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6.8. Analyse des Produktstoffwechsels von E. coli 4pF20 und E. coli 4pF78 mit statistischen Methodennegative Werte eine rasche Abnahme des Pools anzeigten, wobei immer auf die Poolgrößevor dem Puls normiert wurde.Entsprechend dieser Definition wurden die NPG aus den Konzentrations–Zeit–Verläufender Metaboliten für das Experiment mit E. coli 4pF20 berechnet (Abb. 6.57, oben). Diestärksten Veränderungen erfährt hier der P5P Pool, der auch nach 18 Sekunden immernoch schwingt, für Shikimat gilt vergleichbares. Insgesamt konnte jedoch kein gemeinsamesVerhalten, wie z.B. phasengleiche Oszillationen, in den Pools beobachtet werden, weder vornoch nach dem Puls. Genau wie bei den Konzentrations–Zeit–Verläufen fiel auch bei derDarstellung der NPG die sehr geringe Flexibilität des DAH(P) Pools auf, dessen NPG–Wertenahezu unverändert im Bereich von null lagen.Aufgrund der offensichtlichen Unterschiede der NPG Verläufe für die einzelnen Metabolitenwurden sie nun entsprechend ihrer Amplitudengröße sortiert, da die Amplitudengrößeeine Aussage über die Geschwindigkeit der Poolzu– bzw. abnahme erlaubte. Um potenzielllimitierende enzymatische Schritte in der Reaktionssequenz zu identifizieren, wurde dasPool–Effluxkapazitäts–Kriterium (PEK) definiert. Es entspricht dem größten negativenNPG für jeden Metaboliten, d.h. es ist ein Maß für die Geschwindigkeit jedes einzelnenenzymatischen Schritts. Dieser Idee folgend wurden Pools mit einem hohen PEK (d.h. starknegatives NPG) von einem schnellen Enzym umgesetzt, gleichzeitig deuteten Pools miteinem kleinen PEK (d.h. schwach negatives NPG) auf ein langsames (limitierendes) Enzymhin, das als potenzielles Ziel für das metabolic engineering identifiziert war. Die Poolgrößeder Metaboliten hatte keinen Einfluss auf das PEK, da die NPG bereits mit der Poolgrößenormiert worden waren.Für die Metaboliten DAH(P), DHQ, DHS, Shikimat und S3P wurden PEK Werte von0.09, 0.42, 0.48, 0.41 und 0.22 [ s −1 ] bestimmt (Abb. 6.58). Entsprechend der oben erläutertenDefinition des PEK wurde der Metabolitpool mit dem geringsten PEK von dem amstärksten limitierenden Enzym umgesetzt. In diesem Fall hatte DAH(P) mit 0.09 [ s −1 ]dengeringsten Wert, folglich konnte die 3–Dehydroquinat Synthase (AroB) als vorrangiges Zielfür eine genetische Verbesserung des Stammes identifiziert werden. Dieses Ergebnis, das aufBasis der intrazellulären Metabolitmessungen erhalten wurde, deckt sich vollständig mit denErgebnissen über limitierende enzymatische Schritte aus der Stammentwicklung der L–PheProduzenten (Kap. 6.3) und früheren Untersuchungen aus der Literatur, bei denen extrazelluläreDaten verwendet wurden [109, <strong>11</strong>0, 155, 189].6.8.2. Pulsexperiment mit E. coli 4pF78Aufgrund der im vorhergehenden Abschnitt erhaltenen Ergebnisse über den limitierendenCharakter von AroB in E. coli 4pF20 wurde in E. coli 4pF78 zusätzlich aroB überexprimiert,um die Limitierung aufzuheben. In Abb. 6.55 (rechte Balken) sind die intrazellulärenKonzentrationen vor dem Puls dargestellt. Obwohl die PEP und P5P Werte vergleichbarmit denen von E. coli 4pF20 waren, konnte DAH(P) nicht mehr intrazellulär nachgewiesenwerden. Offensichtlich war die AroB Limitierung aufgehoben worden. Gleichzeitig wurdenaber erhöhte Konzentrationen für die auf DAH(P) folgenden Metaboliten beobachtet, wasauf eine weitere Limitierung im späteren Verlauf des Stoffwechselwegs hindeutete. Außerdemwurden auch deutliche Unterschiede in den Konzentrations–Zeit–Verläufen der Metaboliten147
6. Ergebnisse und Diskussionnormierte Poolgeschwindigkeit [1/s]1,51,00,50,0-0,5-1,0E. coli 4pF20 :P5PPEPDAH(P)DHQDHSShikimatS3P-1,5-5 0 5 10 15 20Zeit [s]normierte Poolgeschwindigkeit [1/s]1,51,00,50,0-0,5-1,0strain BE. coli 4pF78 :P5PPEPDAH(P)DHQDHSShikimatS3P-1,5-5 0 5 10 15 20 25 30Zeit [s]oscillation ringing:DHQDHSAbbildung 6.57.: Verläufe der berechneten normierten Poolgeschwindigkeiten (NPG) fürdas Experiment mit E. coli 4pF20 (oben) und E. coli 4pF78 (unten) vor und nach derPulszugabe; gestrichelte Linien zeigen die Abnahme der in-Phase Schwingung von DHQund DHS in E. coli 4pF78 an148
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Forschungszentrum Jülich GmbHInsti
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Die Menschen pflegen die Natur wie
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1. EinleitungDie Nutzung der biolog
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synthese hat hier möglicherweise e
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5. Analytische Methoden5.1. Biomass
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6.3. Einsatz der 1 H-NMR Metabolit
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