Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus ...

Isolierung und Charakterisierungvon Membranproteinen aus Riechzellen der RatteNicole UngererHeidelberg, August 2005

Isolierung und Charakterisierungvon Membranproteinen aus Riechzellen der RatteNicole UngererHeidelberg, August 2005

Diplomarbeit im Fachbereich Biologiean der Fakultät für Biowissenschaftender Ruprecht-Karls-UniversitätHeidelbergIsolierung und Charakterisierungvon Membranproteinen aus Riechzellen der RatteVorgelegt von Nicole UngererHeidelberg, August 2005

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Ruprecht-Karls-Universität Heidelbergin der Zeit vom 7. Dezember 2004 bis 7. August 2005 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan Fringsund Dr. Frank Möhrlen angefertigt.Referent: Prof. Dr. Stephan FringsKorreferent: PD Dr. Harald Herrmann-LerdonHiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine anderen alsdie angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.Heidelberg, den 07. August 2005________________________________________Nicole Ungerer

DanksagungDiese Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Physiologie am Institut für Zoologie derUniversität Heidelberg angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich bei allen für diefreundschaftliche Atmosphäre innerhalb der Arbeitsgruppe bedanken, die sehr zum Erfolg dieserArbeit beigetragen hat.Mein besonderer Dank gilt:• Prof. Dr. Stephan Frings für die Überlassung des Themas und für das große Interesse andieser Arbeit• Priv.-Doz. Dr. Harald Herrmann-Lerdon (DKFZ, Heidelberg) für die Übernahme desKorreferats• Dr. Frank Möhrlen für die tadellose Betreuung und Beratung bei der Durchführungbiochemischer Experimente• Dipl.-Biol. Ulrich Mayer für die gute Zusammenarbeit und seine Diskussionsbereitschaft• Dipl.-Biol. Daniel Klimmeck für viele kreative Ideen und Korrekturlesearbeiten• Dr. Uwe Warnken (DKFZ, Heidelberg) für die Durchführung der ESI-Massenspektrometrieund die große Hilfsbereitschaft• Dr. Tore Kempf (DKFZ, Heidelberg) für die praktische Hilfestellung beim Protein-Verdauund für viele nützliche Ratschläge• Dr. Martina Schnölzer (DKFZ, Heidelberg) für das große Interesse an diesem Projekt• Priv.-Doz. Dr. Ingrid Boekhoff für ihre nützlichen Tipps bei der Cilien-Präparation• Meinem Lebensgefährten Thomas und meinen Kindern Sebastian und Valerian für ihregroße Geduld und ihr humorvolles Wesen.

InhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnisInhaltsverzeichnis………………………………………………………………………………iAbkürzungsverzeichnis………………………………………………………………………....I1 Einleitung .......................................................................................................................... 11.1 Aufbau des olfaktorischen Epithels............................................................................ 11.2 Die olfaktorische Transduktionskaskade ................................................................... 31.3 Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion........................................... 51.4 Protein-Analytik ......................................................................................................... 61.4.1 Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese ............................. 71.4.2 Massenspektrometrie.......................................................................................... 81.4.2.1 Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik.............. 81.4.2.2 Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung ....................... 101.4.3.1 Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF ............................... 121.5 Ziel dieser Arbeit...................................................................................................... 152 Material und Methoden................................................................................................. 162.1 Chemikalien und Material........................................................................................ 162.2 Lösungen .................................................................................................................. 172.2.1 Lösungen für die Präparation ........................................................................... 172.2.1.1 Lösungen für die Cilien-Präparation ............................................................ 172.2.1.2 Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel............................ 172.2.1.3 Verwendete Protease-Inhibitoren................................................................. 182.2.2 Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode ................................... 192.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase ................................... 202.2.4 Lösungen für die SDS PAGE........................................................................... 202.2.5 Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE ....................................................... 212.2.6 Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung ............................................. 222.2.7 Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung............................................. 222.2.8 Lösungen für die Western Blot-Analyse.......................................................... 232.2.9 Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine.......................................... 232.3 Größenstandards und Antikörper ............................................................................. 242.3.1 Größenstandards für die Gelelektrophorese..................................................... 24i

Inhaltsverzeichnis2.3.1.1 Größenstandard für die SDS-PAGE............................................................. 242.3.1.2 Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE............... 252.3.2 Antikörper für die Western Blot-Analyse ........................................................ 262.3.2.1 Primäre Antikörper....................................................................................... 262.3.2.2 Sekundäre Antikörper .................................................................................. 262.4 Tiere ......................................................................................................................... 272.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel ........................................................ 272.5.1 Präparation und Isolierung des Gesamtepithels ............................................... 272.5.2 Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode ................................. 282.5.3 Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999) ........................... 302.6 PNGaseF-und Benzonase-Behandlung .................................................................... 302.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-Methode................ 312.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese................................................... 322.8.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli(1970)….. ......................................................................................................................... 322.8.2 Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (verändertnach Navarre et al, 2002) ................................................................................................. 332.8.2.1 Vorbereitung der Gele.................................................................................. 332.8.2.2 1. Dimension: CTAB-PAGE........................................................................ 342.8.2.3 2.Dimension: SDS-PAGE ............................................................................ 352.9 Färbung der Proteine im Gel .................................................................................... 352.9.1 Reversible MS-kompatible Silberfärbung........................................................ 352.9.2 Colloidale Coomassie-Färbung........................................................................ 362.10 Western Blot-Analyse .............................................................................................. 362.10.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen .................................................. 362.10.2 Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase-Aktivität............................................................................................................................ 362.11 Massenspektrometrie................................................................................................ 382.11.1 Ausschneiden der Proteine............................................................................... 382.11.2 Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen („im-Gel Verdau“) ............................. 392.11.3 Nano-LC und interne Kalibrierung .................................................................. 402.11.4 Extraktion der Proben....................................................................................... 41ii

Inhaltsverzeichnis3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 423.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen ........................... 423.2 Qualitative Analyse der Präparation ........................................................................ 443.2.1 Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE .................. 443.2.2 Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse..... 453.2.2.1 Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals ....................... 453.2.2.2 Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III) ...................... 463.2.2.3 Western Blot-Analyse der α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins(G α olf )….. ..................................................................................................................... 473.2.3 Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse ............ 473.3 Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischen Trennverfahrens................... 493.3.1 Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese............................................................................................................. 493.3.1.1 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung ......................... 503.3.1.2 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-Färbung 513.4 Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweis cilien-spezifischerMarkerproteine ..................................................................................................................... 533.4.1 Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-Untereinheit ................... 533.4.2 Western Blot-Analyse der AC III und von G α olf .............................................. 543.5 Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung der Proteine ........ 553.5.1 Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen aus Datenbanken .. 563.5.2 Tabellarische Auflistung der Resultate ............................................................ 604 Diskussion ....................................................................................................................... 645 Zusammenfassung.......................................................................................................... 736 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 74A Anhang ............................................................................................................................ 83iii

AbkürzungsverzeichnisAbkürzungsverzeichnisAbkürzungαAC IIIAMPAPIATPAPSBACCaBPcAMPCHAPScmCNGCTABDDaDTTECLEDTAEGTAERESIeVFaFABFADG αolfGlugtGTPErklärunganti-Adenylatcyclase Typ IIIAdenosin-5'-monophosphatatmospheric pressure ionizationAdenosin-5'-TriphosphatAmmoniumpersulfatBenzyldimethylhexadecyl-ammonium chloridcalcium binding proteinzyklisches AMP3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonatZentimetercyclic nucleotide gated channelCetidyltrimethylammoniumbromiddimensionalDaltonDithiothreitholenhanced chemiluminescenceEthylendinitrilotetraessigsäureEthylenglycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessigsäureEndoplasmatisches reticulumelectrospray ionizationElektronenvoltFirmafast atom bombardmentFlavinadenindinucleotidα-Untereinheit des olfaktorisches G-ProteinGlutamatgoatGuanosin-5'-TriphosphatI

AbkürzungsverzeichnishStundeHEPES4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethan-SulfonsäureHPLCHigh Pressure Liquid ChromatographyHRPhorseradish-peroxidaseIEFisoelektrische FokussierungIgGImmunglobulin GInsP 3Inositol 1,4,5-trisphosphatIPisoelektrischer PunktkDaKilodaltonkHzKilohertzkVKilovoltLCLiquid ChromatographyLPLamina propriaMMolarmAMilliampèreMALDIMatrix Assisted Laser Desorption IonizationMHzMegahertzmlMillilitermmMillimetermMmilli-MolarM rmsMSrelative Molekülmassemilli-SekundeMassenspektrometriem/ z Masse über LadungnLNanoliterODOptische DichteOEOlfaktorisches EpithelORNOlfaktorische Rezeptor-Neuronepprobabilityp.apro analysiPAGEPolyacrylamid-GelelektrophoresePBSphosphate buffered salinePHBProhibitinPIisoelektrischer PunktII

AbkürzungsverzeichnisPMFPeptidmassen-FingerprintPMSFPhenylmethylsulfonylfluoridPLC-β2Phospholipase C-β2PVDFPolyvinylidenfluoridQQuadrupolrbrabbitrpmrounds per minutertratSDSSodium-DodecylsulfatSH-Sulfhydryl-ToFTime of flightTris2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiolTRPCtransient receptor potential channeluUnitUDPUridin-Diphosphatµg Microgrammµl Microliterµm Micrometerv/ v volume per volumew/ v weight per volumeIII

1 Einleitung1 EinleitungMembranproteine verleihen den Membranen von Zellen ihre charakteristischen Eigenschaftenund gestatten den Zellen eine gewisse Dynamik. Sie ermöglichen den Transport vonSubstanzen über die Membran, wirken katalytisch, z.B. bei der ATP-Synthese, oder habenstrukturelle Funktionen, indem sie das Cytoskelett der Zelle mit der extrazellulären Matrixoder mit benachbarten Zellen verknüpfen. Als Rezeptoren dienen sie der Weitergabe vonSignalen aus der Umgebung in die Zelle. In Riechsinneszellen verwandeln Membranproteinechemische Signale in elektrische Signale, ein Vorgang, den man als chemoelektrischeTransduktion bezeichnet.1.1 Aufbau des olfaktorischen EpithelsDas Riechepithel der Landwirbeltiere liegt als Verbund einzelner Zellschichten in derNasenhöhle. Es besteht aus Riechsinneszellen (Riechzellen, olfaktorische Rezeptor-Neurone,ORN), Stützzellen, Basalzellen und in geringerem Umfang aus Phospholipase C-β2 positivenZellen (PLC-β2-Zellen; Anholt, 1993; Elsässer et al., 2005). Seine Oberfläche wird von einerdünnen wässrigen Schleimschicht, dem Mukus, feucht gehalten und geschützt.Abb. 1.1 Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels. OE:Olfaktorisches Epithel; LP: Lamina propria; C: Cilien derRiechsinneszellen; MV: Mikrovilli der Stützzellen und PLC-β2positiven Zellen; SZ: Stützzellen; RZ: Riechsinneszellen; BZ:Basalzellen; BD: Bowman-Drüsen (verändert nach Anholt, 1993).1

1 EinleitungDer Mukus wird von unterhalb des Epithels liegenden Drüsenzellen, den Bowman-Drüsen,sezerniert. Er enthält die für den Riechvorgang notwendigen Elektrolyte und hydrophile,olfaktorische Bindeproteine (Pelosi, 1994), die die Diffusion der überwiegend hydrophobenDuftmoleküle zu den Riechsinneszellen erleichtern (Ache und Restrepo, 2000).Riechzellen sind primäre, bipolare Neurone. Vom Zellkörperausgehend entsenden sie einen Dendriten zur Oberfläche desolfaktorischen Epithels. Die Axone der Riechzellen mündengebündelt im Riechkolben (Bulbus olfactorius), der erstenStation zentralnervöser Verarbeitung. Jeder Dendrit ist anseinem apikalen Ende knopfartig erweitert und trägt 10-20Cilien (Menco, 1983), eine Struktur, die man als dendritischenKnopf bezeichnet. Die Cilien der Säuger besitzen eine Längevon etwa 50µm (Finger et al., 2000). Ihre Membranen sind dieTräger der Duftstoff-Rezeptoren und bilden im Mukus einegroße chemosensorische Fläche (Menco, 1980; Buck und Axel,1991).Abb. 1.2 IsolierteRiechzelle aus Ranapipiens. Differential-Interferenz Kontrastbild1:100; (S.J.Kleene,R.C. Gesteland, 1981).Die Lebensdauer von Riechzellen ist auf etwa 4 Wochen begrenzt (Breipohl et al., 1986;Farbman, 1990). Basalzellen, die unterhalb der Stützzellen liegen, dienen als Stammzellen,aus denen zeitlebens neue Riechzellen hervorgehen (Breipohl et al, 1986; Carr und Farbman,1993). Olfaktorische Neurone liefern somit ein Beispiel für die adulte Neurogenese vonStammzellen, ein interessantes, aber noch wenig erforschtes Gebiet.Die palisadenartig angeordneten Stützzellen halten die Neurone in einer stabilen Position undbegrenzen das Riechepithel zur Nasenhöhle hin. Die lateralen Membranen der am apikalenPol gelegenen Mikrovilli sind durch tight junctions mit den Membranen der Cilienknöpfeverknüpft und verhindern so eine Durchmischung des Mukus mit der interstitiellenFlüssigkeit. Stützzellen besitzen ähnliche Eigenschaften wie die Gliazellen desZentralnervensystems (ZNS). Sie phagozytieren abgestorbene olfaktorische Neurone, pufferndas extrazelluläre Milieu (Trotier, 1998; Getchell und Mellert, 1991; Getchell und Getchell,1982) und besitzen elektrische Eigenschaften, messbar als Ionenstrom über der Membran(Vogalis et al., 2004).Bei den PLC-β2-Zellen handelt es sich vermutlich um einen zweiten Typ chemosensorischerZellen, dessen Existenz und Beteiligung am olfaktorischen Prozess bereits 1975 durch F.Jourdan postuliert wurde. Morphologisch ähneln diese Zellen, die zu etwa 5% zum2

1 EinleitungRiechepithel beitragen, mehr den Stützzellen. Möglicherweise handelt es sich aber umsekundäre bipolare Neurone (Elsässer et al., 2005), deren Axone wahrscheinlich überafferente Neurone mit dem Gehirn in Verbindung stehen. Die PLC-β2-Zellen münden anihrem anterioren Ende in einem Mikrovilli-Saum mit Rezeptoren für Geruchsstoffe, die einenzum kanonischen Signalweg der Riechzellen alternativen Mechanismus in Gang setzen (Sklaret al., 1986; Boekhoff et al., 1990; Ronnett et al., 1993; Elsässer et al., 2005).1.2 Die olfaktorische TransduktionskaskadeDie olfaktorische Transduktionskaskade (Abb. 1.3) beginnt, wenn Geruchsstoffe aus derAtemluft an die Duftstoff-Rezeptoren der Cilienmembranen binden (Buck und Axel, 1991;Breer et al., 1994; Zufall et al., 1994; Freitag et al., 1998; Schild und Restrepo, 1998). BeiSäugern repräsentieren die Duftstoff-Rezeptoren mit etwa 1000 Vertretern die größte Familieder G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Firestein, 2001). Die nach Aktivierung desolfaktorischen G-Proteins (G olf ; Jones und Reed, 1989) dissoziierte α-Untereinheit stimulierteine membranständige Typ III-Adenylatzyklase (AC III; Pace et al., 1985; Pfeuffer et al.,1989; Bakalyar und Reed, 1990). Diese verstärkt das Signal, indem sie die Produktion voncyclischem AMP (cAMP) aus ATP katalysiert. Durch den schnellen Anstieg derintrazellulären cAMP-Konzentration (Sklar et al., 1986; Breer et al., 1990; Lowe und Gold,1993) öffnen cyclisch-Nukleotid gesteuerte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) in derPlasmamembran (Nakamura und Gold, 1987; Firestein et al., 1991; Frings et al., 1992) undleiten neben Natrium-Ionen verstärkt Calcium-Ionen in das ciliäre Lumen (Dzeja et al., 1999).Die höhere Leitfähigkeit des CNG-Kanals spielt eine untergeordnete Rolle bei derDepolarisierung der Membran, entscheidender ist der resultierende Anstieg der intrazellulärenCalcium-Konzentration [Ca 2+ ] i . Im mikromolaren Bereich bewirkt dieser die Öffnung Ca 2+ -aktivierter Chlorid-Kanäle (Kleene und Gestland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi und Yau,1993; Hallani et al., 1998) und den Ausstrom von Chlorid-Ionen. In isolierten ORNs trägtdieser Auswärtsstrom bis zu 80% des Rezeptor-Potentials (Lowe und Gold, 1993; Kleene,1997). Dies ist insofern ungewöhnlich, da Chlorid-Kanäle normalerweise in Nervenzellendurch Einstrom von Cl - inhibitorisch wirken. Die Ursache für den ungewöhnlichen Cl - -Effluxin ORNs liegt in der hohen intrazellulären Cl - -Konzentration im Bereich der Cilien (Reuter etal., 1998). Die Depolarsierung der Cilienmembran durch das Öffnen der CNG-Kanäle wirdalso zusätzlich durch den Ausstrom von Chlorid verstärkt und führt schließlich zur Auslösungvon Aktionspotentialen (Kawai et al., 1997; Duchamp-Viret et al., 1999).3

1 EinleitungAbb. 1.3 Schematische Darstellung der Signaltransduktion in olfaktorischenRezeptor-Neuronen der Maus. (R): G-Protein gekoppelter Riechrezeptor;(G olf ): olfaktorisches G-Protein; (CaMK): CaM-Kinase II; (AC):Adenylatzyklase Typ III; (A2, A4, B1b): Kanalproteine des CNG-Kanals;(grün): Ca 2+ -gesteuerter Cl - -Kanal; (PDE): Phosphodiesterase; (grünePfeile): excitatorische Wege; (rote Pfeile): inhibitorische Wege (siehe Text);(NKCC1): Chloridionen-Transporter; (NCX): Ca 2+ /Na + -Antiporter; (sieheText; verändert nach: Frings, 2001).Bei der Abschaltung des Signals erfüllt Ca 2+ erneut mehrere Funktionen: Im Komplex mitCalmodulin inhibiert Ca 2+ die Signalkaskade durch negative Rückkopplung, indem es denAbbau von cAMP durch die Aktivierung der Ca 2+ / Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase(PDE) stimuliert (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995). Zusätzlich führt die Aktivierung derCaM-Kinase II zur Phosphorylierung der Adenylatzyklase, die dadurch inaktiviert wird(Wayman et al., 1995; Wei et al., 1998). Ca 2+ / Calmodulin bindet außerdem mit hoherAffinität an Calmodulin-Bindestellen der CNG-Kanäle, deren Empfindlichkeit für cAMPdadurch um ein Vielfaches reduziert wird (Chen und Yau, 1994; Liu et al., 1994;Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004). Überschüssiges Ca 2+wird durch Na + / Ca 2+ -Austauscher entfernt. Das Zusammenwirken dieser Mechanismenbewirkt zunächst eine Adaption der Riechzelle, bis anschließend das Ruhepotentialwiederhergestellt ist.In dem zur olfaktorischen Signaltransduktion der Cilien alternativen Mechanismus derPLC-β2-Zellen wird kein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration beobachtet (Sklaret al., 1986). Stattdessen steigt die Konzentration an Inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP 3 ) stark4

1 Einleitungan (Restrepo et al., 1990; Fadool und Ache, 1992; Schild et al., 1995; Bruch, 1996;Kashiwayanagi et al., 1996; Kaur et al., 2001; Spehr et al., 2002). Es konnten verschiedeneProteine des InsP 3 -vermittelten Signalwegs in den Mikrovilli-tragenden Zellen innerhalb derStützzellschicht kolokalisiert werden. Dazu gehören die Phospholipase C (PLC-β2), derInsP 3 -Rezeptor Typ III (InsP 3 R-III) und ein TRP-Kanal (TRPC6, transient receptor potentialchannel 6). Der Anstieg von [Ca 2+ ] i nach Bindung von Duftstoffen an die Rezeptoren in denMikrovilli-Membranen wurde durch Ca 2+ -Imaging gezeigt. Es ist bisher noch nicht geklärt, obbestimmte Duftstoffe nur durch diesen Signalweg rezipiert werden oder ob diese so genanntenPLC-β2-Zellen modulatorisch wirken (Elsässer et al., 2005).1.3 Charakterisierung von Proteinen der SignaltransduktionMolekulare Details und funktionelle Zusammenhänge, die in der Vergangenheit zumVerständnis zellphysiologischer Abläufe beim Riechvorgang beigetragen haben, stammenhauptsächlich aus elektrophysiologischen und molekularbiologischen Untersuchungen. DieEntdeckung, dass Geruchsstoffe cAMP-vermittelte Signalwege in Gang setzen (Pace et al.,1985), lenkte die Aufmerksamkeit auf das olfaktorische System. Homologe Sequenzen zu denmolekularen Komponenten dieses Transduktionsweges waren für die Durchmusterung voncDNA-Banken längst verfügbar. G olf , AC III und die CNG A2-Untereinheit des CNG-Kanalskonnten mit dieser Strategie erfolgreich kloniert werden (Jones und Reed, 1989; Bakalyar undReed, 1990; Dhallan et al., 1990). Analog wurden 1991 die Gene der Geruchsrezeptorendurch Linda Buck und Richard Axel kloniert, wofür beide 2004 mit dem Nobel-Preisausgezeichnet wurden.Es scheint, als seien die Hauptkomponenten der olfaktorischen Transduktionskaskadeidentifiziert und durch Anwendung der Patch-Clamp-Technik (Hamill et al., 1981) anisolierten ORNs konnten bereits viele Eigenschaften der beteiligten Kanalproteine studiertwerden. Eine Reihe ungeklärter Fragen bleibt dennoch bestehen und Erkenntnisse werfenerneut Fragen auf. Zum Beispiel ist es auf Grund fehlender Homologien noch nicht gelungen,eine Aussage über die molekulare Struktur des Ca 2+ -gesteuerten Cl - -Kanals zu treffen (Frings,1999; Eggermont, 2003). Auch die räumliche Anordnung aller Interaktionspartner entlang derCilienmembran ist nur ansatzweise geklärt (Reisert et al., 2003). Regulatorische Prozesse unddie beteiligten Proteine, die bei der Adaptation eine Rolle spielen, sind ebenfalls nur teilweisebekannt. Über die Beteiligung alternativer Transduktionsmechanismen am Riechprozess kannbisher nur auf Grund lückenhafter Identifikation vorhandener Proteine gemutmaßt werden(Boekhoff et al., 1990; Steinlen et al., 1990; Breer und Boekhoff, 1991; Fülle et al., 1995;5

1 EinleitungSchild et al., 1995; Leinders-Zufall et al., 1996; Juilfs et al., 1997; Gold, 1999; Lischka et al.,1999; Meyer et al., 2000; Elsässer et al., 2005; eine Übersicht gibt Frings, 2001).Die Durchführung einer umfassenden Proteom-Studie, die auch die Identifizierungunbekannter Proteine ermöglicht, kann viel dazu beitragen, fehlende Glieder derSignaltransduktionskette aufzuspüren und ein detaillierteres Bild aller beteiligten Prozesse zuentwerfen.1.4 Protein-AnalytikDie massenspektrometrische Identifizierung (MS) von Proteinen, die zuvor durch ein- oderzweidimensionale Gelelektrophorese getrennt wurden, ist mittlerweile eine etablierteVorgehensweise in Proteom-Studien. Dabei werden die Proteine zunächst im Gelproteolytisch gespalten und die daraus eluierten Peptide anschließend massenspektrometrischanalysiert. Abbildung 1.4 zeigt im Überblick die unterschiedlichen MS-Strategien, die zurIdentifizierung und Charakterisierung der Proteine eingesetzt werden.6

1 EinleitungAbb. 1.4 Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Proteinidentifizierung(Erläuterungen im Text).Analyse-Zeiten konnten im Vergleich zur davor üblicherweise durchgeführten Edman-Sequenzierung (Edman, 1967), bei der Proteine schrittweise durch Modifikation undAbspaltung der N-terminalen Aminosäure abgebaut und die einzelnen Aminosäurenschließlich chromatographisch analysiert werden, erheblich verkürzt werden.1.4.1 Trennung von Membranproteinen durch GelelektrophoreseAufgrund der besseren Auflösung sind zweidimensionale Verfahren bei dergelelektrophoretischen Auftrennung komplexer Proteingemische zu bevorzugen. Dieklassische Methode der isoelektrischen Fokussierung (IEF), bei der Proteine in der erstenDimension entlang eines pH-Gradienten bis zur Stelle ihres isoelektrischen Punktes (IP)wandern (O´Farrell, 1975), ist jedoch zur Analyse von Membranproteinen meistens nichtgeeignet (Hartinger et al., 1996; Santoni et al., 2000; Navarre et al., 2002; Rais et al., 2004).Ursache dafür ist, dass viele Membranproteine aufgrund der Hydrophobizität ihrer transmembranenRegionen nur schwer löslich sind und deshalb insbesondere bei ihrem IPpräzipitieren. Eine Möglichkeit, Membranproteine dennoch quantitativ im Gel darzustellen,eröffnet sich durch die Wahl geeigneter Detergenzien. Im denaturierenden System hat sichbesonders der Einsatz kationischer Detergenzien in saurem Milieu bewährt (Macfarlane,1983; Macfarlane, 1989; Hartinger et al., 1996; Navarre et al., 2002). Auf Grund des saurenpH-Wertes (pH 3 - 4) werden einige lösliche Proteine noch im Probenpuffer gefällt undMembranproteine können neben ihrer verbesserten Löslichkeit angereichert werden.Im nativen System kann die Auftrennung ganzer Proteinkomplexe, inklusive allerInteraktionspartner, durch Einsatz nichtionischer Detergenzien erreicht werden (Hames,1990). Schägger und Jagow konnten diese Methode auch erfolgreich für die Aufreinigung vonMembranprotein-Komplexen etablieren (Schägger und Jagow, 1991; Schägger, 2003). Beidieser Methode ist zu berücksichtigen, dass der Trennerfolg wesentlich von der Art desDetergenz und dem Detergenz-zu-Protein-Verhältnis abhängt und nicht für alle Komplexeeines Proteingemischs eine Wahl gleichermaßen geeignet ist.7

1 Einleitung1.4.2 MassenspektrometrieDie Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Detektion von Molekülmassen imHochvakuum. Im Massenspektrometer werden die zu analysierenden Probe-Moleküle durchIonisierung geladen und in einem Massenanalysator gemäß ihres Quotienten aus Masse zuLadung aufgetrennt. Der Detektor verstärkt in der Regel das Signal und liefert einMassenspektrum, das die Massen der unterschiedlichen Ionen abbildet. Abbildung 1.5 zeigtdie grundlegenden Funktionseinheiten eines Massenspektrometers.Abb. 1.5 Funktionseinheiten eines Massenspektrometers mit Anwendungsmöglichkeiten(verändert nach Waters, Massachusetts, USA; www.waters.com).1.4.2.1 Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-AnalytikJ.J. Thomson hat nach seiner Entdeckung des Elekrons, Voraussetzung für die Anwendungder Elektronenstoß-Technik, bereits 1899 den ersten Massenspektrometer entwickelt. Eshandelt sich also um ein recht altes Verfahren. Die Analyse von Makromolekülen, zu denenauch die Proteine gehören, gelang allerdings erst ab 1976 nach Einführungmassenspektrometrischer Desorptionsmethoden (MacFarlane, Torgerson, 1976), bei denenAnalyte schonender durch Beschuss mit beschleunigten Primärteilchen (z.Bsp Cäsium-Ionen,Argon, Photonen) ionisiert werden. Vorher standen keine geeigneten Ionisierungstechnikenzur Verfügung. Die Chemische- oder Elektronenstoß-Ionisation konnte erfolgreich nur aufMoleküle bis 400Da angewendet werden, Makromoleküle jedoch zerfielen unter diesenBedingungen.Mit der Einführung der Fast Atom Bombardment-Technik (FAB, Barber, 1981) wurden beider Ionisation erstmals Matrizes in kristalliner oder schwerflüchtiger flüssiger Form8

1 Einleitungeingesetzt. Die Proben werden mit einer Matrix-Substanz (z. B. Glycerin,4-Nitrobenzylalkohol) gemischt. Die hohe kinetische Energie beim Beschuss dieser Mischungmit Primärteilchen führt zu einer Kollisionskaskade der Moleküle. Dabei werdenSekundärpartikel erzeugt, die in die Gasphase diffundieren. Unter diesen Sekundärpartikelnbefinden sich unter anderem Protonen und die zu analysierenden Probe-Ionen. Die Matrixunterstützt bei diesem Vorgang einerseits die effektive Energieübertragung und stellt die zurIonisierung notwendigen Protonen zur Verfügung, andererseits absorbiert sie einen Großteilder kinetischen Energie der Primärpartikel und verhindert dadurch die Zersetzung der Probe.Ihren Höhepunkt fand diese Art der schonenden Ionisierungstechnik mit der Etablierung derMatrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI, Abb. 1.6) 1988 durch Tanaka undgleichzeitig unabhängig durch Karas und Hillenkamp.Abb. 1.6 Schematische Darstellung der MALDI-Technik, beider die Probemoleküle fest in das Kristallgitter der Matrixintegriert werden. Durch die Energie eines gepulsten Laserswerden Matrix- und Probemoleküle in die Gasphase überführt,in der schließlich die Ionisation stattfindet.MALDI bildete zusammen mit der durch Fenn et al. 1989 eingeführten ElectrosprayIonisation (ESI) großer Biomoleküle die Voraussetzung für die Etablierung derMassenspektrometrie als eine der wichtigsten Analyse-Methoden in der Peptid- undProteinanalytik.Bei der ESI (Abb. 1.7), der zur Zeit mildesten Ionisierungstechnik (Cole, 1997), könnenAnalyte bis 100kDa ionisiert werden. Die sanfte Ionisierung konnte besonders deutlich beider Detektion nichtkovalenter Wechselwirkungen durch Ganem, 1991 und Katta, 1991demonstriert werden. Die Methode zeichnet sich durch eine erhöhte Sensitivität aus, da imGegensatz zu MALDI keine einfach, sondern mehrfach geladenen Ionen erzeugt werden, die9

1 Einleitungleichter analysiert werden können (Westermeier, 2002). Substanzen können auch auskomplexen Gemischen in sehr geringer Konzentration nachgewiesen werden.Bei der Ionisierung befindet sich die gelöste Probe in einer wenige µm dicken Kapillare. DieIonenbildung erfolgt bei Atmosphärendruck direkt aus der Lösung. Dazu wird zwischen derSpitze der Kapillare und dem Eingang zum Massenanalysator eine Hochspannung von etwa3,5 kV angelegt. Gelangt die Analyt-Lösung in dieses starke elektrische Feld, dispergiert siein kleine geladene Tröpfchen, ein Vorgang, der durch einen scherenden Gasstrom ausStickstoff oder synthetischer Luft, der kontinuierlich aus einer koaxialen Stahlkapillareaustritt, zusätzlich unterstützt wird. Ein zweiter wärmender Gasstrom, meist Stickstoff, dientals Trocknungsgas. Um die Spitze der Kapillare beobachtet man einen konusförmigerweiterten Teilchenstrom, eine Erscheinung, die "Taylor cone" bezeichnet wird. Dieeigentliche Ionenbildung ist noch nicht vollständig verstanden und beginnt, wenn diegeladenen Tröpfchen des Aerosols auf dem Weg zum Massenanalysator durch Verdampfungdes Lösemittels zunehmend an Größe verlieren. Dadurch steigt die Ladungsdichte an derOberfläche. Die abstoßenden Coulomb-Kräfte zwischen gleichnamigen Ladungen bewirkenden Zusammenbruch der Oberflächenspannung. Dieser explosionsartige Prozeß führt dazu,dass Ionen austreten.Abb. 1.7 Vereinfachte Darstellung der Ionenbildung durch die Electrospray-Methode(ESI). Die Ionisierung erfolgt bei Atmosphärendruck ("atmospheric pressureionization", API), die Massenanalyse im Vakuum. Detailierte Beschreibung, derAbläufe: siehe Text.1.4.2.2 Massen-Analyse und Strategien der Protein-IdentifizierungAls besonders schnell und weitgehend automatisierbar hat sich der heute häufig gebrauchte"Peptidmassen-Fingerprint" (PMF) herausgestellt (Henzel et al.,1993; Mann et al., 1993;Yates et al., 1993). Nach dem tryptischen Verdau werden die erhaltenen Peptide durch10

1 EinleitungMALDI-MS analysiert. Die experimentell ermittelten Massen werden dann mit dentheoretischen Massen tryptischer Fragmente von Proteinen aus Datenbanken verglichen.Allerdings können nur bekannte Proteine mit dieser Methode zuverlässig identifiziert werden.Ein weiterer Nachteil ist, dass möglichst viele Peptide eines Proteins analysiert werdenmüssen, um eine genügend hohe Treffsicherheit bei der Datenbank-Recherche zugewährleisten. Dies setzt voraus, dass die Probe möglichst rein und nicht zu komplex ist, da ineinem Gemisch mengenmäßig unterrepräsentierte Proteine hinter den starken Signalenprominenter Proteine verschwinden. MALDI-Ionenquellen sind mehrheitlich an Time ofFlight (ToF) Analysatoren (Stephens, 1946) gekoppelt. Die Ionen werden durch Anlegeneiner Hochspannung in den Massenanalysator beschleunigt. Die Geschwindigkeit eines Ionsbei einer konstanten Beschleunigungsspannung ist umgekehrt proportional zu der Masse desIons. Die Flugzeit T ergibt sich aus dem einfachen Zusammenhang:1⋅ m ⋅ v22= z ⋅ e ⋅U2LT = ⋅ 2 ⋅e⋅Umz∩Lv =Tm = Massev = Geschwindigkeitz = Ionen − Ladunge = ElementarladungU = BeschleunigungsspannungL = FlugstreckeDie Ursache für die vergleichsweise geringe Sensitivität bei der ToF-Analyse liegt in dergeringen Ladung der Fragmente (vgl. 1.4.3.1) und in der beschränkten Detektionskapazitätaller gleichzeitig eintreffenden Signale.Wie in Abbildung 1.5 bereits angedeutet, werden nicht nur Flugzeit-Analysatoren zurIonentrennung verwendet. Auch Massenfilter, so genannte Quadrupole (Paul, Steinwedel,1953) können eingesetzt werden. Ein Quadrupol (Q) besteht aus vier parallelen, zylindrischenMetallstäben (Abb. 1.8a). An den Stäben liegt eine Gleichspannung und eineWechselspannung im Hochfrequenz-Bereich (3kHz- 300MHz) an, wobei gegenüberliegendeStäbe die gleiche Polarität der Gleichspannung und die gleiche Phase der Wechselspannungbesitzen. Ionen gleicher Masse und gleicher Ladung, so genannte resonante Ionen,beschreiben auf der feldfreien z-Achse eine komplizierte oszillatorische Flugbahn undpassieren die Öffnung der Quadrupollinse. Nichtresonante Ionen dagegen kollidieren mit denQuadrupol-Stäben. Ob ein Ion resonant oder nichtresonant ist, hängt von seiner Masse undvon der angelegten Gleich- und Wechselspannung ab. Durch Variation der Wechsel-Spannung können verschiedene Ionen auf die richtige Flugbahn in Richtung Detektor11

1 Einleitunggebracht werden. Je nach Betriebsmodus (Abb. 1.8b) können diese Ionen gleicher oderverschiedener Massen sein.abAbb. 1.8a Darstellung eines Quadrupol-Massenanalysators mit der Flugbahn eines resonanten und nichtresonantenIons. Resonante Ionen passieren die Quadrupollinse (blau) und werden detektiert.Abb. 1.8b Betriebsmodi eines Quadrupols: Im mass scanning-Modus wird das ganze Ionenspektrum(verschiedenfarbig) dargestellt. Im single mass transmission-Modus erreicht nur ein Ionen-Typ (mint) denDetektor.Kombiniert mit ToF-Analysatoren werden Quadrupole zusammen mit ESI-Quellen zurSequenzierung von Proteinen genutzt. Die Ionenbildung aus der Lösung (1.4.3.1) ermöglichtzudem eine Vortrennung durch HPLC (High Performance oder High Pressure LiquidChromatography). Kapitel 1.4.3.3 beschreibt eine besonders effiziente massenspektrometrischeMethode, die es ermöglicht, unbekannte Proteine auch in geringen Mengen auskomplexen Gemischen zu identifizieren.1.4.3.1 Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToFBei der Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Analyse wird die gelöste Probe bei besonders niedrigenFlussraten im Nanoliter-Bereich (20 -250nL/ min) der Ionenquelle zugeführt, man sprichtdeshalb auch von Nanospray-Ionisation (Wilm, Mann, 1996). Durch die verlängerte Messzeitkönnen Probenmengen im µl-Bereich analysiert werden. Auch Proteine, die nur in geringenMengen im Gemisch vertreten sind, werden durch Streckung des Messvolumens in einemausreichend großen Zeitfenster erfasst. Die Sensitivität der Messung ist im Vergleich zurPeptidmassen-Fingerprint-Methode deutlich erhöht (Emmett, Caprioli, 1994).Die niedrigen Flussraten werden durch das Pumpensystem einer vorgeschalteten HPLC-Anlage gewährleistet (Nano-LC). Zur Vortrennung der Protein-Gemische werden ReversePhase-Säulen mit apolarem Füllmaterial benutzt. Das Füllmaterial, die so genannte stationäre12

1 EinleitungPhase, besteht üblicherweise aus porösen Silica-Kugeln (Silicagele), die an ihrer Oberflächealiphatische C18-Ketten tragen und deren Porenweite zur Protein-Aufreinigung idealerweise30nm beträgt. Das Lösemittel der Probe wird bei chromatographischen Trennverfahren alsmobile Phase bezeichnet. Üblich sind Wasser/ Acetonitril-Gradienten mit steigenderHydrophobizität. Zu Beginn werden also apolare Proteine von der stationären Phasezurückgehalten, während polare Proteine in der mobilen Phase verbleiben. Ein Anstieg derHydrophobizität in der mobilen Phase bewirkt, dass zunehmend hydrophobe Proteine von derSäule eluiert werden, so dass apolare Proteine zuletzt den Massenspektrometer erreichen.Die Sequenzierung von Proteinen kann nur in so genannten Tandem-Massenspektrometerndurchgeführt werden. Solche Massenspektrometer besitzen mehrere Analysatoren und eineinterponierte Kollisionszelle, die mit einem inerten Stoß-Gas, meist Argon, befüllt ist.Abbildung 1.9 zeigt den Aufbau des Tandem-Massenspektrometers, wie er in dieser Arbeitzur Protein-Identifizierung verwendet wurde.Abb. 1.9 Schematische Darstellung des Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Spektrometers. Die Ionenwerden zur Kathode am Eingang des Spektrometers beschleunigt und gelangen in denMassenanalysator Q 0 und dann in Q 1 , wo bestimmte Ionen herausgefiltert werden, die dann in derKollissionszelle Q 2 fragmentiert werden. Die Fragmente werden erneut beschleunigt und tretendurch eine Quadrupollinse in den ToF-Analysator ein, der mit einem Reflektor ausgestattet ist unddie Ionen vor der Detektion umlenkt (Erläuterung: Text). L/s: Sog-Leistung der Vakuum-Pumpe;(verändert nach Waters, Massachusetts, USA; www.waters.com).13

1 EinleitungDie Ionen gelangen aus der ESI-Quelle durch eine Öffnung im Zentrum der Gegenelektrodein den Analysatorteil des Massenspektrometers. Durch Q0, der ausschließlich im massscanning-Modus (Abb 1.8b) arbeitet, werden die Ionen kollisionsfrei auf die richtige Bahnzum eigentlichen Massenfilter Q1 weitergeleitet. Q1 filtert im single mass transmission-Modus Ionen mit einem konstanten Masse zu Ladungs-Quotienten heraus. Nur dieseVorläufer-Ionen ("Precursor") werden zu einem bestimmten Zeitpunkt in die Kollisionszellebeschleunigt, wo sie durch Kollision mit Argon-Atomen in viele verschiedene "Tochter-Ionen" fragmentiert werden (Abb. 1.10).Bei einer Kollisions-Energie von 10 - 100eV dissoziieren die Vorläufer-Ionen vorrangigzwischen Carbonyl-Kohlenstoff und Amid-Stickstoff entlang des Peptidrückgrats und bildensequenzspezifische Ionenserien (Roepstorff und Fohlman 1984).Abb. 1.10 Mögliche Bruchstellen des Peptid-Rückgratsder Precursor-Ionen; (rot) am häufigsten betroffen, esresultieren Ionen des b-oder y-Typs; (a, c, x, z) Ionentypen,die seltener entstehen (verändert nach:www.matrixscience.com).Die meisten Ionen sind vom b-oder y-Typ. Verbleibt nach der Spaltung die Ladung am N-terminalen Ende des Fragmentions, entsteht ein b-Typ Ion. Verbleibt sie am C-Terminus,wird ein y-Typ Ion gebildet.Die so gebildeten Fragment-Ionen werden erneut beschleunigt und gelangen in den vertikalzur Kollisionszelle angeordneten ToF-Analysator, wo sie durch ein elektrisches Pulsfeldumgelenkt werden. Da die Ionen nicht auf gleicher Höhe in den Analysator gelangen, werdensie nach halber Flugstrecke von einem Reflektor (Abb. 1.9) gespiegelt, der als„Ionensammler“ dient, so dass Fragmente gleichen Typs von dort aus zur gleichen Zeit inRichtung Detektor aufbrechen und gemäß ihres Masse zu Ladungs-Quotienten auch zurgleichen Zeit dort eintreffen. Durch diese Fokussierung wird die Auflösung des14

1 EinleitungToF-Analysators deutlich verbessert und dadurch auch die Genauigkeit der Messung, da sogargleiche Ionen verschiedener Isotope im Spektrum durch einen separaten Peak dargestelltwerden. Die Genauigkeit der Messung liegt im Bereich von +/- 0,1 Da.Zur Detektion wird ein Mehrkanal-Detektor verwendet. Beim Auftreffen geladener Teilchenauf die unter Hochspannung stehenden Platten des Detektors werden Elektronenströmeerzeugt, die sich lokal fortpflanzen und das Signal verstärken.1.5 Ziel dieser ArbeitDas Ziel dieser Arbeit ist die Isolierung ciliärer Membranen vom olfaktorischenGesamtepithel der Ratte und die Etablierung einer gelelektrophoretischen Trennmethode umdie dort lokalisierten Membranproteine vollständig und in hoher Auflösung darzustellen. Mitdieser Methode soll es im Anschluss durch MS-Analyse möglich sein, unbekannte Proteine zuidentifizieren und dadurch ein verfeinertes Bild aller beteiligten Prozesse derSignaltransduktionskaskade zu entwerfen.15

2 Material und Methoden2 Material und Methoden2.1 Chemikalien und MaterialDie Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, in p.a.-Qualität von den FirmenAmersham Biosciences (Freiburg), AppliChem (Darmstadt), Carl Roth GmbH (Karlsruhe),Fluka Chemie GmbH (Buchs, CH), Grüssing (Filsum), J.T. Baker (Deventer, NL), MBIFermentas GmbH (St. Leon-Rot), Merck KGaA (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze), ServaElectrophoresis GmbH (Heidelberg) und Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) bezogen.Zum Ansetzen der Lösungen wurde ausschließlich Wasser aus der Milli-Q UF Plus-Anlageder Fa. Millipore verwendet, für die nano-HPLC und Massenspektrometrie Wasser in HPLC-Qualität.Die Gelelektrophorese wurde in den Kammern PerfectBlue TM Vertical ElectrophoresisSystem, Model Twin S und Twin M der Fa. peqLab Biotechnologie GmbH (Erlangen)durchgeführt. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren mit der Blot-Apparatur SV20-SDB der Fa. Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim) auf porablot ® PVDF-Membranen mit einerPorengröße von 0,2µm der Fa. MACHEREY-NAGEL (Düren).Die Aktivität der Meerrettich-Peroxidase wurde durch ECl TM Plus detektiert und die Filme(Hyperfilm TM ECl TM ) im Hyperprocessor TM Automatic Film Processor, sofern nicht andersangegeben, entwickelt. Das Detektionssystem, die Filme und die Entwickler-Maschinestammen von der Fa. Amersham Biosciences (Freiburg).16

2 Material und Methoden2.2 Lösungen2.2.1 Lösungen für die Präparation2.2.1.1 Lösungen für die Cilien-PräparationStamm-Lösung P120mM NaCl5mM KCl1,6mM K 2 HPO 425mM NaHCO 37,5mM D-GlucosepH 7,4Calciumchlorid-Stammlösung2M CaCl 2 x 2H 2 OLösung A Protease Inhibitor M (Tab. 2.1):1/ 100 des Gesamtvolumens in Stamm-Lösung Pkurz vor Gebrauch angesetztLösung BSaccharose-Lösung10mM CaCl 2 x 2H 2 O in Lösung Akurz vor Gebrauch angesetzt45% (w/ v) Saccharose2.2.1.2 Lösungen für die Protein-Präparation aus GesamtepithelPuffer A20mM NaCl1mM EDTA0,1mM EGTA1mM DTT20mM HEPESpH 7,4Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)1Tablette/ 50ml0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin17

2 Material und MethodenPuffer BPuffer C (M)500mM NaCl1mM EDTA0,1mM EGTA1mM DTT20mM HEPESpH 7,4Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)1Tablette/ 50ml0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin150mM NaCl1mM EDTA0,1mM EGTA1mM DTT20mM HEPESpH 7,4Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)1Tablette/ 50ml0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin2.2.1.3 Verwendete Protease-InhibitorenDie bei den Präparationen verwendeten Lösungen (2.2.1.1 und 2.2.1.2) enthielten Protease-Inhibitoren um den proteolytischen Abbau von Proteinen durch freiwerdende endogeneProteasen zu verhindern.Bei der Cilienpräparation wurde der EDTA- und EGTA-freie Protease-Inhibitor Mix M(Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Tab. 2.1) verwendet um die Chelatierung vonCalcium-Ionen auszuschließen. Der Complete Protease Inhibitor Cocktail in Tablettenformstammte von der Fa. Roche Diagnostics (Penzberg). Metalloproteasen wurden zusätzlichdurch o-Phenanthrolin gehemmt, das bevorzugt bivalente Schwermetall-Ionen (u.a. Zn 2+ )komplexiert.18

2 Material und MethodenInhibitorZielproteasenAEBSF-HClviele Serin-Proteasen (u.a. Thrombin)Aprotininviele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase)Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B)E-64 Papain (Cystein-Protease)Leupeptinu.a. Phospholipase DPepstatin AAspartat-Proteasen (u.a. Pepsin, Renin)Tab. 2.1 Inhibitoren und Zielproteasen des Protease Inhibitor Mix M (Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg).InhibitorZielproteasenAPMSF-HClSerin-Proteasen (u.a. Trypsin)Aprotininviele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase)Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B)3,4-Dichloroisocumarinviele Serin-Proteasen (u.a. Elastase)E-64 Papain (Cystein-Protease)Leupeptinu.a. PhospholipaseDPefabloc SCSerin-Proteasen (u.a. Thrombin)PhosphoramidonThermolysin, CollagenaseTab. 2.2 Inhibitoren und Zielproteasen des Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Penzberg).2.2.2 Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-MethodeTris/ SDS-Lösung1M Tris/ HClpH 7,51% (w/ v) SDSFärbe-Lösung0,5% (w/ v) Amidoschwarz B1045% (v/ v) Methanol10% (v/ v) EssigsäureEntfärbe-Lösung90% (v/ v) Methanol2% (v/ v) EssigsäureElutions-Lösung50% (v/ v) Ethanol25mM NaOH50µl EDTA19

2.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase2 Material und MethodenPB-PufferPuffer C10mM Tris100µM PMSF10mM β-Mercaptoethanol3mM MgCl 2 x 6H 2 OpH 8,010mM Tris3mM MgCl 2 x 6H 2 O2mM EGTApH 7,42.2.4 Lösungen für die SDS PAGE5x-Probenpuffer20x DTT10% (v/v) Glycerol2% (w/v) SDS0,01% (w/v) Bromphenolblau62,6mM Tris pH6.82M DTTLagerung: -20°CGebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N´-Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1Sammelgelpuffer 1M Tris/ HCl, pH 6,8Trenngelpuffer 1M Tris/ HCl, pH 8.8SDS-LösungAPS-Lösung10% (w/v) SDS10% (w/v) AmmoniumperoxodisulfatGebrauchsfertige 99% Tetramethylendiamin-Lösung (TEMED)10x Elektrodenpuffer0,25M Tris1,92M Glycin2% (w/v) SDSpH 8.320

2 Material und Methoden2.2.5 Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE2x Probenpuffer6M Harnstoff0,2% (w/v) CTAB10% (v/v) Glycerol75mM DTT0,05% (w/v) PyroninYkurz vor Gebrauch angesetztGebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N´-Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1Stabilisierte, gebrauchsfertige, 2%ige N,N´-Methylenbisacrylamid-StammlösungSammelgelpuffer 0,3M KH 2 PO 4pH 4.1Trenngelpuffer 0,3M KH 2 PO 4pH 2.1Ascorbinsäure-LösungCTAB-LösungEisensulfat-LösungH 2 O 2 -Lösung1x Elektrodenpuffer (CTAB)80mM Ascorbinsäurekurz vor Gebrauch angesetzt250mM CTABkurz vor Gebrauch angesetzt25mM Fe(II)SO 4 x 7H 2 Okurz vor Gebrauch angesetzt0,03% (v/v) Wasserstoffperoxid150mM Glycin0,1% (w/v) CTAB50mM H 3 PO 4SDS-Lyse-Puffer 1/ 5 des Endvolumens 5x Probenpuffer (2.2.3)37,5mM DTT1mM PMSF18mM Tris, pH 6.8kurz vor Gebrauch angesetzt21

2 Material und MethodenSDS-PAGE-Lösungen (siehe 2.2.3)2.2.6 Lösungen für die MS-kompatible SilberfärbungFixier-Lösung30% (v/v) Ethanol10% (v/v) EssigsäureSensitisationslösung 9,9mM K 2 O 6 S 40,5M Kaliumacetat30% (v/v) EthanolSilbernitrat-Lösung 11,8mM AgNO 3Entwickler-Lösung 0,22M K 2 CO 35µM Na 2 S 2 O 3 x 5H 2 O0,011% (v/ v) FormaldehydStopp-Lösung0,33M Tris2% (v/ v) Essigsäure2.2.7 Lösungen für die colloidale Coomassie-FärbungFixier-LösungInkubationslösung50% (v/v) Methanol2% (v/v) Essigsäure34% (v/v) Methanol2% (v/v) H 3 PO 417% (w/v) (NH 4 ) 2 SO 4Färbe-Lösung34% (v/v) Methanol2% (v/v) H 3 PO 417% (w/v) (NH 4 ) 2 SO 40,066% (w/v) Coomassie G-25022

2 Material und Methoden2.2.8 Lösungen für die Western Blot-AnalyseTransferpuffer1x PBSMilchpulver-Blocklösung25mM Tris0,19M Glycin20% (v/v) MethanolpH 8,3 - 8,48,1mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 O1,9mM NaH 2 PO 4 x H 2 O0,13M NaClpH 7,45% (w/v) Milchpulverin 1x PBSLagerung: 4 - 8°C; 0,02% NaN 3Milchpulver-Verdünnungslösung1% (w/v) Milchpulverin 1x PBSkurz vor Gebrauch angesetztWasch-Puffer 0,1% (v/v) Triton X-100in 1x PBSECL-Plus Detektionslösung Lösung A zu Lösung B im Verhältnis 40:1kurz vor Gebrauch angesetzt,lichtempfindlich2.2.9 Lösungen für den tryptischen Verdau der ProteineAcetonitril/ H 2 O50% (v/v) AcetonitrilBicarbonat-Puffer 40mM NH 4 HCO 3DTTIodacetamid10mM DTT55mM Iodacetamidin Bicarbonat-Pufferkurz vor Gebrauch angesetzt,lichtempfindlich23

2 Material und MethodenTrypsin-StocklösungTrypsin-GebrauchslösungLyophilisat + 40µl 1mM HCl1Woche bei -20°C haltbar10µl Trypsin-Stocklösung290µl Bicarbonat-Puffer2.3 Größenstandards und Antikörper2.3.1 Größenstandards für die Gelelektrophorese2.3.1.1 Größenstandard für die SDS-PAGESowohl für die eindimensionale als auch für die zweite Dimensionder zweidimensionalen Gelelektrophorese dienten rekombinante, inE.coli exprimierte Farbstoff-gekoppelte Proteine des PageRulerTMProtein Ladder (ready to use) SM0671 mit Molekulargewichten von~ 10 000 bis 180 000Da (Dalton) der MBI Fermentas GmbH (St.Leon-Rot). Die Konzentrationen der einzelnen Proteine liegenzwischen 0,1 - 0,2mg/ ml.Abb. 2.1 SM0671Für Gele der Größe 5,5 x 8,5cm wurde ein Volumen von 5µl eingesetzt, 7µl bei einerGelgröße von 11 x 14cm. Die Dicke der Gele in beiden Kammersystemen TwinS und TwinM(2.1) betrug 1,5mm.24

2 Material und Methoden2.3.1.2 Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGEFür die CTAB-PAGE wurde der „High MolecularWeight Marker“ (HMW-Größenstandard)SDS-6H der Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet. Die Proteine desLyophilisats wurden in 0,75ml H 2 O gelöst und mit 0,75ml 2x Probenpuffer (2.2.4) versetzt.Die Gesamtkonzentration der Lösung betrug 2mg/ ml.Molekulargewicht (Da)Protein205 000 Myosin116 000 beta-Galactosidase97 000 Phosphorylase B66 000 Rinderserum Albumin45 000 Ovalbumin29 000 CarboanhydraseTab. 2.3 Proteine und Molekulargewichte HMW-Größenstandards SDS-6H.Vor dem Einsatz wurde der Marker 5min bei 70°C im Heizblock erwärmt, gevortext und mit13.000g zentrifugiert. Ein Volumen von 8µl aus dem Überstand pipettiert erwies sich als idealbei einer Gelgröße von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm.25

2 Material und Methoden2.3.2 Antikörper für die Western Blot-AnalyseDie verwendeten Antikörper dienten ausschließlich dem immunologischen Nachweis vonMarkerproteinen („Präparationsmarkern“) bei der Western Blot-Analyse (2.10).2.3.2.1 Primäre AntikörperName Antigen Größe Spender Isotyp Spezifität Herstellerα- ACIIIα-CNGA2α-CNGA4α-G α s/ olfα-Occludinα-ProhibitinC-TerminusAdenylatcyclaseIII der RatteC-terminalR643-660CNG- A2 derRatteC-TerminusCNG- A4 derRatteC-Terminusα s -UEolfaktorischesG- Protein derRatteN-TerminusOccludin desMenschenMitochondrialesGesamtproteinder Ratte128,9kDaGlykosylierungmöglich76,2kDaGlykosylierungmöglichKaninchenKaninchenPolyklonale,affinitätsgereinigteIgGPolyklonale,affinitätsgereinigteIgGrt, ms,hmrb, ms, rb65,6kDa Maus Monoklonal rt44,2kDa65kDaPhosphorylierungmöglichKaninchenZiegePolyklonale,affinitätsgereinigteIgGPolyklonale,affinitätsgereinigteIgG~30kDa Kaninchen Polyklonale IgGTab. 2.4 Spezifikation der Erst- Antikörper für die Western Blot-Analyse.rt, ms,hmrt, ms,hmrt, ms,pg, ch,hmSanta CruzBiotechn.Inc.,HeidelbergSigma-AldrichChemie GmbH,SteinheimCaliforniaInstitute ofTechnology,PasadenaSanta CruzBiotechn.Inc.,HeidelbergSanta CruzBiotechnologiesInc., heidelbergAbcamLimited,Cambridge2.3.2.2 Sekundäre AntikörperDie Antigen-Antikörper Komplexe wurden mit Zweit-Antikörpern nachgewiesen, die anMeerrettich-Peroxidase gekoppelt waren.Name Antigen Spender Isotyp Spezifität HerstellerPolyklonaleSigma-AldrichKaninchenIgG,gereinigt durch KaninchenZiegeChemie GmbH,IgGIonenaustausch- IgGSteinheimChromatographieα-rb IgGHRPkonjugiertα-gt IgGHRPkonjugiertα-ms IgGHRPkonjugiertZiegen IgGMaus IgGKaninchenZiegePolyklonale,affinitätsgereinigteIgGPolyklonale,affinitätsgereinigteIgGZiege IgGMaus IgGSigma-AldrichChemie GmbH,SteinheimSigma-AldrichChemie GmbH,SteinheimTab. 2.4 Spezifikation der Meerrrettich-Peroxidase konjugierten Zweit-Antikörper für die Western Blot-Analyse.26

2 Material und Methoden2.4 TiereFür die Präparation des olfaktorischen Epithels wurden 8 - 12 Wochen alte weibliche Wistar-Ratten (Rattus norvegicus) verwendet. Die Ratten stammten aus dem Zentralen Tierlabor(ZTL) der Universität Heidelberg, wo sie unter standardisierten Bedingungen bei einemkünstlichen Tag-Nacht-Rhytmus gehalten werden. Lieferant des ZTL ist die Fa. Charles RiverLaboratories Inc. (Bad Königshofen).2.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem EpithelDie in der nachfolgend beschriebenen Methode verwendeten Lösungen und Gefäße wurdenstets eisgekühlt oder vor Beginn der Präparation im Kühlraum bereitgestellt.2.5.1 Präparation und Isolierung des GesamtepithelsZur Charakterisierung ciliärer Proteine musste zunächst das Gesamtepithel isoliert werden.Dazu wurden die Ratten in CO 2 getötet und anschließend dekapitiert.Die Köpfe wurden kurz in eiskalter Stamm-Lösung P gekühlt und von Blut befreit. Das Fellwurde mit der Präparier-Schere entfernt. Durch das Hinterhauptsloch wurde entlang derkoronalen Naht ein Schnitt vom posterioren Ende nach anterior (Abb. 2.2) bis knapp vor dasStirnbein geführt und die Nase sagittal in der Ebene des Septums aufgebrochen.Abb. 2.2 Schädel der Ratte. Mit der Präparier-Scherewurde ein Schnitt entlang der koronalen Naht geführt.Das Riechepithel liegt scheibchenförmig im Dach der Nasenhöhle und hebt sich auf Grundseiner gelbbraunen Pigmentierung und seiner stapelartigen Anordnung in den Konchen gut27

2 Material und Methodenvon seiner Umgebung ab (Abb. 2.3). Die Scheibchen wurden direkt mit einer feinen Pinzetteentnommen, in Stamm-Lösung P durch kurzes Eintauchen gewaschen und so von eventuellnoch anhaftenden Haaren und Blutresten befreit. Dann wurden sie in ein 8ml Schnappdeckel-Glas (neoLab, Heidelberg) mit Lösung A überführt.Abb. 2.3 Sagittalschnitt durch den Kopf der Ratte. Dasolfaktorische Epithel (OE) hebt sich mit seiner gelbbräunlichenPigmentierung deutlich von der Umgebungab. Rechts davon befinden sich Bulbus olfactorius (BO)und Siebbein (SB). Davor respiratorisches Epithel (RE).2.5.2 Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock MethodeDie Decilierung der Riechzellen wurde durch die Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967)erreicht. Der Calcium-Schock ist eine von mehreren Methoden (Sandoz, 1988), die durchmechanischen Stress die Abschnürung ciliärer Membranen verursacht. Es ist unbekannt, obder Einfluss von Calcium-Ionen den Zusammenbruch der Cilienstruktur direkt durchDepolymerisation der Mikrotubuli bewirkt. Möglich ist auch die Aktivierung spezifischerProteasen, die durch Hydrolyse Bestandteile des tubulären Systems destabilisieren (Sandoz,1988).Pro Schnappdeckel-Glas wurden die Epithelien von fünf Ratten in 3ml Lösung A gewaschen.Der Überstand wurde vorsichtig und möglichst vollständig mit einer 5ml Gilson-Pipetteabgenommen und das Epithel in 4ml Lösung B, die 10mM Calcium-Ionen enthält,aufgenommen. Die Herstellung von Lösung B gehört zu einem der kritischen Schritte derPräparation: Die Zugabe der Calcium-Stammlösung zu einem Teil von Lösung A sollte sehrlangsam und unter heftigem Rühren erfolgen, da sonst schwerlösliches (Ca) 3 (PO 4 ) 2präzipitiert und freies Ca 2+ nicht mehr für den Calcium-Schock zur Verfügung steht.28

2 Material und MethodenAnschließend wurde 30min bei 4°C und Stufe 4 (IKAMAG RH, Janke und Kunkel KG,Staufen) Rührfisch, Grösse 12 x 5mm (neoLab, Heidelberg) gerührt (Abb. 2.4).Abb. 2.4 Calcium-Schock der OlfaktorischenEpithelien unter Rühren im Schnappdeckel-Glas.Danach wurde der gesamte Ansatz in ein 10ml Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen (neoLab)überführt und mit 7700g 5min bei 4°C zentrifugiert (Hermle-Kühlzentrifuge, HERMLE-Labortechnik, Wehingen). Der Überstand mit den Cilien wurde in ein 15ml Falcon-Röhrchenüberführt und das Pellet erneut in 2ml Lösung B resuspendiert und mit 7700g 5min bei 4°Czentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem Überstand der vorherigen Zentrifugation vereint.Der letzte Zentrifugationsschritt wurde noch einmal wiederholt, die Gewebepellets wurdenbei -20°C gelagert.Die vereinten Überstände wurden in einem 12ml Ultrazentrifugen-Röhrchen (BeckmanCoulter GmbH, Krefeld) auf 4ml 45% Saccharose-Lösung geschichtet und mit 100 000g30min bei 4°C ultrazentrifugiert (Beckman L-70 Ultra-Zentrifuge, SW40 Ti-Rotor).Die Cilienbande befindet sich nach der Ultrazentrifugation sichtbar alsdichter, dunkler Nebel auf der Saccharose des Stufengradienten.Abb. 2.5 Die dunkle Cilienbande befindet sich auf der Saccharose desStufengradienten.29

2 Material und MethodenDie Cilienbande wurde mit der 1ml Gilson-Pipette abgenommen und im UZ-Röhrchen mitdem zehnfachen Volumen Lösung B verdünnt und erneut 30min bei 100 000g und 4°Cultrazentrifugiert. Das als weisser Fleck mit gelblichem Ring deutlich sichtbare Cilienpelletwurde bei -20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Grösse des Pellets und somit dieAusbeute an Protein richtet sich nach dem Alter der Ratten. Ratten im Alter von acht Wochenerzielen nur 50% der Proteinausbeute 12-wöchiger Ratten.2.5.3 Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999)Die Isolation des Gesamtepithels entspricht der in 2.5.1 beschriebenen Vorgehensweise. DieRiechepithelien von 2 Ratten wurden in einem 15ml Falcon-Röhrchen in flüssigem Stickstoffschockgefroren. Nach dem Auftauen wurde das Gewebe in einen 20ml Glashomogenisatorüberführt und in 10ml Puffer A (hypoton) homogenisiert. Anschließend wurde mit 300g 5minbei 4°C in der Hermle-Kühlzentrifuge (2.5.2) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 10mlUZ-Röhrchen überführt und 30min bei 100 000g (Beckman L-70 Ultrazentrifuge, SW40 Ti-Rotor) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10ml Puffer A resuspendiert und erneut 30min bei100 000g (SW40 Ti) zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 10ml Puffer B(hyperton) resuspendiert und nochmals unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. DasProtein-Pellet aus Gesamtgewebe wurde in 100µl Puffer C(M) aufgenommen.2.6 PNGaseF- und Benzonase-BehandlungZur Entfernung von N-Glykosiden wurde PNGaseF (500Units/ml, Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim) verwendet. Benzonase ® (25000Units/ml, Merck KgaA, Darmstadt) ist einerekombinant in E.coli exprimierte Endonuklease aus Serratia marcescens, die alle Formenvon Nukleinsäuren abbaut.Behandelt wurden die Cilien-Präparationen, deren Proteine für Gele mit anschließenderMassenspektrometrie (2.10) verwendet wurden. Je nach Größe des Cilienpellets wurde diesesmit Hilfe des Ultraschallbades (Transsonic 460, neoLab, Heidelberg) in einem Volumen von120-300µl PB-Puffer resuspendiert und mit jeweils 4µl PNGaseF und 4µl Benzonase versetzt,gemischt und 30min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in einUZ-Röhrchen überführt, mit Puffer C auf 10ml aufgefüllt und 30min bei 100 000g und 4°Cpelletiert. Das Pellet wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C gelagert.30

2 Material und Methoden2.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-MethodeDie Amidoschwarz-Methode, auch Schaffner/ Weissman-Methode (Schaffner und Weissman,1973) genannt, zeichnet sich gegenüber gängigen Methoden der Protein-Bestimmung dadurchaus, dass gelöstes Protein durch Zugabe von Säure ausgefällt und das Präzipitat mit demFarbstoff Amidoschwarz angefärbt wird. Dies hat den Vorteil, dass Störsubstanzen, wieDetergenzien oder Lipide, durch die Säurefällung entfernt werden und macht die Methode inzweierlei Hinsicht besonders für die Bestimmung der Konzentration von Membranproteinenwertvoll: Zum einen enthalten Lösungen von Membranproteinen stets Lipide derHerkunftsmembranen. Da diese außerdem auf Grund ihrer oftmals ausgedehntenhydrophoben Bereiche nur schwerlöslich sind, ist der Einsatz von Detergenzien unverzichtbarum Membranproteine möglichst quantitativ in Lösung zu bringen.Als Proteinstandard wurde 1mg/ ml BSA in 0,02M Na 3 PO 4 -Puffer verwendet. Die für dieGelelektrophorese (2.8) in Puffer C (2.2.3) aufgenommenen Proben und die Standards (1 -10µg) wurden mit H 2 O auf ein Endvolumen von 200µl gebracht, mit 20µl 10% (w/ v) SDSversetzt und gründlich gemischt um die Proteine zu solubilisieren. Anschließend wurden 30µl1M Tris/ HCl mit 1% SDS zugegeben. Nach dem Mischen wurden die Proteine durch Zugabevon je 60µl 100% (w/ v) TCA gefällt. Dazu wurden die Proben 30min bei Raumtemperaturinkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Membranfilter (Nitrocellulose,Porengröße 0,45µm, Millipore, Schwalbach) aufgetragen, der zuvor mit 3ml 6% (w/ v) TCAgewaschen worden war. Der Membranfilter befindet sich dazu auf einer speziellen Filterfritte(Millipore), die über einen Gummikonus auf einer Saugflasche sitzt, so dass während desAuftragens mit Hilfe des Vakuums eine zu starke Dispersion der Probe vermieden werdenkann. Der Filter wurde anschließend 3min in eine 9cm Petrischale mit Färbe-Lösung gelegt,danach kurz mit H 2 O gespült und schließlich dreimal je 2min mit Entfärbe-Lösung behandelt.Der Filter wurde an der Luft getrocknet, die gefärbten Bereiche ausgeschnitten und in ein 2mlEppendorf-Gefäß, das 1ml Elutions-Lösung enthält, gegeben. Anschließend wurde 20min beiRaumtemperatur zur Elution der gefärbten Proben rotiert. Dazu wurde ein mechanischerRührer, wie er in der präparativen Chemie verwendet wird, vertikal an einem Stativangebracht. An dessen Drehrührer wurde ein Ständer für Eppendorf-Gefäße befestigt. Nachder Elution wurde die optische Dichte bei λ=630nm (OD 630 ) gemessen. Im linearen Bereichder Eichkurve (1 - 10µg) entspricht eine OD 630 von 0,03 etwa 1µg Protein.31

2.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese2 Material und MethodenProteine wurden durch ein- und zweidimensionale Gelektrophorese getrennt. Je nach Größedes Pellets wurden die Cilienmembranen vor der Elektrophorese in 120 - 300µl Puffer C(2.2.3) aufgenommen.2.8.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli(1970)Zur Identifikation ciliärer Markerproteine, zur Durchführung der Negativkontrollen(Ausschluss von Proteinen des decilierten olfaktorischen Restepithels) und zur Darstellungverschiedener Bandenmuster wurde in modifizierter Form das klassische eindimensionaleSystem nach Laemmli verwendet. Anstelle von β-Meraptoethanol als Reduktionsmittel im 5xProbenpuffer wurde 2M Dithiotreithol (2M) eingesetzt. Als Kammersystem diente das ModellTwin S (2.1) mit einer Gelgröße von 5,5 x 8,5cm und einer Geldicke von 1,5mm. Es wurden10%ige Trenn- und 3,8%ige Sammelgele verwendet.Bei der Probenvorbereitung wurde das entsprechende Volumen von 10µg Probe mit 1/ 5 desEndvolumens 5x Probenpuffer und 1/ 20 des Endvolumens 20x DTT versetzt. Nach demMischen wurden die Proben 10min bei 90°C im Heizblock erhitzt, anschließend gründlichgevortext und 1min bei 13 000g in der Eppendorf-Tischzentrifuge (Modell 5415D, EppendorfAG, Wesseling-Berzdorf) zentrifugiert. Die Proben wurden aus dem Überstand pipettiert. Diebei der Präparation der Cilien nach der sequentiellen Zentrifugation anfallendenGewebepellets wurden in 0,5ml Puffer C auf Eis homogenisiert, bei 13 000g und 4°C 5min inder Hermle-Kühlzentrifuge abzentrifugiert und das entsprechende Volumen des proteinhaltigenÜberstands analog mit Probenpuffer versetzt und weiterbehandelt.Zur Durchführung der Negativkontrollen diente als positive Referenz die Protein-Präparationaus Gesamtgewebe (2.5.3). Ein entsprechendes Volumen, das 10µg Protein entspricht, wurdeanalog behandelt. Bei einer Stromstärke von 20mA im Sammel- und 35mA im Trenngelbetrug die Elektrophoresedauer etwa 3h. Die Gele wurden anschließend geblottet (2.9). ZurDarstellung colloidal Coomassie-gefärbter Cilienproteine im Gel wurde das KammersystemTwin M (2.1), mit einer Gelgrösse von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm, verwendet.Dazu wurden etwa 80µg Protein wie oben beschrieben behandelt.32

2 Material und Methoden2.8.2 Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(verändert nach Navarre et al, 2002)Um im Gel eine bessere Auflösung zu erzielen, wurde insbesondere im Hinblick auf diemassenspektrometrische Analyse (2.11) zusätzlich ein zweidimensionales Trennverfahreneingesetzt. Für beide Dimensionen wurden 1,5mm dicke Gele der Grösse 11 x 14cm und dasKammersystem Twin M verwendet. Um eine zu starke seitliche Diffusion der Proben im Gelzu vermeiden, wurde sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension bei 18°Cgekühlt. Arbeitsflächen, Glasplatten, Spacer, Probenkämme und Glasgeräte zum Ansetzen derGel-Lösungen beider Dimensionen wurden mit Aceton und 1% (w/ v) SDS vorgereinigt umFette und Protein-Verunreinigungen, wie Keratine, die auf Grund ihrer Menge in derMassenspektrometrie (2.10) andere Proteine vollständig überlagern können, zu entfernen.2.8.2.1 Vorbereitung der GeleBei der Vorbereitung der Gel-Lösungen für das Sammel- und Trenngel der CTAB-PAGE(Tab.2.5) wurde zuerst Harnstoff in der angegebenen Menge H 2 O gelöst. Um Luftblasen imGel zu vermeiden, wurde im Exsikkator mit einer Vakuumpumpe (Vacuubrand PC101,Brandtech Scientific, Essex, USA) entgast. 25mM FeSO 4 x 7H 2 O und 0,03% H 2 O 2 wurdenerst nach dem Entgasen, kurz vor dem Gießen zugegeben, da diese Substanzen denPolymerisationsvorgang einleiten. Die Polymerisationsdauer betrug 16h.Sammelgel (8%) Trenngel (8%)HarnstoffAcrylamid/ Bisacrylamid (30/0,8)Bisacrylamid (2%)300mM KH 2 PO 4 pH 2.1300mM KH 2 PO 4 pH 4.180mM Ascorbinsäure250mM CTABH 2 O25mM FeSO 4 x 7H 2 O0,03% (v/ v) H 2 O 2Gesamtvolumen1,66M5,34ml1,87ml-8,30ml1,00ml0,22ml3,27ml0,01ml0,80ml20,00mlENTGASEN3M10,68ml434µl10ml-2,00ml0,45ml14,80ml0,02ml1,60ml40,00mlTab. 2.5 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels der CTAB-PAGE.33

2 Material und MethodenIn der zweiten Dimension wurden die in 2.8.1 beschriebenen 10%igen Trenn- und 3,8%igenSammelgele verwendet. Im Sammelgel wurde anstelle des Probenkamms ein speziellangefertigter Präparativer Kamm (Abb. 2.6 ), dessen große Tasche in der Breite der Gel-Länge von 11cm entspricht, verwendet. Zu beiden Seiten der grossen Tasche befinden sichfür den Marker (2.3.1) noch zwei kleinere Taschen von 5mm Breite.Abb. 2.6 Präparativer Kamm. In die lange Tasche wirdnach der ersten Dimension der Gelstreifen geschoben.2.8.2.2 1. Dimension: CTAB-PAGEBei der Probenvorbereitung für die erste Dimension wurde ein Volumen das etwa 150µgProtein entspricht mit dem gleichen Volumen 2x Probenpuffer versetzt. Der 2x Probenpufferwurde zunächst ohne Harnstoff hergestellt, da das anschließende Erhitzen der Probe inAnwesenheit von Harnstoff zur Carbamoylierung von Lysinen führt, die als Schnittstelle vonTrypsin dienen. Die Maskierung würde den vollständigen tryptischen Verdau der Proteine fürdie massenspektrometrische Analyse verhindern.Die Proben wurden 15min bei 70°C im Heizblock erhitzt. Währenddessen wurde in separateEppendorf-Gefäße, die dem Probevolumen entsprechende Menge Harnstoff (3M) eingewogenund im 30°C Wasserbad erwärmt. Anschließend wurden die Proben gevortext und quantitativin das Eppendorf-Gefäß mit dem Harnstoff überführt. Harnstoff erhöht die Löslichkeit vonProteinen. Die Proben wurden nach Zugabe erneut gründlich gevortext und dann für 5min bei30°C im Heizbad belassen, 1min mit 13 000g in der Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiertund aus dem Überstand pipettiert. Überschritt das Probevolumen inklusive 2x Probenpufferdie Menge von 150µl, musste die Probentasche des Sammelgels mit einem Micro-Spateltrichterförmig erweitert werden (Abb. 2.7).Bei einer Stromstärke von 25mA im Sammel- und 45mA im Trenngel dauerte dieElektrophorese etwa 6,5h. Die Elektroden wurden so gepolt, dass die Elektrophorese inRichtung Kathode abläuft, da CTAB als kationisches Detergenz den Proteinen eine positiveLadung verleiht.34

2 Material und MethodenNach der ersten Dimension wurde das Sammelgel entfernt und das Gelstück mit der Probeund die Markerbanden als ca 1,5cm breiter Streifen mit dem Skalpell ausgeschnitten. DerGelstreifen wurde 4 x 5min in H 2 O gewaschen und 4 x 15min in SDS-Lyse-Pufferäquilibriert. Die Markerbanden wurden in Fixier-Lösung (2.2.6 und 2.2.7) überführt.Abb. 2.7 Elektrophoresekammer "Twin M", wie sie zur Durchführung derGelelektrophorese verwendet wurde. Die Probentasche wurde mit demMikrospatel trichterförmig erweitert (siehe Text).2.8.2.3 2.Dimension: SDS-PAGEDer Gelstreifen wurde nach der Äquilibrierung in die Aussparung des Sammelgels geschoben.Ein Teil der zweiten Dimension wurde über Nacht bei einer Stromstärke von 10mAdurchgeführt. Erst nach etwa 11h passierten die Proben die Trenngelgrenze. Am nächsten Tagkonnte die Stromstärke deshalb im Trenngel auf 45mA erhöht werden. Insgesamt dauerte dieElektrophorese etwa 16h.2.9 Färbung der Proteine im GelEs wurden reversible Färbeverfahren mit möglichst niedriger Nachweisgrenze gewählt.2.9.1 Reversible MS-kompatible SilberfärbungArbeitsschritt Lösung (2.2.6) DauerFixierungSensitisationWässerungImprägnationSpülenEntwicklungStoppenWaschenFixier-LösungSensitisationslösungBidestSilbernitrat-LösungBidestEntwickler-LösungStopp-LösungBidest1 - 3d45min6x 10min1 - 2hmax 15s5 - 40min45min2x 30minTab. 2.6 Protokoll für die reversible, MS-kompatible Sillberfärbung.35

2 Material und Methoden2.9.2 Colloidale Coomassie-FärbungArbeitsschritt Lösung (2.2.7) DauerFixierungWässerungInkubationFärbungEntfärbungFixier-LösungBidestInkubationslösungFärbe-LösungBidest1 - 3d3x 30min60min3 - 5d6h - 3dTab. 2.6 Protokoll für die colloidale Coomassie-Färbung.2.10 Western Blot-Analyse2.10.1 Transfer und Immobilisierung von ProteinenDie Proteine wurden eindimensional durch SDS-PAGE (2.8.1) und zweidimensional durchCTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) aufgetrennt und in Anlehnung an Towbin et al. (1979) auf PVDF-Membranen (2.1) transferiert. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren.Dazu wurden pro Gel 16 Whatman ® -Papiere (3mm Chromatography paper, Whatman ®International Ltd.,Brentford, UK) und eine Membran auf die Größe des Trenngelszugeschnitten. Das Gel und die Whatman ® -Papiere wurden 5min in Transfer-Pufferäquilibriert. Die PVDF-Membran wurde zunächst 5min in Methanol aktiviert, anschließendebenfalls in Transfer-Puffer äquilibriert. Auf die Anode der Blot-Apparatur (2.1) wurden dann8 Filterpapiere, die Membran, das Gel und abschließend 8 Filterpapiere in dieser Reihenfolge,blasenfrei, zum sogenannten „Blot-Sandwich“ aufgetürmt. Für einen optimalen Stromflusswurde die Anodenplatte um das Sandwich getrocknet.Pro cm 2 Gelfläche wurde mit 2,0mA, jedoch insgesamt mit nicht mehr als 450mA, 90mingeblottet.2.10.2 Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase-AktivitätNach dem Transfer wurden zunächst unspezifische Bindestellen auf der Membran durchInkubaton mit Milchpulver-Blocklösung besetzt. Geblockt wurde über Nacht bei 4°C oder60min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde 90min mit Erst-Antikörper (2.3.2.1) inMilchpulver-Verdünnungslösung inkubiert. Für Blots von Gelen der Größe 5,5 x 8,5cm waren2ml Antikörper-Verdünnung ausreichend, wohingegen für Blots der Größe 11 x 14cm 4mlLösung benötigt wurden. Die Inkubation erfolgte in 15ml bzw 50ml Falcon-Röhrchen, die mit36

2 Material und Methodendem Falcon-Ständer an einem mechanischen Rührer, wie er in der präparativen Chemieverwendet wird, angebracht wurden. Der Rührer wurde vertikal an einem Stativ befestigt.Danach wurden die Membranen 3 x 5min auf dem Schüttler mit Wasch-Puffer und 1 x 5minmit 1x PBS gewaschen. Die Inkubation mit Zweit-Antikörper (2.3.2.2) erfolgte 60min in10ml Antikörper-Verdünnung mittels der gleichen apparativen Vorrichtung. Dann wurdewieder 3 x 5min in Wasch-Puffer gewaschen, dann 1 x 5min mit Wasser. Die Membranenwurden anschließend in einer Film-Entwicklerkassette (Hypercassette, AmershamBiosciences, Freiburg) in feuchte Frischhalte-Folie eingeschlagen.Die Aktivität der Zweit-Antikörper-gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde mitdem ECl TM Plus-System (Amersham Biosciences, Freiburg) detektiert. Das Detektionsreagenzenthält zyklisches Diacylhydrazid (Lumigen PS-2), das in Gegenwart vonWasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) und mit Hilfe der Meerrettich-Peroxidase, die als Katalysator derReaktion fungiert, zu einem Acridinium Ester umgesetzt wird (Abb. 2.9). Durch die weitereUmsetzung des Esters (Oxidation) werden Teilchen energetisch angeregt, die eine Weile aufhöheren Energie-Niveaus verweilen und schließlich ihre Energie durch Abgabe vonLichtquanten (Photonen) verlieren. Man bezeichnet diesen Vorgang als Chemilumineszenz.Im Falle des ECl TM Plus-Systems dient der Acridinium Ester als eine Art „Lichtspeicher“ undso können Lichtquanten noch 24 Stunden nach Beginn der Reaktion detektiert werden.Abb. 2.9 Oxidation von Lumigen PS-2. Die Reaktion wird von deran Zweit-Antikörper gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP)katalysiert.37

2 Material und MethodenPro cm 2 Membran wurden 40µl Detektionsreagenz angesetzt. Dazu wurden die Reagenzien A(enthält Lumigen PS-2) und B (enthält H 2 O 2 ) des ECl TM Plus- Systems im Verhältnis 40 : 1(A : B) gemischt. Die Membranen wurden dünn betropft und danach 5min im Dunkelninkubiert. Die Lösung wurde anschließend vom Rand der Membranen mit einem Papiertuchweggesaugt. Die Frischhalte-Folie wurde faltenfrei eingeschlagen, die Filme (2.1) beigeeignetem Rotlicht auf den Blots platziert und die Entwicklerkassette geschlossen.Anschließend wurden die exponierten Filme in der Entwickler-Maschine (2.1) entwickelt.2.11 MassenspektrometrieProteine, die massenspektrometrisch analysiert wurden, wurden zuvor durchzweidimensionale CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) getrennt und anschließend colloidalCoomassie-gefärbt (2.9.2). Für die Protein-Identifizierung wurde der Massenspektrometer Q-Tof Ultima API der Firma Waters (Massachusetts, USA) verwendet. Das Gerät iststandardmäßig mit einer HPLC-Anlage ausgestattet. Es wurde die Kapillarsäule Modell„Atlantis“ der Firma Waters benutzt, mit den Maßen 150mm (Länge) x 75µm (Durchmesser).Der Durchmesser der Silica-Kugeln betrug 3µm, die Porengröße 300Å (30nm). Der Aufbau(Abb. 1.9) und das Funktionsprinzip des ESI-Tandem-Massenspektrometers wurdeausführlich in Kapitel 1.4.3.3 beschrieben. Für die Datenbank-Recherche wurde dasProgramm "MASCOT" von www.matrixscience.com verwendet.Die Probenvorbereitung wurde unter einer Plexiglas-Scheibe durchgeführt um Verunreinigungen,insbesondere durch Keratine, zu vermeiden.2.11.1 Ausschneiden der ProteineDie gefärbten proteinhaltigen Bereiche wurden mit dem Skalpell ausgeschnitten, in kleineStücke zerteilt und die Gelstückchen anschließend in ein 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt.Dazu wurde das Gel auf einer Glasplatte platziert. Auf Papier wurde ein Raster angefertigtund unter die Glasplatte gelegt. Unter dieser Anordnung befand sich eine Leuchtplatte, sodass das Raster deutlich durch das Gel hindurch zu erkennen war (Abb. 2.10). Denausgeschnittenen Gelstückchen konnten deshalb eindeutige Nummern zugeteilt werden, dieden Tetragonen des Rasters entsprachen.38

2 Material und MethodenAbb. 2.10 Anordnung beim Ausschneiden der gefärbten Bereiche des Gels. DasRaster (vergrößert dargestellt) wurde in 3 Bereiche A, B, C untergliedert, dieTetragone des Rasters durchnummeriert (nicht dargestellt). Auf dem Rasterbefindet sich eine Glasplatte (dunkelblau) auf der das Gel (türkis) liegt.2.11.2 Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen („im-Gel Verdau“)Vor der massenspektrometrischen Analyse müssen die Proteine entfärbt und proteolytischgespalten werden. Als Protease wurde Trypsin verwendet, das Proteine C-Terminal hinterLysin (K) und Arginin (R) hydrolysiert, sofern es sich bei der darauf folgenden Aminosäurenicht um Prolin (P) handelt. Die meisten Proteine besitzen genügend Spaltstellen, so dass dietryptischen Fragmente eine optimale Größe aufweisen. Ein weiterer Vorteil bei derVerwendung von Trypsin ist, dass alle Autolyse-Produkte bekannt sind und bei derMS-Analyse deshalb von vornherein ausgeschlossen werden können.Die Gelstückchen wurden nach dem Auftauen mit 400µl H 2 O versetzt und 5min bei 37°C und600rpm im Thermomixer (Modell Compact, Eppendorf AG, Wesseling-Berzdorf) inkubiert.Um organische Verunreinigungen zu entfernen, wurde 5min bei 600rpm und 37°C in 50%(v/ v) Acetonitril gewaschen. Zur Reduktion der Disulfidbrücken wurden die Gelstückchenmit 250µl 10mM DTT 1 Stunde bei 56°C und 600rpm behandelt. Anschließend wurde 5minauf einem zweiten Thermomixer bei 600rpm und 25°C mit 400µl H 2 O gewaschen. Danachwurden die Proben mit etwa 250µl 55mM Iodacetamid versetzt und 30min bei 600rpminkubiert. Iodacetamid maskiert durch Alkylierung die nach der Reduktion freiwerdendenSH-Gruppen der Cysteine und verhindert so deren erneute Oxidation. Um die zusätzlicheAlkylierung der Methionine zu verhindern, sollte diese Reaktion unbedingt im Dunkeln undbei Raumtemperatur durchgeführt werden. Anschließend wurde im Wechsel je dreimal 10minbei 37°C und 600rpm mit 400µl H 2 O und 50% (v/ v) Acetonitril gewaschen. Die erstenbeiden Male wurden die Proben dabei abgedunkelt. Die Gelstückchen wurden dann zweimalmit jeweils 400µl 100% Acetonitril bei Raumtemperatur etwa 1min dehydratisiert. DerEndpunkt dieses Vorgangs ist deutlich erkennbar, da die Gelstückchen nach Abschluss eine39

2 Material und Methodenschneeweiße Farbe annehmen. Das Acetonitril wurde anschließend abgenommen und dieGelstücke bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wurde zunächst in je 20µlTrypsin-Gebrauchslösung verdaut. Die Proben wurden dazu etwa 10min bei 37°C inkubiert.Dabei quellen die Gelstückchen auf. Teilweise sind diese nicht mehr bedeckt und fehlendesVolumen wurde deshalb durch die erneute Zugabe von etwa 10µl Trypsin-Gebrauchslösungergänzt. Nach weiteren 10min wurden die Proben ein zweites Mal überprüft und eventuelldurch die Zugabe von Bicarbonat-Puffer vollständig bedeckt. Danach wurden sie über Nachtim Inkubator bei 37°C verdaut.2.11.3 Nano-LC und interne KalibrierungDie Peptid-Proben befinden sich nach dem Verdau in der Flüssigkeit, die die Gelstückchenumgibt. Die Injektion der Proben erfolgte automatisiert über eine Dosierschleife, die dasreproduzierbare Einbringen von definierten Injektionsvolumina in das HPLC-Systemermöglicht. Kleinste Mengen der Proben (20nl/ min) wurden so in den konstantenVolumenstrom (5µl/ min) der mobile Phase (1.4.3.3) gebracht. Als mobile Phase wurde einkonvexer Hochdruck-Gradient aus H 2 O/ Acetonitril (Tab. 2.7) verwendet. Der Pumpendruckbetrug 3600psi („parts per square inch“, entspricht 248,2bar).Zeit (min) H 2 O (%) Acetonitril (%)Fließgeschwindigkeit(µl/ min)0,01 95 5 55,00 95 5 510,00 85 15 535,00 60 40 545,00 40 60 550,00 5 95 555,00 5 95 556,00 95 5 5Tab. 2.7 Zeitprofil des konvexen Gradienten der mobilen Phase.Für die Kalibrierung des Massenspektrometers wurde der Fibrinogen B [Glu 1 ]-Standard derFa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet.40

2 Material und Methoden2.11.4 Extraktion der ProbenProben, die sich nach der Analyse im Spektrum als sehr komplex herausgestellt hatten,wurden ein zweites Mal gemessen. Dazu mussten die Peptide aus den Gelstückchen extrahiertwerden. Mit Acetonitril wurden die Gelstückchen erneut dehydratisiert. Die austretendeFlüssigkeit wurde abgenommen, in ein neues 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt und in derSavant SpeedVac (Selby Biolab, Australien) eingeengt. Das resultierende Volumen wurdein 15µl Bicarbonat-Puffer aufgenommen, 5µl wurden für die Analyse verwendet, das restlicheVolumen bei -20°C gelagert.41

3 Ergebnisse3 ErgebnisseIn dieser Arbeit sollten ciliäre Membranproteine aus dem Riechepithel der Ratte isoliert undin hoher Auflösung durch 2D-Gelelektrophorese dargestellt werden. Das Ziel war dabei dieEtablierung einer Methode, die die massenspektrometrische Analyse des gesamten ciliärenProteoms ermöglicht.Der folgende Ergebnisteil gliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 3.1 beschreibt dieIsolation ciliärer Membranen aus dem Riechepithel der Ratte. Der immunologische Nachweisvon Markerproteinen, die Aufschluss über die Qualität der Präparation geben, ist Bestandteilvon Abschnitt 3.2. Die zweidimensionale gelelektrophoretische Trennmethode dersolubilisierten Membranproteine ist in Abschnitt 3.3 beschrieben und deren qualitativeAnalyse in Abschnitt 3.4. Abschließend werden die Ergebnisse der massenspektrometrischenAnalyse in Abschnitt 3.5 vorgestellt.3.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer MembranenDie Präparation von Cilien-Membranen wurde bereits von mehreren Autoren beschrieben(z.B. Bönigk et al., 1999; Delgado et al., 2002; Washburn et al., 2002). Die dortbeschriebenen Vorgehensweisen lieferten, bezogen auf die Reinheit und Protein-Ausbeute,jedoch keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Es war deshalb zunächst notwendig, diesePräparationstechniken im Hinblick auf die 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometriezu optimieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun eine Präparation ausgearbeitet werden,die durch die Kombination der verschiedenen Beschreibungen eine neue Methode darstellt,die diesen Anforderungen genügt.Dazu wurde das Riechepithel aus jeweils 15-20 Ratten präpariert. Für den nachfolgendenCalcium-Schock zur Ablösung der Cilien vom Epithel erwies sich das 30minütige Rühren imSchnappdeckel-Glas gegenüber dem Taumeln im 15ml Falcon-Röhrchen als viel effektiver,so dass die Ausbeute an Cilien-Membranen wesentlich gesteigert werden konnte.Bei 7700g bewirkte die Anwendung der sequenziellen Zentrifugation anstelle eines einzelnenZentrifugationsschrittes eine zusätzliche Anreicherung ciliärer Membranen. Dabei erscheinendie Cilien nach dem ersten Zentrifugationsschritt noch als gelber Ring (Abb. 3.1, links) umdas decilierte Restepithel, der im Zuge der folgenden Zentrifugationsschritte verschwindet.Zur besseren Abtrennung gelöster Proteine und nicht-ciliärer Membranen anderer Organellen,wie von Mitochondrien oder Zellkernen, wurde zudem ein Saccharose-Stufengradient42

3 Ergebnisseeingeführt. Die Cilienbande erscheint nach der Ultrazentrifugation deutlich sichtbar alsdunkler Nebel an der Phasengrenze des Gradienten (Abb. 2.5).Die Ausbeute an isolierten Membranen wurde für jeden Reinigungsschritt indirekt über dieProteinmenge bestimmt. Da Membranproteine für eine quantitative Bestimmung zunächst ausder Membran gelöst und solubilisiert werden müssen, ist der Einsatz von Detergenzienunumgänglich. Die Bestimmung der Proteinmenge musste deshalb über die Amidoschwarz-Methode erfolgen.Die Abbildung 3.1 (rechts) zeigt das Cilienpellet nach der zweiten Ultrazentrifugation amEnde der Präparation. Die hier etablierte Methode lieferte jetzt im Vergleich eine deutlichhöhere Ausbeute.Abb. 3.1 Links dargestellt ist das Pellet der Riechepithelien von 5Ratten nach der ersten Zentrifugation bei 7700g. Der gelbliche Rand(Pfeil) um das decilierte Restepithel besteht aus den Cilien der ORNs.Rechts: Membranpellet am Ende der Präparation.43

3 Ergebnisse3.2 Qualitative Analyse der PräparationKennzeichnend für die hohe Qualität der Präparation ist die vorherrschende Präsenz ciliärerProteine. Für die Praxis bedeutet dies, dass analysiert werden muss, ob folgendeVoraussetzungen erfüllt sind: Der gelelektrophoretische Vergleich der Cilienproteine mit den Proteinen desolfaktorischen Gesamtepithels zeigt, dass cilienspezifische Proteine angereichertwerden In der Präparation können ciliäre Markerproteine nachgewiesen werden Epitheliale oder mitochondriale Markerproteine werden nicht oder in geringer Mengein der Cilienpräparation nachgewiesen3.2.1 Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGEUm sich einen groben Überblick zu verschaffen, ob bestimmte Proteine in der Präparationbesonders stark angereichert werden, wurden etwa gleiche Mengen der Cilienproteine und desolfaktorischen Gesamtepithels (OE; 2.5.3) durch denaturierende SDS-PAGE (2.8.1) getrenntund anschließend colloidal Coomassie (2.9.2) gefärbt.Abb. 3.2 Vergleich desBandenmusters ciliärerProteine mit dem vonProteinen des deciliertenRestepithels.Links im Bild: Molekulargewichtein kDa. (I): 20µgCilienproteine; (II): 20µgProteine des olfaktorischenGesamtepithels.Abbildung 3.2 zeigt das Ergebnis der Färbung: In derTat scheinen einige Proteine durch die Präparation starkangereichert zu werden. Besonders deutlich ist dies etwaim Bereich von 55kDa zu erkennen. Im oberen Drittelsind im Größenbereich zwischen 70 und 120kDa vieleBanden erst nach der Anreicherung erkennbar.Möglicherweise handelt es sich um cilienspezifischeProteine, die in der großen Proteinvielfalt des gesamtenolfaktorischen Epithels nicht als Banden sichtbarwerden. Insgesamt ist die Auflösung der Banden viel zugering um die Komplexität der Präparation vollständigzu erfassen. In einer Bande können zahlreiche Proteineenthalten sein.44

3 ErgebnisseErsichtlich ist, dass es sich bei den Proteinen der Präparation um ein komplexes Gemischhandelt. Ob es sich dabei ausschließlich um ciliäre Proteine handelt, kann erst beurteiltwerden, nachdem die Anwesenheit anderer Proteine experimentell widerlegt wurde undCilienproteine nachgewiesen wurden.3.2.2 Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-AnalyseAdenylatcyclase Typ III (AC III), das olfaktorische G-Protein (G olf ) und die Untereinheitendes cyclisch-Nukleotid gesteuerten Kationenkanals (CNG-Kanal) sind heute anerkanntecilienspezifische Markerproteine, für die Antikörper für immunologische Nachweis-Verfahren im Handel erhältlich sind.Cilienproteine, Proteine des decilierten Restepithels und des olfaktorischen Gesamtepithelswurden nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen immobilisiert. Zum immunologischenNachweis der Markerproteine wurden Antikörper gegen die A2-Untereinheit des CNG-Kanals (α-CNG-A2), gegen die A4-Untereinheit des CNG-Kanals (α-CNG-A4), gegen AC III(α-AC III) und gegen die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (α-G αs/olf ) verwendet.3.2.2.1 Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-KanalsAbbildung 3.3 zeigt den immunologischen Nachweis von CNG-A4 (linker Blot) und CNG-A2 (rechter Blot). Beide Untereinheiten wurden in der Cilien-Präparation (I) nachgewiesen,aber nicht im decilierten Restepithel (II) und nicht im olfaktorischen Gesamtepithel (III).Deutlich sichtbar ist bei CNG-A2 nur die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa. Dieunscharfe Bande lässt auf unterschiedliche Glykosylierungszustände schließen, dieüberwiegend während der Präparation entstehen. Die nicht glykosylierte Variante bei 76kDaist nur sehr schwach erkennbar, möglicherweise deutet dies auf ein schonendesPräparationsverfahren hin, da das Protein überwiegend in seiner höhermolekularen Formauftritt und das, obwohl große Proteine im Vergleich zu kleineren erfahrungsgemäß schwererauf Membranen zu transferieren sind. Bei etwa 58kDa ist schwach ein wiederholt auftretendesAbbauprodukt der CNG-A2 Untereinheit zu erkennen.45

3 ErgebnisseAbb. 3.3 Western Blot-Analyse von CNG-A4 (linker Blot)und CNG-A2 (rechter Blot). Pro Spur wurde 10µg Proteinaufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa. (I):Cilien; (II): deciliertes Restepithel; (III): OE; Verdünnungender Antikörper: α-CNG-A4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; α-CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; Expositionsdauer derMembranen: 12min.Die CNG-A4 (linker Blot) Untereinheit ist ebenso wie CNG-A2 nur in den Ciliennachweisbar. Sie ist nicht glykosyliert und erscheint in nur einer Variante bei 66kDa.Da beide Untereinheiten nicht im decilierten Restepithel nachgewiesen werden, ist eine hoheAusbeute an Cilienmembranen bei der Präparation anzunehmen. Der Anteil an CNG-Proteinen bezogen auf die gesamte Protein-Vielfalt des olfaktorische Epithels ist zu gering umCNG-A2 und CNG-A4 in den aufgetragenen Mengen noch nachweisen zu können. BeideUntereinheiten werden demnach stark bei der Präparation angereichert.3.2.2.2 Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III)Bei der Analyse der AC III (Abb. 3.4) wurden nicht nur in der Cilienpräparation (I) Signaledetektiert, sondern schwach auch im decilierten Restepithel (II) und im olfaktorischenGesamtepithel (III). Prominent ist auch hier die glykosylierte Form des Proteins, dietypischerweise bei etwa 220kDa erscheint. Ein Abbauprodukt, das häufig detektiert wird,erscheint in mittlerer Intensität in der Cilien- Präparation bei etwa 72kDa (zum Vergleichsiehe Bönigk et al., 1999).46

3 ErgebnisseAC III scheint sehr stark in den ORNs exprimiert zu werden undist deshalb auch im decilierten Restepithel noch schwachnachweisbar. Ersichtlich ist aber, dass AC III, ebenso wie dieCNG-Untereinheiten, durch die angewandte Präparationstechnikdeutlich angereichert wird.Abb. 3.4 Western Blot-Analyse der AC III. (Zahlen): Molekulargewichte inkDa. Pro Spur wurde 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertesRestepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-AC III, 1: 200; α-rbIgG, 1: 80000; Exposition: 3min.3.2.2.3 Western Blot-Analyse der α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (G α olf )Die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins besitzt eineGröße von 44,2kDa und wird in allen Spuren sehr stark detektiert,jedoch besteht immer noch eine Tendenz zur Anreicherung in derCilien- Präparation (I), wohingegen im decilierten Restepithel (II)eine Abreicherung zu beobachten ist. Möglicherweise bestehendie Signale aus zwei Banden, da häufig auch die etwas kleinereSpleiß-Variante α2 (40kDa) detektiert wird.Abb. 3.5 Western Blot- Analyse von G α olf . (Zahlen): Molekulargewichte inkDa. Pro Spur wurden 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertesRestepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-G α olf , 1: 2000; α-rbIgG, 1: 80000; Exposition: 20s.3.2.3 Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-AnalyseDie Reinheit der Präparation wurde durch Ausschluss mitochondrialer und epithelialerMarkerproteine überprüft. Als Marker dienten Occludin der tight junctions und Prohibitin, dasin der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiert ist.47

3 ErgebnisseZur Durchführung der Kontrollen wurden die Cilienproteine und die Proteine desolfaktorischen Gesamtepithels nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen transferiert undmit Antikörpern gegen Occludin (α-Ocn) und Prohibitin (α-PHB) behandelt.Abb. 3.6 Western Blot-Analyse von Occludin (links)und Prohibitin (rechts). (Zahlen): Molekulargewichte inkDa. Pro Spur wurden 20µg Protein aufgetragen. (I):Cilien-Proteine; (II): OE; Verdünnungen der Antikörper:α-Ocn, 1: 200; α-rb IgG, 1: 30000; α-PHB, 1: 200; α-rbIgG, 1: 30000; Exposition: jeweils 30s.Die Markerproteine Occludin (linker Blot) und Prohibitin (rechter Blot) wurden sowohl in derPräparation der Cilien (Spur I) als auch im olfaktorischen Gesamtepithel nachgewiesen (SpurII). Auffällig ist, dass die nicht phosphorylierte Variante von Occludin (65kDa) nur in Spur Idetektiert wird. Möglicherweise wird diese Form auf Grund ihrer schlechteren Löslichkeit amEnde der Präparation mit den Cilienmembranen pelletiert. In der Proteinpräparation des OEkann man erkennen, dass diese Variante bezogen auf das Gesamtepithel eher eineuntergeordnete Rolle spielt. Prominent ist hier die phosphorylierte Form bei etwa 82kDa, diein den Cilien wesentlich schwächer detektiert wurde. Das mitochondriale MarkerproteinProhibitin liefert ein eindeutiges Signal im OE (30kDa) und ist ebenso wie Occludin in derCilienpräparation mengenmäßig stark reduziert.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle verwendeten ciliären Markerproteine in derPräparation nachgewiesen und angereichert wurden. In Bezug auf die Signalstärken wirddeutlich, dass AC III und G olf im Vergleich mit den CNG-Untereinheiten mengenmäßig in derPräparation überwiegen, was auf eine stärkere Expression schließen lässt, da diese auch imolfaktorischen Gesamtepithel und decilierten Restepithel noch nachweisbar sind. Die nicht-48

3 Ergebnisseciliären Proteine Occludin und Prohibitin hingegen wurden in der Cilienpräparation indeutlich geringerer Menge als im olfaktorischen Epithel nachgewiesen.3.3 Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischenTrennverfahrensIn Abschnitt 3.2.1 wurde gezeigt, dass es sich bei den Proteinen der Cilien-Präparation um einsehr komplexes Gemisch handelt. Die Kontrollen bewiesen zudem, dass darin auch nichtciliäreProteine, zwar in einem geringeren Umfang, aber dennoch enthalten sind. Es wardeshalb notwendig, ein gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren zu etablieren, das gegenüberder klassischen, eindimensionalen SDS-PAGE eine höhere Auflösung der Proteine erzielt.Diese Methode sollte darauf ausgelegt sein, die schlecht löslichen und im Gegensatz zu denlöslichen Proteinen in wesentlich geringerer Konzentration in der Zelle vorhandenenMembranproteine quantitativ darzustellen.3.3.1 Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-GelelektrophoreseBei der 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-CTAB/ SDS-PAGE) werdenProteine in beiden Dimensionen nach ihren Molekulargewichten getrennt. Die Verwendungder CTAB-PAGE in der ersten Dimension erwies sich in vielfacher Hinsicht als sehrvorteilhaft: Das kationische Detergenz Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) stabilisiertdie positiven Ladungen der außerhalb der hydrophoben Regionen überwiegend basischenMembranproteine, erhöht somit deren Löslichkeit und verdrängt gleichzeitig die benachbartenPhospholipide. Der saure pH-Wert unterstützt diesen Prozess durch Bereitstellung vonProtonen und sorgt dafür, dass lösliches Protein noch vor dem Auftragen der Probe teilweisegefällt wird. Eine zweite Methode, die nach den gleichen Prinzipien die Trennung vonMembranproteinen ermöglicht, ist die häufiger angewandte 16-BAC/ SDS-PAGE, die imRahmen dieser Arbeit ebenfalls getestet wurde (nicht dargestellt), aber vergleichsweise eineschlechte Auflösung erzielte.In der zweiten Dimension wurden die Proteine durch klassische SDS-PAGE getrennt. Dazuwurde der Gelstreifen mit der Probe ausgeschnitten und in SDS-Lyse-Puffer äquilibriert. DieProteine erhalten durch das anionische Detergenz SDS eine negative Ladung.49

3 Ergebnisse3.3.1.1 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender SilberfärbungZunächst wurden Cilienproteine und olfaktorisches Gesamtepithel getrennt und anschließenddurch Silberfärbung im Gel dargestellt (Abb. 3.7). Im Hinblick auf die massenspektrometrischeAnalyse wurde die MS-kompatible Variante der Silberfärbung mit einerNachweisgrenze von 2ng Protein verwendet.Abb. 3.7 Ergebnis der Silberfärbung der durch 2D-CTAB/ SDS-PAGE getrennten Cilienproteine (links) und derProteine des OE (rechts). Es wurde jeweils 80µg Protein verwendet. (1D, 2D): Die Richtung der ersten undzweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet; (Zahlen): Molekulargewichte in kDa. In beiden Dimensionenwurden die Proteine gemäß ihrer Masse getrennt.Erwartungsgemäß ist auch hier das Proteinmuster der Cilienproteine weniger komplex als dasder Proteine des OE. Die starke Abweichung der Proteine von der Diagonalen ist einerwünschter Effekt, da Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten andernfalls in der zweitenDimension genauso weit wie in der ersten Dimension wandern würden und deshalb keinezusätzliche Trennung zu beobachten wäre. Der zusätzliche Trenneffekt in der Horizontalenwird hauptsächlich durch das unterschiedliche Detergenz-zu-Protein-Verhältnis in beidenDimensionen verursacht. Dasselbe Protein wird von etwas mehr CTAB-Molekülen besetzt alsvon SDS-Molekülen und wandert in der ersten Dimension etwas weiter. Unterstützt wirddieser Effekt durch unterschiedliche Acrylamid-Konzentrationen in den Gelen.Die horizontale Streifenbildung („Streaking“) ist eine häufige und unerwünschte Erscheinungzweidimensionaler Trennverfahren. Sie hat vielfältige Ursachen, wie zum Beispiel zu hoheSalzkonzentrationen (>10mM) in der Probe, Überladung des Gels oder Verunreinigungen mitNukleinsäuren. Das vertikale streaking in den höhermolekularen Bereichen des Gels kann einHinweis auf Degradation der Proteine sein.50

3 Ergebnisse3.3.1.2 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-FärbungDie Gele mussten für die weitere Anwendung optimiert werden: Das streaking sollteminimiert werden. Ein höherer Kontrast war wünschenswert, nicht zuletzt deshalb um diespäter massenspektrometrisch analysierten Proteine besser im Gel zuordnen zu können. Ausdiesem Grund wurden die Gele alternativ colloidal Coomassie gefärbt. Mit dieserFärbemethode können 5 - 10ng Protein nachgewiesen werden. Trotz der etwas geringerenSensitivität hatte dieses Verfahren im Vergleich zur massen-kompatiblen Silberfärbungmehrere Vorteile: Bei großen Proteinmengen steigt die Intensität der Silberfärbung nur bis zueinem nicht näher bestimmten Wert an und nimmt danach wieder ab. Bei der colloidalCoomassie-Färbung hingegen besteht eine größere Linearität zwischen Proteinmenge undFarbtiefe. Das Stoppen der Entwicklung ist bei der Silberfärbung ein kritischer Schritt, da dasGel in der Stopp-Lösung noch nachfärbt und es deshalb häufig zu Überfärbungen kam. EinNachfärben der Gele während des Entfärbe-Vorgangs wurde bei der colloidalCoomassie-Färbung nicht beobachtet. Auch die Hintergrund-Färbung war deutlich reduziert.Die Cilienproteine wurden zur Reduktion des streakings vor dem Auftragen zudem mitBenzonase und PNGaseF behandelt. Um die geringere Sensitivität im Vergleich zur Silberfärbungauszugleichen, wurde etwa die doppelte Menge der Probe aufgetragen.Abbildung 3.8 zeigt das Ergebnis dieser 2D-CTAB/ SDS-PAGE. Eine gleich behandelteProbe wurde zusätzlich durch eindimensionale SDS-PAGE getrennt. Bei der Interpretationder Ergebnisse sollte berücksichtigt werden, dass die Mengenverhältnisse der beidenMethoden nicht direkt miteinander vergleichbar sind, da bei zweidimensionalen Verfahrenmit Verlusten während der Äquilibrierung und beim Übergang der Probe von der ersten in diezweite Dimension gerechnet werden muss.51

3 ErgebnisseAbb. 3.8 Ergebnis der colloidal Coomassie-Färbug. (Links): Eindimensionales SDS-Gel mit 80µg Cilienprotein;(Rechts): 2D-CTAB/ SDS-Gel mit 100µg Cilienprotein; (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): DieRichtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet.Die Proteinflecken sind im Vergleich zur Silberfärbung wesentlich schärfer voneinanderabgrenzbar und die Hintergrund-Färbung ist deutlich reduziert. Das vertikale streaking konntenicht vollständig unterdrückt werden. Das horizontale streaking wurde erfolgreich reduziert,allerdings sollte bedacht werden, dass durch colloidal Coomassie möglicherweise schwachvorhandene Streifen nicht so deutlich dargestellt werden. Vergleicht man hier dieBandenmuster beider Gele miteinander, so erscheint in der 2D-Gelelektrophorese vor allemder Bereich von etwa 40 - 70kDa wesentlich besser aufgelöst.Nachdem für die Darstellung der cilienspezifischen Membranproteine auf demeindimensionalen Gel gezeigt werden konnte, dass alle wichtigen Markerproteinenachweisbar sind, war es nun unerlässlich zu überprüfen, ob diese auch auf dem 2D-Gelidentifiziert werden können. Durch die Anwendung des kationischen Detergenz CTABanstelle von SDS in der ersten Dimension könnten nämlich nicht alle Membranproteinesolubilisiert worden sein. Der Nachweis aller Markerproteine erhöht die Wahrscheinlichkeit,dass die Mehrzahl der Cilienproteine auch durch das 2D-Gel erfasst werden und spätermassenspektrometrisch identifiziert werden können.52

3 Ergebnisse3.4 Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweiscilienspezifischer MarkerproteineZum Nachweis cilienspezifischer Markerproteine wurden die Proben nicht mit PNGaseFbehandelt, um auch die glykosylierten Formen der AC III und CNG-A2-Untereinheitnachzuweisen. Nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE wurden die Proteine auf PVDF-Membranentransferiert und wie bei der eindimensionalen Gelelektrophorese mit α-CNG-A2, α-CNG-A4,α-AC III und α-G αs/ olf (siehe Abschnitt 3.2.2) behandelt.3.4.1 Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-UntereinheitAbbildung 3.9 zeigt den Nachweis der CNG-A2-Untereinheit (linker Blot) und CNG-A4-Untereinheit (rechter Blot) des CNG-Kanals. Beim Vergleich mit Abbildung 3.3 fällt auf,dass nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE auch die unglykosylierte Variante der CNG-A2-Untereinheit nachgewiesen wurde. Diese wurde deutlich bei 76kDa detektiert. Ein etwasstärkeres Signal liefert die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa, das häufig zubeobachtende Abbauprodukt von 58kDa wurde nicht nachgewiesen (vgl. Abb. 3.3, rechts).Das CNG-A4-Signal ist wie im eindimensionalen System deutlich bei 66kDa zu erkennen.Abb. 3.9 Western Blot-Analyse von CNG-A2 (linker Blot) und CNG-A4 (rechter Blot) nach 2D-CTAB/ SDS-PAGE. Es wurde jeweils 60µg Cilien-Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): DieRichtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet. Verdünnungen der Antikörper: α-CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; α-CNG-A4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; Expositionsdauer der Membranen:jeweils 15min.53

3 Ergebnisse3.4.2 Western Blot-Analyse der AC III und von G α olfBeim immunologischen Nachweis der AC III (Abb. 3.10, links) nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE wurde nur das Abbauprodukt bei etwa 72 kDa detektiert. Möglicherweise ist dies aufeine Degradation des Proteins zurückzuführen, eine Annahme, die durch die Erscheinung desvertikalen streakings (3.3.1.1 und 3.3.1.2) bestärkt wird. In Abbildung 3.8 ist deutlich zuerkennen, dass das streaking hauptsächlich im hochmolekularen Bereich auftritt, also dort, wosowohl die glykosylierte (um 212kDa) als auch die deglykosylierte Variante (128kDa) derAC III im Gel lokalisiert ist.Abb. 3. 10 Western Blot-Analyse von AC III (linker Blot) und G α olf (rechter Blot) nach 2D-CTAB/ SDS-PAGE. Es wurde jeweils 60µg Cilien-Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): DieRichtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet. Verdünnungen der Antikörper: α-AC III, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; α-G αs olf , 1: 2000; α-rb IgG, 1: 80000; Expositionsdauer der Membranen:jeweils 15min.Die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins wurde klar bei 44kDa nachgewiesen. Diequalitativen Analysen der Präparation und der Trenntechnik konnten somit alszufriedenstellend eingestuft werden. Für die massenspektrometrische Identifizierung derCilienproteine wurde erneut ein 2D-CTAB/ SDS-Gel angefertigt und anschließend colloidalCoomassie gefärbt.54

3 Ergebnisse3.5 Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung derProteineDie Proteine wurden für die massenspektrometrische Analyse mit dem Skalpellausgeschnitten. Um möglichst alle Proteine des Gels zu erfassen, wurden nicht einzelneProteinflecken ausgewählt, sondern ein Raster angefertigt, dessen Tetragone sich mit allengefärbten Bereichen des 2D-Gels deckten. Die Gelstückchen wurden einzeln zerkleinert undin 0,5ml Eppendorf-Gefäße überführt. Die Proteine wurden anschließend entfärbt, reduziert,alkyliert und schließlich tryptisch verdaut. Die Peptide befanden sich nach dem Verdau in derFlüssigkeit, die die Gelstückchen umgibt und wurden bis zur Injektion in das HPLC-Systembei -20°C aufbewahrt. Die Injektion der Proben und die Kalibrierung desESI-Tandem-Spektrometers wurde von Herrn Dr. Uwe Warnken, Zentrale Proteinanalytik desDKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum), Heidelberg durchgeführt. Von der HPLC-Anlage aus gelangten die Peptide direkt in die ESI-Ionenquelle und von dort ionisiert in denAnalysatorteil des Tandem-Massenspektrometers (Abb. 1.9).In Abbildung 3.11 ist das Raster auf dem letztlich für die MS-Analyse verwendeten 2D-Geldargestellt, das im Rahmen des Projekts von Herrn Ulrich Mayer angefertigt wurde. DasRaster wurde von links oben nach rechts unten fortlaufend durchnummeriert.Abb. 3.11 2D-CTAB/ SDS-Gel mit Raster (2D-CTAB/ SDS-Gel:Ulrich Mayer). Die Tetragone des Rasters wurden nummeriert, um dieanalysierten Proben ihrem Herkunftsort im Gel zuordnen zu können.Es wurden 150µg Cilienproteine aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichtein kDa; (1D, 2D): Die Richtung der ersten und zweitenDimension ist durch Pfeile gekennzeichnet.55

3 Ergebnisse3.5.1 Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen ausDatenbankenDie Identifizierung der Proteine erfolgte durch den Vergleich der experimentell ermitteltenPeptid-Massen mit theoretischen Massen aus Protein-Datenbanken. Dazu wurde das speziellauf die Datenbanksuche mit Peptidmassen ausgerichtete Programm „MASCOT“ verwendet.Die MASCOT-Datenbankrecherche wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Uwe Warnken,Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, durchgeführt.Die Analyse mit dem Tandem-Massenspektrometer lieferte zunächst zwei Arten vonMassenspektren (Abb. 3.12): Das im ersten Quadrupol des Massenanalysators generierteVorläufer-Ionen Spektrum (Precursor Ion Spectrum) eines Peptids und das Fragment-IonenSpektrum dieses Peptids.Abb. 3.12 Vorläufer-Ionen Spektrum (A) und zugehöriges Fragment-Ionen Spektrum (B) eines Peptids. (I):Relative Intensität des Signals in %; die Intensität von 100% entspricht der relativen Intensität des größtenPeaks („Basispeak“); (m/z): Masse zu Ladungs-Quotient; (M+2H) 2+ : Masse eines zweifach protoniertenFragmentions; (y): Signale der y-Typ-Ionen (vgl Abb. 1.10). (verändert nach Chernushevich et al., 2001).Die Masse ist mit dem m/z-Quotienten über folgenden Zusammenhang korreliert: Einzweifach protoniertes (m=2u) Fragment mit der Masse m=1048u und der positiven Ladung+2 erscheint im Spektrum beim / z = 1048 + 2 / 2 = 525ESI-Ionenquellen in Kombination mit Tandem-Massenspektrometern liefern Spektren miteiner Auflösung von +/- 0,1Da, das heißt selbst unterschiedliche Isotope eines Fragment-Ionswerden dargestellt. Zur Datenbank-Analyse wurde jeweils die monoisotopische Masse einesFragment-Ions verwendet (Abb. 3.13). In der Regel wurde diese durch den ersten Peak des56

3 ErgebnisseIsotopenspektrums reflektiert, sofern das Rauschen des Detektors (vergrößert dargestellt)dessen Intensität nicht überdeckte.Abb. 3.13 Isotopenspektrum eines Fragmentions. Jeder Peak reflektiert dieMasse dieses Fragmentions unter Berücksichtigung verschiedenerKohlenstoff-Isotope. Zur Bestimmung der monoisotopischen Masseverwendet man üblicherweise den ersten Peak des Spektrums, sofern dessenIntensität nicht durch die Intensität des Detektor-Rauschens überdeckt wird.In diesem Fall würde der größte monoisotopische Peak des Spektrums zurMassenanalyse verwendet. (verändert nach Chernushevich et al., 2001).Die Intenstät des Detektor-Rauschens ist abhängig von der Sensibilität des Digitalwandlers,der die Stärke der durch das auftreffende Ion erzeugten Elektronenströme auf derMehrkanal-Platte in ein verwertbares digitales Signal verwandelt.Die über ihren m/z-Wert errechneten monoisotopischen Massen der Fragment-Ionen wurdendirekt durch Verwendung des Programms MASCOT einer Datenbanksuche unterzogen. DasErscheinungsbild und Ausgabeformat der Ergebnisse einer solchen Datenbank-Recherchewird im Folgenden an einem Beispiel erläutert:57

3 Ergebnisse58

3 ErgebnisseDie Kopfzeilen im oberen Drittel des Formblatts enthalten Daten wie Benutzername undinterne Analysennummer, die es dem Anwender des Programms ermöglichen, eine Sucheeindeutig einer analysierten Probe zuzuordnen. Außerdem ist dort die der Suche zu Grundeliegende Datenbank vermerkt, die der Benutzer bereits in den Voreinstellungen festlegt. Inunserem Fall wurde die Datenbank von NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, www.ncbi.nlm.nih.gov) verwendet. Im Vorfeld wurden außerdem nur solcheErgebnisse zugelassen, die gemäß ihrer Herkunft aus der Ratte den Säugetieren zugeordnetwerden konnten (im Formular nicht ersichtlich). Die Option signifikante Treffer bereits in derKopfzeile einsehen zu können, wurde ebenfalls in Anspruch genommen.MS/ MS-Daten liefern eine große Zahl an Spektren, deshalb ist es sinnvoll ein überschaubaresAusgabeformat zu wählen, das dennoch vollständig ist. Es wurde die tabellarische Auflistungvon maximal 50 („Maximum number of hits“) gefundenen Massen und identifiziertenPeptiden („Peptide Summary Report“) pro Vorläufer-Ion gewählt, die das Programm denFragment-Ionen Spektren zuordnen konnte. Der Grad der Übereinstimmung der experimentellermittelten Peptidmassen mit den theoretischen Peptidmassen der Datenbank definiert in derMassenspektrometrie einen als „Score“ bezeichneten Wert, der als Maß der Übereinstimmungfungiert. Bei der MS/ MS trägt auch die Übereinstimmung des Fragment-Ionen Spektrumsmit dem Muster theoretischer Fragment-Ionen Spektren eines Vorläufer-Peptids gleicherMasse zum Score der Peptide bei. Ein Score größer 30 (p

3 ErgebnisseIm Vorfeld wurde die Option des „Standard-Scorings“ gewählt, das heißt es wurden auchsolche Ergebnisse bei der Ausgabe berücksichtigt, deren Score-Wert kleiner als 30 ist. Eskann erst nach der Sichtung der tabellarischen Auflistung endgültig entschieden werden, obein identifiziertes Peptid, das einen niedrigen Score erzielt hat, als nicht signifikant bewertetwerden muss.Das im Beispiel aufgelistete Hitzeschockprotein hat in der Summe seiner Einzelscores einenhohen Gesamt-Score von 677, obwohl einige der Peptide einen Score

3 Ergebnisse1 14 gi34856646 57538PREDICTED: similar to Expressed sequenceAI505034 [Rattus norvegicus]2 7 gi62652134 50688PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattusnorvegicus]2 12 gi60688595 63682 HLA-B associated transcript 5 [Rattus norvegicus]2 14 gi19924182 57012olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1)[Rattus norvegicus]2 15 gi51259250 56480Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattusnorvegicus]2 17 gi57732 49734 potential ligand-binding protein [Rattus rattus]3 1 gi6978543 114293ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide[Rattus norvegicus]3 5 gi|34856103 134442PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattusnorvegicus]3 9 gi9506531 56195cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2[Rattus norvegicus]3 12 gi34880876 60761PREDICTED: similar to Putative dimethylanilinemonooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavincontaining4 10 gi6978671 76584 cyclic nucleotide gated channel 4 [Rattus norvegicus]4 11 gi30387859 44734GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattusnorvegicus]4 12 gi13928780 77313P450 (cytochrome) oxidoreductase [Rattusnorvegicus]4 15 gi16758174 60606flavin containing monooxygenase 3 [Rattusnorvegicus]4 20 gi6978549 35610ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide[Rattus norvegicus]4 21 gi62641851 109846PREDICTED: similar to alpha glucosidase II, alphasubunit [Rattus norvegicus]4 22 gi38303937 58150 Slc3a2 protein [Rattus norvegicus]4 33 gi38181831 52719 Ephx1 protein [Rattus norvegicus]4 34 gi71911 Sc 40568GTP-binding regulatory protein Go alpha chain,splice form alpha-2 [validated] - rat6 2 gi57303 111093sarcoplasmic reticulum 2+-Ca-ATPase [Rattusnorvegicus]6 3 gi8393755 121369membrane bound C2 domain containing protein[Rattus norvegicus]6 6 gi23397411 59411cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1[Rattus norvegicus]6 10 gi4079645 47755 RAREG-2.1 [Rattus norvegicus]9 1 gi25282419 67612 calnexin [Rattus norvegicus]9 5 gi62647031 95860PREDICTED: similar to H-ATPase accessory subunita4 [Rattus norvegicus]30 1 gi114523 58904 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor30 2 gi8393322 57010 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus]30 3 gi56899 62390precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattusnorvegicus]30 9 gi58865414 54468 annexin A11 (predicted) [Rattus norvegicus]30 10 gi23397411 59411cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1[Rattus norvegicus]30 14 gi6978813 47853 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus]30 22 gi13929028 54503aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2[Rattus norvegicus]30 23 gi16758758 58206 lectin, mannose-binding, 1 [Rattus norvegicus]30 25 gi220659 47668dihydrolipoamide succinyltransferase [Rattusnorvegicus]30 26 gi55741424 51383NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1,51kDa [Rattus norvegicus]30 28 gi62664168 307188 PREDICTED: similar to myosin-VIIb [Rattus61

3 Ergebnissenorvegicus]30 31 gi62664021 86917PREDICTED: similar to collectin placenta 1 [Rattusnorvegicus]31 17 gi1408198 58059 cytochrome P450olf3 [Rattus norvegicus]31 18 gi6978847 60427flavin containing monooxygenase 1 [Rattusnorvegicus]31 22 gi62654875 57215PREDICTED: similar to MGC68696 protein [Rattusnorvegicus]31 40 gi54792127 56318ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1complex, beta subunit [Rattus norvegicus]32 10 gi117206 S 56240Cytochrome P450 2B1 (CYPIIB1) (P450-B) (P450b)(P450-PB1 and P450-PB2) (P450-LM2)35 7 gi51948476 53500ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I[Rattus norvegicus]35 11 gi184268 50332 annexin A7 [Rattus norvegicus]35 12 gi13929186 47543 flotillin 2 [Rattus norvegicus]35 15 gi57539 47398ubiquitous mitochondrial creatine kinase [Rattusrattus]37 10 gi58865476 45207phosphatidylinositol glycan, class K (predicted)[Rattus norvegicus]Tab. 3.1 Tabellarische Liste der bis dato MS-identifizierten Membranproteine. Aufgelistet wurden Proteine,deren Sequenz mindestens einmal die Membran durchspannt und solche, die mit einem Lipidanker in derMembran befestigt oder indirekt über nichtkovalente Wechselwirkungen mit anderen Membranproteinen mit derMembran assoziiert sind.Kategorie 2: Lösliche Proteine, Proteine des Cytoskeletts und der ExtrazellulärenMatrixTetragon Protein Identifikations MasseNr. Nr. Nr. (Da)Protein-Information1 1 gi11560133 50788 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus]1 2 gi21245098 50711 tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus]1 5 gi71620 42066 actin beta - rat1 7 gi45737866 56079mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor[Rattus norvegicus]1 9 gi62645766 36065PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductaselike[Rattus norvegicus]1 16 gi11693172 48137 calreticulin [Rattus norvegicus]2 6 gi34856626 38067PREDICTED: similar to reticulocalbin [Rattusnorvegicus]2 9 gi587518 S 16950 keratin 18 [Rattus norvegicus]2 18 gi19424338 51667hydroxyacyl dehydrogenase, subunit B [Rattusnorvegicus]2 20 gi59808742 46632 SEC14-like 2 [Rattus norvegicus]3 3 gi|20302024 111448 hypoxia up-regulated 1 [Rattus norvegicus]3 5 gi34856103 134442PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattusnorvegicus]3 7 gi62641274 56609PREDICTED: similar to Tu translation elongationfactor, mitochondrial [Rattus norvegicus]3 19 gi56605938 47248thioredoxin domain containing 4 (endoplasmicreticulum) (predicted) [Rattus norvegicus]4 2 gi27465535 50095 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus]4 14 gi62644345 41430PREDICTED: similar to secretory protein precursor[Rattus norvegicus]4 18 gi|7437838 77149 long-chain-fatty-acid-CoA ligase (EC 6.2.1.3) - rat4 19 gi57012354 65190 type II keratin Kb1 [Rattus norvegicus]62

3 Ergebnisse4 27 gi11072106 50173 NEFA precursor [Rattus norvegicus]4 30 gi420265 S 2891fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat(fragment)4 36 gi62660728 46453 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus]4 37 gi1945471 38660 paraoxonase [Rattus norvegicus]5 5 gi57114290 69484 type II keratin Kb2 [Rattus norvegicus]5 14 gi62079055 51391 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus]6 4 gi12018304 201240 KPL2 protein [Rattus norvegicus]9 11 gi125296 S 42970Creatine kinase B-type (Creatine kinase, B chain)(B-CK)30 6 gi62078513 62399 carboxylesterase-like [Rattus norvegicus]30 7 gi6981324 57228prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattusnorvegicus]30 16 gi27465561 64287 sphingosine phosphate lyase 1 [Rattus norvegicus]30 18 gi38494348 54994Aldehyde dehydrogenase family 1, member A1[Rattus norvegicus]30 19 gi18266692 53069 selenium binding protein 2 [Rattus norvegicus]30 20 gi54261608 32532 Ugp2_predicted protein [Rattus norvegicus]30 33 gi6678471 50612 tubulin, alpha 7 [Mus musculus]31 11 gi13929028 5450331 23 gi14485281 55038aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2[Rattus norvegicus]aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4[Rattus norvegicus]32 8 gi488838 S 47590 CaBP1 [Rattus norvegicus]34 5 gi15805031 50460eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2[Rattus norvegicus]34 7 gi8393057 46602serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H,member 1 [Rattus norvegicus]34 11 gi62641274 56609PREDICTED: similar to Tu translation elongationfactor, mitochondrial [Rattus norvegicus]34 13 gi62656848 14811PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L35[Rattus norvegicus]35 13 gi66730294 45666 hypothetical protein LOC499913 [Rattus norvegicus]35 14 gi62079055 51391 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus]35 18 gi18543177 52176 citrate synthase [Rattus norvegicus]37 7 gi58865778 4909337 10 gi58865476 45207Tab. 3.2 Liste der löslichen, extrazellulären und cytoskelettalen Proteine.dolichyl-di-phosphooligosaccharide-proteinglycotransferase (predicted) [Rattus norvegicus]phosphatidylinositol glycan, class K (predicted)[Rattus norvegicus]Kategorie 3: Proteine mit unbekannten FunktionenTetragonNr.ProteinNr.IdentifikationsNr.Masse(Da)1 10 gi38014578 50225Protein-InformationUnknown (protein for MGC:73008) [Rattusnorvegicus]4 16 gi56737 Sc 95398 unnamed protein product [Rattus norvegicus]4 29 gi56107 Sc 47428 unnamed protein product [Rattus norvegicus]30 30 gi56198 61719 unnamed protein product [Rattus norvegicus]Tab. 3.3 Auflistung von Proteinen, die noch nicht näher beschrieben oder unbekannt sind.63

4 Diskussion4 DiskussionIn der vorliegenden Arbeit wurden zwei Methoden etabliert, die es in einem hohen Maßermöglichen, Membranproteine olfaktorischer Rezeptor-Neurone (ORN) für diemassenspektrometrische Analyse zu gewinnen. Durch die Optimierung bestehenderProtokolle zur Präparation von Cilien-Membranen konnte deren Ausbeute und somit indirektdie Protein-Ausbeute wesentlich gesteigert werden. Anschließend wurde einzweidimensionales gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren angewandt, um die isoliertenProteine möglichst quantitativ und in hoher Auflösung im Gel darzustellen.Das Ablösen ciliärer Membranen von den dendritischen Knöpfen der ORNs wurde durch dieetablierte Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967) erreicht. Es ist allerdings bis heuteunbekannt, wie Calcium-Ionen (Ca 2+ ) den Zusammenbruch des tubulären Systems bewirken.Es ist ebenfalls umstritten, ob die Anwendung dieses Verfahrens die calcium-sensitivenSignaltransduktions-Prozesse im Bereich der Cilien wesentlich beeinflusst und deshalb fürphysiologische Untersuchungen ungeeignet ist (Washburn et al., 2002). BiochemischeUntersuchungen bleiben durch den Einsatz von Ca 2+ jedoch unbeeinflusst.Für die Isolation ciliärer Membranen mit dem Ziel, Membranproteine für weiterführendeExperimente möglichst quantitativ zu gewinnen, wurde diese Methode in modifizierter Formmit Erfolg eingesetzt. Die Riechepithelien mussten während des Calcium-Schocks imSchnappdeckel-Glas gerührt werden. Möglicherweise wirken sich die dabei entstehendenScherkräfte positiv auf den Zusammenbruch der ciliären Struktur aus. Bei der sequentiellenZentrifugation konnte im Anschluß das Verschwinden der gelblichen Cilien-Membranen amäußeren Rand des decilierten Epithels beobachtet werden. Durch den Einsatz dersequentiellen Zentrifugation anstelle eines einzelnen Zentrifugationsschrittes, konnte dieAusbeute an Cilien-Membranen zwar deutlich gesteigert werden, aber möglicherweisewurden durch die zweimalige zusätzliche Resuspendierung des Gewebes, neben denCilien-Membranen auch andere Membranen, lösliche Proteine oder sogar Organellen in denÜberstand gebracht. Die anschließende Anreicherung der Cilien-Membranen durchAnwendung des Saccharose-Stufengradienten ist deshalb auch als Reinigungsschritt zubetrachten.Die cilien-spezifischen Transduktionsmoleküle AC III, G αolf , CNG-A2 und CNG-A4 wurdenals Marker verwendet, deren immunologischer Nachweis in der Präparation als positiv64

4 Diskussionbezüglich der Isolations-Methode zu bewerten ist. Dazu wurden die Proteine eindimensionaldurch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen transferiert. CNG-A2 und CNG-A4stellen dabei zwei von insgesamt drei verschiedenen Untereinheiten des CNG-Kanals dar(Dhallan et al., 1990; Goulding et al., 1992; Bradley et al., 1994, 2001; Liman und Buck,1994; Sautter et al., 1998; Bönigk et al., 1999; Munger et al., 2001; Zheng et al., 2004), derals Tetramer, bestehend aus zwei CNG-A2, CNG-A4 und CNG-B1b, in der Cilienmembraneine zentrale Pore formt, durch die nach Bindung von cAMP hauptsächlich Ca 2+ einströmt(Dzeja et al., 1999). Die Markerproteine eigneten sich in zweifacher Hinsicht zurDurchführung der Qualitätskontrolle: Sie sind die maßgeblichen Komponenten derolfaktorischen Signaltransduktion und werden deshalb hauptsächlich in den Cilien exprimiert.Bei den CNG-Untereinheiten handelt es sich außerdem um Membranproteine, derenAnwesenheit in der Präparation neben der Proteinbestimmung zusätzlich als Maßstab dafürdiente, ob Membranen beziehungsweise Membranproteine in ausreichender Menge durch dieMethode erfasst werden.Diese Aussage gilt ensprechend auch für die AC III. Zusätzlich wurde G αolf alsmembran-assoziiertes Protein der Signaltransduktionskaskade nachgewiesen. Damit ist auchgezeigt, dass unter den gegebenen Präparationsbedingungen Membrankomplexe zunächsterhalten bleiben.AC III und G αolf zeigten an dieser Stelle bei der Western Blot-Analyse allerdings deutlichstärkere Signale als CNG-A2 und CNG-A4. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen,dass den Proteinen AC III und G αolf bei der olfaktorischen Signaltransduktion direkt eineverstärkende Funktion des Rezeptorsignals zugesprochen wird (Jones und Randall, 1989).CNG-Kanäle verstärken das Signal nur indirekt über den Anstieg von [Ca 2+ ] i , welche dieÖffnung Ca 2+ -aktivierter Chlorid-Kanäle bewirkt. Sie sind deshalb möglicherweise wenigerstark in Cilien exprimiert als AC III und G αolf . Möglich ist aber auch die größere Affinität derErst-Antikörper gegen AC III und G αolf im Vergleich zu den CNG-Antikörpern. . Diese Fragekann jedoch letztlich nur durch eine vergleichende Expressions-Analyse beantwortet werden.Die in dieser Arbeit vorgestellte Präparationstechnik wurde mit dem Ziel entwickelt, ciliäreMembranproteine zweidimensional durch Gelelektrophorese zu trennen. Diese Trenntechniksollte so optimiert werden, dass es im Anschluß möglich war, die im 2D-Gel dargestelltenProteine massenspektrometrisch zu identifizieren. Diese Strategie entspricht der heute amhäufigsten angewandten methodischen Vorgehensweise zur Analyse komplexerProtein-Gemische. Als zweidimensionales Trenn-Verfahren dient üblicherweise die65

4 Diskussionisoelektrische Fokussierung (IEF) der Proteine (O´Farrell, 1975) in der ersten Dimension,gefolgt von der klassischen SDS-PAGE in der zweiten Dimension (IEF/ 2D-SDS-PAGE). DieEinführung dieser Methode in die Protein-Analytik ermöglichte erstmals die Darstellung vonbis zu 10 000 Proteinen in einem Gel (Übersicht: Westermeier, 2002). Dies entspricht einer100fach höheren Trenn-Kapazität als bei der eindimensionalen SDS-PAGE, die im Gegensatzzur IEF/ 2D-SDS-PAGE auch nicht geeignet ist, leicht unterschiedliche Modifikationen einesProteins aufzulösen. So kann zum Beispiel in einer vergleichenden Proteom-Studie nur durchAnwendung der IEF/ 2D-SDS-PAGE das veränderte Expressionsmuster einer krankhaftveränderten Zelle im Vergleich zu einer gesunden Zelle im Gel dargestellt werden.Obwohl die IEF/ 2D-SDS-PAGE in weiten Bereichen der Forschung seit Jahren erfolgreichangewendet wird, ist es trotzdem nie gelungen, diese Technik so zu optimieren, dass auchMembranproteine zuverlässig dargestellt werden konnten (Rais et al., 2004). Ursache dafürsind zwei generelle Eigenschaften der Membranproteine: Die Hydrophobizität ihrertransmembranen Regionen und die Basizität der außerhalb dieser Regionen liegendenBereiche (Lehner et al., 2003). Membranproteine lassen sich deshalb nur schwer in gängigenPuffersystemen lösen und präzipitieren häufig an ihrem isoelektrischen Punkt (Patton, 1999).Ansätze, die in der Vergangenheit eine verbesserte Löslichkeit der Membranproteine währendder isoelektrischen Fokussierung anstrebten, beruhen hauptsächlich auf der Zugabezwitterionischer Detergenzien, wie CHAPS (Chevallet et al., 1998), chaotroper Substanzen,wie Rhodanidsalz, Harnstoff und Thioharnstoff (Rabilloud, 1996; Rabilloud, 1998) oderverschiedener anderer Detergenzien. Eine verbesserte Zugänglichkeit der Membranproteinefür die IEF/ 2D-SDS-PAGE konnte nur im Einzelfall erreicht werden und ist nie auf alleMembranproteine einer Probe gleichermaßen anwendbar. Die Kombination und der Einsatzdieser Substanzen ist außerdem nur begrenzt möglich, so fallen beispielsweise nicht-ionischeDetergenzien bei Zugabe von Guanidinchlorid aus (Rehm, 2004) oder Membranproteinewerden durch den Einsatz großer Harnstoff/ Thioharnstoff-Mengen irreversibel modifiziert.Hohe Salzkonzentrationen stören außerdem die Trenn-Eigenschaften des Systems erheblichund können Proteine stark denaturieren.Die meisten Membranproteine, insbesondere stark basische, tauchen deshalb nach derisoelektrischen Fokussierung im 2D-SDS-Gel nicht auf (Rais et al., 2004).Für die Etablierung einer zweidimensionalen gelelektrophoretischen Methode zur Trennungder ciliären Membranproteine wurde deshalb die 2D-CTAB/ SDS-PAGE (Navarre et al.,2002) eingesetzt, ein Verfahren, das sich bezüglich seiner physikalisch-chemischen66

4 DiskussionEigenschaften wesentlich von der IEF/ 2D-SDS-PAGE unterscheidet. Die Proteine werdenbei der 2D-CTAB/ SDS-PAGE in beiden Dimensionen auf Grund ihrer Molekulargewichtegetrennt. Zwei wichtige Aspekte machen diese Methode besonders geeignet umMembranproteine darzustellen: Die Verwendung des kationischen DetergenzCetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), das auf Grund seiner positiven Ladung diegleichfalls positiven Ladungen basischer Regionen der Membranproteine stabilisiert, diesedeshalb in Lösung hält und gleichzeitig benachbarte Phospholipide (das ursprüngliche„Lösemittel“) verdrängt. Außerdem bewirkt der saure pH-Wert des Probenpuffers, dasslösliche Proteine mit „sauren“ isoelektrischen Punkten, noch vor dem Auftragen der Probeabgetrennt werden.Eine Reduktion der Komplexität der Protein-Zusammensetzung war aus mehreren Gründenwünschenswert. Durch die Präparation allein konnte diese zugunsten der Ausbeute nichterreicht werden. Dies wurde durch den eindimensionalen gelelektrophoretischen Vergleichder Cilienproteine mit Proteinen des olfaktorischen Gesamtepithels gezeigt (Abb. 3.2) und imAnschluss durch Western Blot-Analyse zum Nachweis nicht-ciliärer Markerproteine bestätigt(Abb. 3.6). Man konnte also davon ausgehen, dass auch lösliche Proteine in derCilien-Präparation noch vorhanden sind. Diese sind im Gegensatz zu den Membranproteinenbesser in pH-neutralen Puffern, wie sie beispielsweise bei der IEF/ 2D-SDS-PAGE eingesetztwerden, löslich und wandern deshalb zu Beginn der Elektrophorese bevorzugt in das Gel derersten Dimension. Die hydrophoben und deshalb schlechter löslichen Membranproteinehingegen aggregieren und präzipitieren in der Probentasche. Ein weiterer Punkt ist, dass beider 2D-CTAB/ SDS-PAGE die Trenn-Kapazität im Vergleich zur IEF/ 2D-SDS-PAGEdeutlich reduziert ist, da die Proteine nur auf einer Diagonalen dargestellt werden können.Aus diesen Gründen begünstigt das Abtrennen löslicher Proteine bei der2D-CTAB/ SDS-PAGE die Darstellung von Membranproteinen. Eine andere Methode, dienach den gleichen Prinzipien die Trennung von Membranproteinen ermöglicht, ist dieebenfalls angewandte 16-BAC/ SDS-PAGE (Hartinger et al., 1996; Dreger et al., 2005).Diese wurde im Rahmen dieser Arbeit getestet (nicht dargestellt), erzielte aber im Vergleichzur 2D-CTAB/ SDS-PAGE eine wesentlich schlechtere Auflösung.Das 2D-CTAB/ SDS-Gel konnte im weiteren Verlauf dieser Arbeit für diemassenspektrometrische Analyse in mehrerer Hinsicht erfolgreich optimiert werden. Die starkHintergrund-lastige Silberfärbung wurde durch die colloidal Coomassie-Färbung ersetzt,welche zudem für die MS-Analyse besser geeignet ist. Die Proben wurden außerdem zur67

4 DiskussionSchärfung des Proteinmusters deglykosyliert und Nuclease-behandelt. Dies erzielte inKombination mit einer geeigneten Probenmenge eine optimale Auflösung und das horizontalestreaking, häufig eine Folge von Nukleinsäure-Verunreinigungen oder zu hohenProbenmengen, konnte reduziert werden.Die Protein-Identität bei Anwendung dieser Trenn-Technik wurde nachfolgend auf zweiEbenen überprüft: Durch Western Blot-Analyse der Markerproteine AC III, G αolf , CNG-A2und CNG-A4 und letztlich durch die massenspektrometrische Identifizierungcilienspezifischer Proteine.Nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE konnten erneut alle ciliären Markerproteine detektiertwerden. Interessant ist hier, dass im Gegensatz zur eindimensionalen SDS-PAGE auch dieunglykosylierte Variante der CNG-A2-Untereinheit bei 76kDa nachgewiesen wurde (Abb.3.9, links), obwohl die Proben für Gele zur anschließenden Western Blot-Analyse nichtdeglykosyliert wurden. Da Glykoside die Löslichkeit eines Proteins erhöhen, ist dienicht-glykosylierte Variante mit hoher Wahrscheinlichkeit im SDS-Probenpuffer unlöslichund kann deshalb nach der 1D-SDS-PAGE nicht detektiert werden.Im Gegensatz dazu konnte von der AC III nur das häufig auftretende Abbauprodukt (vgl.Bönigk et al., 1999) bei 72kDa nachgewiesen werden. Hierfür können mehrere Ursachenverantwortlich sein: Hochmolekulare Varianten der AC III sind im CTAB-Probenpufferunlöslich, Degradation durch Proteasen, Verlust des Proteins während der Äquilibrierung imSDS-Lyse Puffer oder eine mangelhafte Äquilibrierung. Eine Degradation durch Proteasen istunwahrscheinlich, da durch den konsequenten Einsatz von Inhibitoren viele Proteasen nochwährend der Präparation irreversibel gehemmt wurden und alle anderen Markerproteineeindeutig detektiert werden konnten. Der Verlust von kleineren Proteinen durch Auswaschenwährend der Äquilibrierung ist sowohl bei der 2D-CTAB/ SDS-PAGE als auch bei derIEF/ 2D-SDS-PAGE möglich (Berkelman et al., 2000), aber bei großen Proteinen wie derAC III eher unwahrscheinlich. Eine mangelhafte Äquilibrierung deckt sich mit dem Auftretendes vertikalen streakings im höhermolekularen Bereich des 2D-Gels (Abb. 3.8). Proteine, dienicht ausreichend äquilibriert werden, tragen entweder einen Überschuß an positiver Ladungdurch das CTAB der ersten Dimension oder werden nur uneinheitlich durch SDS mit einernegativen Ladung versehen. Ersteres führt dazu, dass die Proteine in der zweiten Dimensionnicht in das Gel, sondern aus ihm heraus in den Elektrodenpuffer wandern. Dies würdeerklären, warum die üblicherweise glykosylierte Variante der AC III nicht nachgewiesenwurde. Bei ungleicher negativer Ladung wandern gleiche Proteine verschieden weit in das68

4 DiskussionGel und hinterlassen vertikale Spuren, die nach der Färbung sichtbar werden. Die Dauer derÄquilibrierung kann jedoch nicht beliebig ausgedehnt werden, da kleine Moleküle sonstausgewaschen würden. Zusammenfassend lässt sich an dieser Stelle sagen, dass dieÄquilibrierung einen kritischen Schritt zweidimensionaler gelelektrophoretischerTrenn-Verfahren darstellt, dass dabei aber mögliche Verluste durch die höhereTrenn-Kapazität toleriert werden können.Das Ziel bei der Präparation ciliärer Membranen und der Etablierung der2D-CTAB/ SDS-PAGE war die hochauflösende, aber auch quantitative Darstellung ciliärerMembranproteine für die massenspektrometrische Analyse. Ob das Detergenz CTAB inVerbindung mit Harnstoff geeignet ist um hauptsächlich Membranproteine zu lösen und obdurch die Präparationstechnik überwiegend ciliäre Membranen isoliert werden konnten, kannschließlich eindeutig nur durch die massenspektrometrische Identifizierung der im 2D-Geldargestellten Proteine beantwortet werden.Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind etwa ein Viertel der Proben analysiert worden. DieDiskussion der Ergebnisse muss deshalb exemplarisch bleiben. Die NCBI-Daten wurden mitHilfe von Datenbanken zunächst in drei Kategorien eingeteilt. Dabei konnten 50 der 99Proteine beziehungsweise Protein-Untereinheiten als Membranproteine odermembranassoziierte Proteine identifiziert werden. Ein nicht unerheblicher Anteil dieserProteine besitzt einen theoretisch ermittelten isoelektrischen Punkt (PI, siehe Anhang), derweit im Basischen liegt. Offensichtlich konnten also durch die 2D-CTAB/ SDS-PAGE auchstark basische Proteine dargestellt werden. 45 der 99 Proteine konnten löslichen,cytoskelettalen oder Matrix-Proteinen zugeordnet werden. 4 der 99 Proteine wurden alsunbekannt oder unbenannt deklariert und entsprechend eingeordnet.Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse zeigen, dass die Trenn-Methodik der2D-CTAB/ SDS-PAGE in hohem Maße geeignet ist, Membranproteine darzustellen. Über50% der identifizierten Proteine konnten dieser Kategorie zugeordnet werden. Unter dieseKategorie fällt auch die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins und ihre Spleiß-Varianteα2. Auch die CNG-A2-Untereinheit des CNG-Kanals wurde identifiziert, deren glykosylierteVariante im analysierten Bereich des A-Feldes (Abb. 3.11) lokalisiert ist. Offensichtlichkonnte durch die PNGaseF-Behandlung der Proben keine vollständige Deglykosylierungerreicht werden.CNG-A4 und das Abbauprodukt der AC III liegen im 2D-Gel außerhalb der bisheranalysierten Regionen und wurden deshalb erwartungsgemäß noch nicht nachgewiesen. Dies69

4 Diskussiongilt auch für die höhermolekulare Form der AC III. Deren unglykosylierte Variante liegt miteinem Molekulargewicht von etwa 128kDa allerdings innerhalb der analysierten Region.Dieses Ergebnis deckt sich mit der Hypothese, dass AC III beim Übergang von der ersten indie zweite Dimension der 2D-CTAB/ SDS-PAGE möglicherweise nur unzureichendäquilibriert wurde.Es würde im Rahmen dieser Arbeit zu weit führen, jedes Protein, das massenspektrometrischanalysiert wurde, im Einzelnen zu diskutieren. Deshalb werden die Ergebnisse im Folgendenso zusammengefasst, dass eine Aussage über die Qualität der Präparations- und Trenntechnikgetroffen werden kann.Unter den Proteinen der Kategorie 1 und 2 (vgl. Tab. 1 und 2) befindet sich eine auffallendhohe Zahl von Enzymen, die am Duftstoffwechsel und an der Verstoffwechslung toxischerSubstanzen beteiligt sind (so genannte xenobiotic metabolizing enzymes). Darunter befindensich auch solche, deren verminderte Expression im Alter, mit neurodegenerativenErkrankungen in Zusammenhang gebracht werden (siehe z.B. Poon et al., 2005). Einigedieser Enzyme sind in den ER- oder Mitochondrien-Membranen der Stützzellen lokalisiert.Andere werden in den olfaktorischen Mukus sezerniert. So wurden beispielsweise unter denMembranproteinen mehrere Isoformen des Cytochroms P450 identifiziert. Nach der Leber istdas olfaktorische Epithel das Gewebe mit der zweithöchsten Cytochrom P450-Konzentration(Hines et al., 2001). Die bräunliche Farbe des Epithels ist somit sicherlich auf dieHäm-Gruppe der Cytochrome zurückzuführen und möglicherweise ist die gelbliche Färbungdes Cilien-Rings (Abb. 3.1) ein Zeichen für Verunreinigungen durch Cytochrom P450-haltigeMembranen.Andere Enzyme, die massenspektrometrisch identifiziert wurden und zur Gruppe derxenobiotic metabolizing enzymes gehören, sind: Epoxid-Hydrolase, UDP-Glucuronyltransferase, Isoformen der Aldehyd-Dehydrogenasen, Isoformen der FAD-Monooxygenasen und Hydroxyacyl-Dehydrogenase.Ebenfalls zu Proteinen der Kategorie 1 und 2 gehören Calcium-Bindeproteine, wie Calnexin,CaBP1 und Calreticulin, das beispielsweise im ER-Lumen lokalisiert ist undCalcium-abhängige Proteine wie der Nodal modulator 1, Annexin A11 der äußeren Membranund Annexin A7, eine Calcium-abhängige GTPase.Unter den identifizierten Membranproteinen befinden sich auch eine Reihe vonTransportproteinen, wie zum Beispiel die H + -ATPase der Lysosomen und die Na + /K + -ATPaseder Plasmamembran. Hierzu zählt auch die ATP-Synthase der inneren70

4 DiskussionMitochondrienmembran, die zusammen mit Ubiquinon zusätzlich als Beispiel für ein Proteindes Energiestoffwechsels dient.Von den 99 Proteinen wurden vier als unbekannt beziehungsweise unbenannt deklariert.Durch die Suche nach homologen Sequenzen in Datenbanken konnten drei dieser Proteine mithoher Wahrscheinlichkeit identifiziert werden. Es handelt sich dabei um das Tubulin β2(gi38014578), die α-Kette von Enolase1 (gi56107 Sc) und die Glutamat Dehydrogenase 1(gi56198). Für das Protein gi56737 konnten keine Homologien zu bekannten Proteinengefunden werden. Zukünftige Experimente, wie die heterologe Expression oder diesubzelluläre Lokalisierung durch Antikörper, können helfen, die Funktion dieses Proteinsaufzuklären.Nach Auswertung aller Daten sollte es im Anschluss möglich sein, weitere Proteine derSignaltransduktion in den Cilien der olfaktorischen Rezeptor-Neurone zu charakterisieren undein verfeinertes Bild dieser Prozesse zu entwerfen. Dies gilt vor allem für den molekularbisher noch nicht identifizierten Ca 2+ -aktivierten Chlorid-Kanal (Frings, 1999; Eggermont,2003).Ausgehend von der Tatsache, dass die exemplarische Diskussion der bisherigen MS-Analyseals repräsentativ für die noch ausstehenden Ergebnisse anzusehen ist, kann an dieser Stelleabschließend gesagt werden, dass durch die Anwendung der 2D-CTAB/ SDS-PAGE erreichtwurde, dass mehrheitlich Membranproteine im 2D-Gel dargestellt werden konnten. Einesolche Dimension konnte durch die Anwendung der IEF/ 2D-SDS-PAGE bisher noch nichterreicht werden. Unter den identifizierten Membranproteinen befinden sich auch solche, derentheoretisch ermittelte isoelektrische Punkte weit im Basischen liegen. Es konnte also einzweidimensionales gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren etabliert werden, mit dem auchbasische Proteine im Gel dargestellt werden können.Die Identifikation ciliärer Marker-Proteine beweist zudem, dass die angewandtePräparationstechnik durchaus geeignet ist um Cilien-Membranen zu gewinnen, allerdingswaren darin auch Proteine anderer Herkunftsmembranen enthalten. DurchDatenbank-Recherche allein kann jedoch nicht in jedem Fall eine genaue Aussage über diezelluläre und subzelluläre Herkunft eines Proteins getroffen werden, da sich dieDatenbank-Beschreibungen oft nicht auf Proteine identischer Gewebe beziehen.Eine Verunreinigung der Präparation durch lösliche oder cytoskelettale Proteine konnte nichtvollkommen unterdrückt werden. Da Cilien-Strukturen aber im Wesentlichen durch ein71

4 DiskussionMikrotubuli-Gerüst aufrecht erhalten werden, muss die Präsenz tubulärer Proteine immertoleriert werden.Eine Verbesserung der Reinheit der Präparation könnte zukünftig durch die zusätzlicheAnwendung eines kontinuierlichen Saccharose-Gradienten erreicht werden. Damit würdenzum Beispiel Mitochondrien, deren Membranen zu einem nicht unerheblichen Anteil für dieVerunreinigung der Präparation verantwortlich sind, im Vorfeld abgetrennt werden. VonVorteil wäre außerdem, dass die Komplexität der Probe weiter reduziert werden könnte.Neuere Untersuchungen zur olfaktorischen Signaltransduktion zeigten, dass die Mehrzahl derProzesse von Ca 2+ / Calmodulin vermittelt werden. Dies gilt für die Aktivierung derCa 2+ / Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995) undder CaM-Kinase II und für die Regulation durch Bindung der CNG-Kanäle (Chen und Yau,1994; Liu et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004).Für den Ca 2+ -aktivierten Chlorid-Kanal ist die Ca 2+ / Calmodulin-vermittelte Regulation nochhypothetisch (Kaneko, H., unveröffentlicht). Ein vielversprechender Ansatz zur spezifischenAnreicherung von Proteinen der Signaltransduktion ist deshalb eine Vorreinigung durchCalmodulin-Affinitäts-Chromatographie.72

5 Zusammenfassung5 ZusammenfassungDer Prozess der olfaktorischen Signaltransduktion bei Säugetieren ist in seinen Abläufenbereits gut verstanden (Firestein, 2001). Dennoch konnten bisher noch nicht alle molekularenDetails der Komponenten identifiziert werden. Dies gilt im Besonderen für denCa 2+ -aktivierten Chlorid-Kanal, der den Hauptteil der Erregungsbildung in Riechneuronenträgt. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb ein geeignetes Verfahren zu entwickeln, durch dasneue Kandidaten der Signaltransduktionskaskade massenspektrometrisch identifiziert werdenkönnen. Diese sind hauptsächlich in den Cilienmembranen olfaktorischer Rezeptor-Neuronelokalisiert und es wurde deshalb eine Präparationstechnik auf Basis der Calcium-Schock-Methode etabliert, mit der die Cilienmembranen der Riechsinneszellen vomolfaktorischen Gesamtepithel isoliert werden konnten. Die Präsenz cilien-spezifischerMarkerproteine in der Präparation wurde nach eindimensionaler Gelelektrophorese durchWestern Blot-Analyse bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Präparationsmethodegeeignet ist um Proteine der Signaltransduktion für zukünftige Experimente zu gewinnen.Durch Anwendung der 2D-CTAB/ SDS-PAGE konnten die ciliären Membranproteineanschließend quantitativ und mit guter Auflösung im 2D-Gel dargestellt werden. CTAB ist alskationisches Detergenz geeignet selbst die hydrophoben und somit schwerlöslichenMembranproteine zu lösen. Dies wurde durch den immunologischen Nachweis der ciliärenMarkerproteine erneut bewiesen und durch die Ergebnisse der MS-Analyse bestätigt.Für die massenspektrometrische Identifizierung wurde ein Nano-ESI MS/ MS-Gerät mitvorgeschalteter HPLC-Anlage verwendet. Mit dieser Anordnung konnten aus komplexenProtein-Proben geringe Mengen eines Proteins analysiert werden. Neben ciliärenMembranproteinen wurden auch Proteine innerer Membranen, lösliche Proteine,cytoskelettale Proteine und Proteine der extrazellulären Matrix identifiziert. Darunter befindetsich auch ein Protein, dem bisher noch keine Funktion zugeordnet werden konnte.Möglicherweise handelt es sich hier um eines der bisher noch nicht näher molekularcharakterisierten Proteine der olfaktorischen Signaltransduktion.73

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AAnhangA AnhangUM1031_1Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 178 62 0 gi|21245098 50711; 4.88 tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 93 23 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 35 44 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 30 35 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 28 1UM1031_2Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62665247 50842; 4.82 PREDICTED: tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 243 92 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 390 143 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 76 24 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 41 55 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 38 2UM1031_3Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 321 92 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 158 73 0 gi|20302024 111448 5.11 hypoxia up-regulated 1 [Rattus norvegicus] 133 64 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 86 55 0 gi|34856103 134442 5.73 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus norvegicus] 78 46 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 37 27 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 37 28 0 gi|57429 Sc 50387; 4.79 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 28 29 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 82 183

A AnhangUM1031_4Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 876 232 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 591 193 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]430 164 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 421 135 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 390 146 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 331 107 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 257 108 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 237 109 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 234 910 0 gi|6978671 76584; 6.25 cyclic nucleotide gated channel 4 [Rattus norvegicus] 192 811 0 gi|30387859 44734; 6.23 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus norvegicus] 154 312 0 gi|13928780 77313; 5.30 P450 (cytochrome) oxidoreductase [Rattus norvegicus] 98 413 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 71 314 0 gi|62644345 41430; 5.79 PREDICTED: similar to secretory protein precursor [Rattus norvegicus] 68 215 0 gi|16758174 60606; 8.44 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus norvegicus] 61 116 0 gi|56737 Sc 95398; 4.83 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 57 217 0 gi|984553 S 38167; 5.47 G protein beta 1 subunit [Rattus norvegicus] 49 218 0 gi|7437838 77149; 7.44 long-chain-fatty-acid-CoA ligase (EC 6.2.1.3) - rat 44 119 0 gi|57012354 65190; 8.00 type II keratin Kb1 [Rattus norvegicus] 39 120 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 39 1UM1031_4ffAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62641851 109846 5.76 PREDICTED: similar to alpha glucosidase II, alpha subunit [Rattus norvegicus] 35 12 0 gi|38303937 58150; 5.19 Slc3a2 protein [Rattus norvegicus] 31 184

A AnhangUM1031_5Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62665247 50842; 4.82 PREDICTED: tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 213 72 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 160 83 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 75 44 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 49 15 0 gi|57114290 69484; 7.58 type II keratin Kb2 [Rattus norvegicus] 40 1UM1031_6Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 185 92 0 gi|57303 Sc 111093 5.27 sarcoplasmic reticulum 2+-Ca-ATPase [Rattus norvegicus] 146 73 0 gi|8393755 121369 5.47 membrane bound C2 domain containing protein [Rattus norvegicus] 48 14 0 gi|12018304 201240 5.55 KPL2 protein [Rattus norvegicus] 46 1UM1031_9Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|25282419 67612; 4.49 calnexin [Rattus norvegicus] 246 132 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 98 33 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 82 24 0 gi|38014578 50225; 4.79 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus norvegicus] 70 65 0 gi|62647031 95860; 5.93 PREDICTED: similar to H-ATPase accessory subunit a4 [Rattus norvegicus] 62 26 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 37 37 0 gi|62644345 41430; 5.79 PREDICTED: similar to secretory protein precursor [Rattus norvegicus] 34 285

A AnhangUM1031_30Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|114523 S 58904; 9.22 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor 882 192 0 gi|8393322 57010; 5.88 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus] 874 213 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 569 144 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 535 175 0 gi|6978847 60427; 8.66 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus norvegicus] 522 136 0 gi|62078513 62399; 5.90 carboxylesterase-like [Rattus norvegicus] 460 97 0 gi|6981324 57228; 4.82 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus norvegicus] 360 118 0 gi|62652134 50688; 8.05 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus norvegicus] 258 79 0 gi|58865414 54468; 7.53 annexin A11 (predicted) [Rattus norvegicus] 221 510 0 gi|23397411 59411; 8.86 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1 [Rattus norvegicus] 209 611 0 gi|16758174 60606; 8.44 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus norvegicus] 190 612 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing142 313 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 137 414 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 126 515 0 gi|51259250 56480; 6.61 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus norvegicus] 125 416 0 gi|27465561 64287; 9.26 sphingosine phosphate lyase 1 [Rattus norvegicus] 123 517 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 96 418 0 gi|38494348 54994; 7.94 Aldehyde dehydrogenase family 1, member A1 [Rattus norvegicus] 95 219 0 gi|18266692 53069; 6.10 selenium binding protein 2 [Rattus norvegicus] 80 320 0 gi|54261608 32532; 5.92 Ugp2_predicted protein [Rattus norvegicus] 76 286

A AnhangUM1031_30ffAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|55391497 56857; 5.57 ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 2 [Mus musculus] 75 42 0 gi|13929028 54503; 7.56 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2 [Rattus norvegicus] 71 13 0 gi|16758758 58206; 5.92 lectin, mannose-binding, 1 [Rattus norvegicus] 66 14 0 gi|420265 S 2891; 9.41 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat (fragment) 59 15 0 gi|220659 S 47668; 8.17 dihydrolipoamide succinyltransferase [Rattus norvegicus] 56 16 0 gi|55741424 51383; 8.37 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1, 51kDa [Rattus norvegicus] 47 17 0 gi|11072106 50173; 5.02 NEFA precursor [Rattus norvegicus] 46 18 0 gi|62664168 307188 8.65 PREDICTED: similar to myosin-VIIb [Rattus norvegicus] 42 29 0 gi|60688595 63682; 8.50 HLA-B associated transcript 5 [Rattus norvegicus] 41 110 0 gi|56198 Sc 61719; 8.05 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 39 311 0 gi|62664021 86917; 5.54 PREDICTED: similar to collectin placenta 1 [Rattus norvegicus] 37 112 0 gi|71911 Sc 40568; 5.69 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain, splice form alpha-2 [validated] - rat 36 113 0 gi|6678471 50612; 4.97 tubulin, alpha 7 [Mus musculus] 34 114 0 gi|34856646 57538; 9.11 PREDICTED: similar to Expressed sequence AI505034 [Rattus norvegicus] 34 187

UM1031_31A AnhangAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 1090 262 0 gi|6981324 57228; 4.82 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus norvegicus] 988 213 0 gi|114523 S 58904; 9.22 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor 986 194 0 gi|117148 S 58599; 8.99 Cytochrome P450 1A2 (CYPIA2) (P450-D) (P-448) 689 155 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 623 146 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]561 167 0 gi|45737866 56079; 6.69 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor [Rattus norvegicus] 560 118 0 gi|34856315 57214; 5.24 PREDICTED: similar to ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 1 [Rattus norvegicus] 497 109 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing481 1110 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 446 1011 0 gi|13929028 54503; 7.56 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2 [Rattus norvegicus] 399 1012 0 gi|56107 Sc 47428; 6.16 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 304 613 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 300 614 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 267 815 0 gi|23397411 59411; 8.86 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1 [Rattus norvegicus] 252 616 0 gi|8393322 57010; 5.88 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus] 248 617 0 gi|1408198 58059; 8.93 cytochrome P450olf3 [Rattus norvegicus] 187 618 0 gi|6978847 60427; 8.66 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus norvegicus] 160 419 0 gi|11693172 48137; 4.33 calreticulin [Rattus norvegicus] 95 320 0 gi|54792127 56318; 5.19 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta subunit [Rattus norvegicus] 93 2UM1031_ffAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 90 22 0 gi|62654875 57215; 9.31 PREDICTED: similar to MGC68696 protein [Rattus norvegicus] 82 13 0 gi|14485281 55038; 7.10 aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 [Rattus norvegicus] 65 14 0 gi|420265 S 2891; 9.41 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat (fragment) 60 15 0 gi|34856646 57538; 9.11 PREDICTED: similar to Expressed sequence AI505034 [Rattus norvegicus] 53 16 0 gi|51259250 56480; 6.61 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus norvegicus] 48 17 0 gi|62652134 50688; 8.05 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus norvegicus] 44 188

UM1031_32A AnhangAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]457 322 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 314 263 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 242 224 0 gi|54792127 56318; 5.19 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta subunit [Rattus norvegicus] 237 215 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 915 226 0 gi|45737866 56079; 6.69 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor [Rattus norvegicus] 631 137 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 628 198 0 gi|488838 S 47590; 4.95 CaBP1 [Rattus norvegicus] 490 79 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing259 6UM1031_34Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|38181831 52719; 8.59 Ephx1 protein [Rattus norvegicus] 900 282 0 gi|56605938 47248; 5.09 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus] 174 73 0 gi|19424338 51667; 9.50 hydroxyacyl dehydrogenase, subunit B [Rattus norvegicus] 145 74 0 gi|4079645 47755; 6.71 RAREG-2.1 [Rattus norvegicus] 136 55 0 gi|15805031 50460; 9.10 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2 [Rattus norvegicus] 118 46 0 gi|51948476 53500; 5.57 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I [Rattus norvegicus] 90 47 0 gi|8393057 46602; 8.88 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H, member 1 [Rattus norvegicus] 70 18 0 gi|62645766 36065; 9.16 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 68 19 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 64 210 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 62 411 0 gi|62641274 56609; 8.50 PREDICTED: similar to Tu translation elongation factor, mitochondrial [Rattus norvegicus] 56 412 0 gi|62646586 18334; 8.65 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 42 113 0 gi|62656848 14811; 10.34 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L35 [Rattus norvegicus] 37 114 0 gi|71911 Sc 40568; 5.69 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain, splice form alpha-2 [validated] - rat 28 189

UM1031_35A AnhangAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|38181831 52719; 8.59 Ephx1 protein [Rattus norvegicus] 205 332 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 165 253 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 483 144 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]347 105 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 280 106 0 gi|30387859 44734; 6.23 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus norvegicus] 242 57 0 gi|51948476 53500; 5.57 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I [Rattus norvegicus] 169 68 0 gi|59808742 46632; 7.07 SEC14-like 2 [Rattus norvegicus] 135 69 0 gi|62645766 36065; 9.16 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 112 310 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 98 311 0 gi|18426844 50332; 5.91 annexin A7 [Rattus norvegicus] 85 212 0 gi|13929186 47543; 5.18 flotillin 2 [Rattus norvegicus] 73 313 0 gi|66730294 45666; 8.90 hypothetical protein LOC499913 [Rattus norvegicus] 72 214 0 gi|62079055 51391; 8.88 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus] 71 115 0 gi|57539 Sc 47398; 8.72 ubiquitous mitochondrial creatine kinase [Rattus rattus] 60 116 0 gi|56605938 47248; 5.09 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus] 53 217 0 gi|125296 S 42970; 5.33 Creatine kinase B-type (Creatine kinase, B chain) (B-CK) 50 118 0 gi|18543177 52176; 8.53 citrate synthase [Rattus norvegicus] 40 119 0 gi|62660728 46453; 5.64 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus] 35 120 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 31 190

UM103_37A AnhangAcc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 490 182 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]331 113 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 245 84 0 gi|38014578 50225; 4.79 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus norvegicus] 229 85 0 gi|62660728 46453; 5.64 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus] 209 76 0 gi|34856626 38067; 4.67 PREDICTED: similar to reticulocalbin [Rattus norvegicus] 162 67 0 gi|58865778 49093; 5.62 dolichyl-di-phosphooligosaccharide-protein glycotransferase (predicted) [Rattus norvegicus] 153 48 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 106 59 0 gi|587518 S 16950; 4.66 keratin 18 [Rattus norvegicus] 89 310 0 gi|58865476 45207; 5.66 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted) [Rattus norvegicus] 52 211 0 gi|1945471 38660; 5.05 paraoxonase [Rattus norvegicus] 24 191