Leben_11

6. Ergebnisse und DiskussionGene überexprimiert werden, als potenziell limitierende Reaktionsschritte wurden für E. coli4pF20 AroK/L, AroB und AroE identifiziert. Die Metabolit–Bilanz für E. coli 4pF20 konnteunter Einbeziehung der gemessenen Nebenprodukte DAH(P), DHS und SHI zu 97-102%geschlossen werden.6.3.2. E. coli 4pF26Der Stamm E. coli 4pF26 enthält die Gene aroF fbr , pheA fbr und aroL auf dem Plasmid pF26.Ausgehend von den dargestellten Ergebnissen von E. coli 4pF20, wurde in den Stamm E. coli4pF26 zusätzlich das Gen für die Shikimat Kinase II (aroL) auf dem Plasmid eingefügt. DieÜberexpression dieses Gens sollte die Akkumulation von Shikimat verhindern und so zu einerhöheren L–Phe Bildung führen. Die Ergebnisse dieses Stammes sind in Abb. 6.16 dargestellt.Die Bildung von Shikimat konnte verhindert werden, interessant ist hierbei, das auch keineBildung von DHS mehr beobachtet wurde. Das lässt den Schluss zu, dass die intrazelluläreKonzentration von Shikimat offenbar Einfluss auf die Bildung von DHS hatte. Für dieShikimat Dehydrogenase (AroE) wird von Dell et al. [49] über eine Feedback–Inhibierungdurch Shikimat berichtet. Das bedeutet, dass im Stamm 4pF26 die intrazelluläre Shikimat–Konzentration durch die Überexpression von aroL offensichtlich so stark herabgesetzt wurde,dass diese Feedback–Schleife inaktiv war und dass neben Shikimat auch kein DHS mehr gebildetwurde. DAH(P) war das einzige Nebenprodukt aus der Aromatenbiosynthese, was analogzu den Ergebnissen mit E. coli 4pF20 auf eine Limitierung durch die 3–Dehydroquinat Synthase(AroB) hindeutete [110]. Da dieser enzymatische Schritt vor DHS und Shikimat liegt,hatte die Überexpression von aroL keinen Einfluss auf die DAH(P) Bildung, die mit E. coli4pF20 vergleichbar ist. Unter Einbeziehung von DAH(P) konnte die Metabolit–Bilanz für4pF26 geschlossen werden. Im nächsten Schritt sollte neben aroL zusätzlich das aroB Genüberexprimiert werden, um die L–Phe Bildung weiter zu erhöhen.6.3.3. E. coli 4pF69Der Stamm E. coli 4pF69 enthält die Gene aroF wt , aroL und pheA fbr auf dem PlasmidpF69. Im Vergleich zu E. coli 4pF26 wurde in E. coli 4pF69 das Gen für aroF fbr gegendas Wildtypgen aroF wt ausgetauscht. Die Verwendung des natürlichen Wildtyp–Gens hatteVorteile in Bezug auf die Stabilität und Aktivität des Enzyms. Durch prozesstechnischeRegelung der L–Tyr Konzentration in der Fermentation wurde die Feedback–Inhibierungdes Enzyms durch L–Tyr erfolgreich umgangen [70]. Die Ergebnisse dieses Stammes sind inAbb. 6.17 dargestellt.Analog zu E. coli 4pF26 wurde auch hier keine DHS oder Shikimat Bildung beobachtet,nur DAH(P) wurde als Nebenprodukt gemessen. Im Vergleich zu 4pF26 wurde die maximaleL–Phe Konzentration hier früher erreicht, was auf eine höhere Aktivität von AroF wt hinweist.Die Bildung und die maximale Konzentration von DAH(P) waren jedoch in beiden Fällensehr ähnlich.6.3.4. E. coli 4pF79Der Stamm E. coli 4pF79 enthält aroF wt , aroB und pheA fbr auf dem Plasmid pF79 undstellte eine Weiterentwicklung von pF69 dar. Da es zunächst aufgrund von Klonierungsproblemennicht gelang, aroB als viertes Gen mit auf das Plasmid pF69 zu integrieren, wurde90