellnr.: 12-1091-01/02) a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer 73.5 µl RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) 1.5 µl Gesamtvolumen 75 µl Hinweis: Hinweis: Hinweis: Hinweis: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase I- Lösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur (25 - 30 °C) für 15 Minuten inkubieren. peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936 V.0111 PEQLAB Biotechnologie GmbH 5
d. d. PerfectBind RNA Column in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. PerfectBind RNA Column bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei 10.000 x g für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 6) weiterverwenden. 6. Waschen II 600 µl des komplettierten RNA Wash Buffers II (Pufferkonzentrat plus 4 Volumen 100 % Ethanol) auf die PerfectBind RNA Column pipettieren und für 15 Sekunden bei 10.000 x g durch die Säule zentrifugieren. Waschschritt wiederholen. Säulendurchfluss verwerfen. 7. 7. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) PerfectBind RNA Column in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch einminütiges Zentrifugieren bei 10.000 x g vollständig trocknen. 8. 8. Elution PerfectBind RNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und die RNA mit 50 µl bis 100 µl sterilem RNase-free Water eluieren. Dazu direkt auf die Matrix pipettieren und 1 Minute bei 10.000 x g zentrifugieren. Bei erwarteten RNA-Erträgen > 50 µg kann zur vollständigen Rückgewinnung der RNA eine zweite Elutionsrunde notwendig sein. Dabei ist zu berücksichtigen, dass zwar der absolute Ertrag verbessert wird, die RNA-Konzentration jedoch sinkt, da bereits bei der ersten Elution mehr als 80 % der gereinigten RNA zurückgewonnen werden. Ein Vorwärmen des RNase-free Water auf 70 °C und eine der Zentrifugation vorangehende fünfminütige Inkubation der PerfectBind RNA Column können die Erträge noch weiter verbessern. Statt einer zweiten Elutionsrunde kann die RNA auch direkt in einem größeren Volumen RNase-free Water eluiert werden. peqGOLD HP Total RNA Art.-Nr.: 12-6935/12-6936 V.0111 PEQLAB Biotechnologie GmbH 6
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