Leben_11

5. Analytische MethodenTabelle 5.1.: Methodenparameter der HPLC Analytik für organische SäurenSäule Aminex HPX–87H, Bio–Rad, 300x7,8 mmTemperatur 40 ◦ CFlussrate 0,5 mL min −1Injektionsvolumen 100 µLDetektion 215 nmElution 0,1 M H 2 SO 4strömt die zellhaltige Probelösung durch einen angelegten Unterdruck mit konstanter Strömungsgeschwindigkeitdurch einen Kapillarkörper, in dem eine aus Rubin gefertigte Messporeenthalten ist, deren Durchmesser 45 µm beträgt. Entlang der Kapillarstrecke wird überzwei Platin–Elektroden eine Spannung angelegt, wodurch die elektrolytgefüllte Messkapillareeinen definierten elektrischen Widerstand darstellt. Da die intakte Bakterienzelle in ersterNäherung als Isolator betrachtet werden kann, wird beim Durchtritt einer Zelle durch dieMesspore der elektrische Widerstand erhöht. Dieses Signal ist ein Maß für das Volumen derZelle, wobei jedoch die geometrische Information über die Struktur bzw. die Form der Zelleverloren geht. Die Messdaten wurden über die serielle Schnittstelle des Geräts an ein von A.Franz im IBT–2 programmiertes LabView Programm auf einen Messrechner übertragen.5.3. Extrazelluläre Analytik5.3.1. Organische Säuren mittels HPLCDie Methode basiert auf der Ionen–Ausschluss–Chromatographie. Durch den saurenEluenten werden die organischen Säuren positiv polarisiert und wechselwirken mit derstationären Phase, einem Kationenaustauscher, wodurch unterschiedliche Retentionzeitenerzielt werden. Mit dieser Methode wurden die organischen Säuren Acetat, Zitrat, Fumarat,Malat, Chinasäure, 3–Dehydroquinat, 3–Dehydroshikimat, Shikimat, Phenylpyruvat, Chorismat,Uracil, Orotsäure und Phenyllactat gemessen. Die Messungen wurden mit wässrigenStandardlösungen und nach Zentrifugation der Zellen bei 13 000 U min −1 und 10 min (Biofugepico, Heraeus) mit dem entsprechend verdünnten Fermentationsüberstand durchgeführt.Es wurde eine Chromatographiesäule (Aminex HPX–87H, Bio–Rad) mit 300 mm Längeund 7,8 mm Durchmesser verwendet. Die Elution erfolgte isokratisch bei 40 ◦ C (Ofen S4110,Sykam) mit 0,1 M H 2 SO 4 und einem Eluentenfluss von 0,5 mL min −1 (Pumpe S1000, Sykam).Die Injektion der Proben erfolgte mit einem Injektionsvolumen von 100 µL durch einen auf10 ◦ C temperierten programmierbaren Autosampler (S5200, Sykam). Die Detektion erfolgtemit einem Dioden–Array–Detektor (UVD340S, Dionex) von 200–595 nm. Die Datenaufnahmeund die Auswertung der Messungen erfolgte mit der Chromeleon 6.4 ChromatographieSoftware (Dionex). Die quantitative Auswertung wurde bei einer Wellenlänge von λ = 215nm durchgeführt. Die Methodenparameter sind in Tab. 5.1 zusammengefasst.Shikimat–3–phosphat (S3P) kann ebenfalls über diese HPLC Methode gemessen werden.Durch eine alkalische Phosphatase wird die Phosphatgruppe abgespalten, und es wird Shikimatals Produkt dieser enzymatischen Reaktion erhalten. Zu 450 µL Probelösung wurde46