Mikrotom Vortrag Sartorius - Mikroskopfreunde-Nordhessen

flfKurz e Inhaltsangabengehalten anläßlichder VorträgeeinesKUR SUS F'ÜR MIKROTOMIEderSARTORIUS-WERKEA" G. GÖTTINGENI.tiII

Messers ganz erheblich. Hat die Schneide jedoch größere Ausbrüche, somuß das Messer geschliffen werden. Dieses geschieht auf einem feinkörnigengelben Abziehstein bzw. Arcansasstein, der auf jeden Fall befeuchtetsein muß. Je nach der Zähigkeit der verwendeten Flüssigkeit kann manmit ein und demselben Stein einen gröberen oder feineren Schliff erhalten.In Frage kommen'Wasser, Alkohol, Seifenlösungen oder Ö1. Beim Schleifenwird das Messer mit der Schneide vorangeführt" Im übrigen verfährtman wie beim Abziehen, das dem Schleifen folgen muß. Es ist jedoch wichtig,ietzt vor dem Abziehen Abziehröhre und Messer gründlich vom Schleifstaubdes Steines zu reinigen. Die Qualität der Schneide prüft man normalerweisebei 10O-facher Vergrößerung unter einem Mikroskop.Zur Schonung des Messers sollte man nie vergessen, es sofort nach demGebrauch trocken zu wischen. Es empfiehlt sich auch, das Messer einzufetten,wenn man es längere Zeit nicht benutzt.Eine andere ebenfalls zu beachtende W'inkelstellung ist der sog. Anstellwinkel.Man bezeichnet damit die Neigung des Messerkeils zur Schnittrichtung.Ganz allgemein kann gesagt werden, daß bei weichen Materialien derkleinste Winkel 60, entsprechend dem Winkel der unteren Facette betragenkann. Er muß jedoch umso steiler werden, je härter das zu schneidendeMaterial ist, und man kann hier zu Winkeln bis zu 30 bis 35o kornrnen.

3. ttDas Schneiden von Pflanzenmaterial, Hölzern, Leder und PapierrrVortragender: Prof. Dr" J, KisserVor Herstellung eines Schnittes sollte man sich zunächst fragen: ttWas willich in diesem Schnitt sehen?rt - Seine Dicke richtet sich nach dem angestrebtenZweck. Man sollte nie dünner schneiden, als es dieser erfordert; dennein Schnitt von 20 7a, Stärke ist leichter herzustellen, aLs z.B. einer von 47u!ganz abgesehen ddvon, daß der Dünnschnitt oft eine komplizierte Vorbereltungsmethodeverlangt" Das pflanzliche Objekt hat gegeru.iber dem tierlschen denVorteil, daß die einzelnen ZeTLen von Membranen aus Zellulose umgeben sind,die der Substanz für die Herstellung stärkerer Schnitte genügend Halt geben,so daß oft die Arbeit des Fixierens, Einbettens und dergl. erspart bleibt.Sollen die Ze1len möglichst ihren natürlichen Zustand beibehalten, so darfdas Messer beim Schneiden nicht mit'Wasser bef,euchtet werden, weil diesesdie verschiedenen Bestandteile der ZeIIen zum Quellen bringt. Man v€xw€ndetin solchen Fällen Zuckerlösungen, die mit dem Zellensaft nahezu isotonischsind.Das gebräuchlichste Fixierungsmittel bei pflanzlichern Material ist der Alkohol"Er entzieht den Membranen das Wasser, urodurch sie wesentlich härter,ja sogar spröde werden. Um letzteres zu vermei.den, nimmt man 50 bis 70/oigenAlkohol und überträgt das Material zur Aufbewahrung in das sog. Strasburger-FlemmingecheGemisch, das aus je einem Teil Alkohol, Wasser undGlyzerin besteht, Das Mischungsverhältnis I : I : I kann variiert werden.Wird das Material zu weich, erhöht man den Alkoholzusatzl wird es zu hart,so nimmt man mehr Glyzerin"Um dieses pflanzliche Material in der Objektklammer des Mikrotoms befestigenzu können und ihm den nötigen Halt zu geben, klemmt man es je nach Härtezwischen Holundermark, holzfreien Kork oder Lindenholz und dann wirdmit einem möglichst schräggestellten Messer unter Befeuchtung mit jenerFlüssigkeit, in der das Materialkonserrriertwurde, geschnitten. - Holz läßtsich am besten im grünen Z:ustand schneiden. Durch das Austrocknen erfährtes Veränderungen durch Verdichtung der Membranen, die durch nachträglichesQuellen nicht mehr rückgängig gemacht werden können. Dennoch gelingtes, trockenes Holz durch Einweichen bzw. Auskochen in Wasser mit etwasGLyzetinzusatz oder durch Einweichen in Terpinol genügend zu erweichen, umes in einen gut schneidbaren Zustand zu versetzen, Bei sehr harten Hölzern(Kokosschale) kommt man auch noch zu guten Ergebnissen, wenn man das Objektwährend der Schnittanfertigung mit Dömpfen behandelt oder mindestensrnit heißem Wasser berieselt. Doch ist hierbei an einen genügenden Schutzdes Mikrotoms zu denken. Alle Metallteile sind mit Plastik oder öhnlichemabzudecken, außerdem hat man heute die Silikonöle als gutes wasserabweisendesMaterial zur Verfügungr Fr.ir derartig spezielle Fätle sind außerdemauch Spezialmesser aus nichtrostendem Stahl zu verwend.en.Bei der Orientierung der Hö1zer in der Objektklammer sollen diese stets soeingespannt werden, daß die Jahresringe senkrecht zut Messerbahn stehen,weil das Spätholz meist erheblich härter ist, als das im Frühjahr gewachsene.Es ist der Sinn dieser Orientierung, daß das Messer gleichzeitig in das harteund weiche Holz eintritt.Lederuntersuchungen sind relativ einfach. Dickere Sorten, wie Sohlenleder,lassen sich ohne Einbettung recht gut schneiden" Sind 6ie zu spröde, so bringtb. w.

man sie einige Zeit in eine feuchte Atmosphäre. Dünnere Leder, die beirnSchneiden ein widerlager benötigen, erhalten dieses - wie eingangs erwähnt- durch Kork oder Lindenholz. Auch das Leder hat auf d.er Haarseitedichtere Schichten, während es im Innern lockerer ist. Es muß alsoin der Objektklammer ebenfalls so orientiert werden, d"aß das Messer gleichzeitigin beide Schichten eintritt. Sollte diese Orientierung aus irgendwelchenGründen nicht möglich sein, so muß darauf geachtet werd.en, daß dasMesser von dem weicheren Teil in den harten vord.ringen kann. Muß dasLeder eingebettet werden, so ist Paraffin für diesen Zweck denkbar ungeeignet,denn durch die voll.kommene Entwässerung wird das Leder spröde,auch treten unerwünschte Schrumpfungen auf. Hier ist Celloidin das ambesten geeignete Einbettungsmaterial. - Rohhöute, die noch nicht gehärtetsind, lassen sich sehr gut nach der Gefriermethode schneiden, nachdem siemit Formol gehärtet wurden.

4. rtschwierigkeiten und tr'eh1er beim schneiden mit MikrotomenllVortragende: Frl. Marth'enDer Einbettung in Paraffin a}s auch in Celloidin muß eine sorgfältige Entwässerungvorausgehen. Flir eine schnelle Diagnose kann die Entwässerungdurch hochprozentigen Alkohol rasch erfolgen" Dieses verfahren führt jedochzu schrumpfungen des Materials" Deshalb rnuß bei objekten, die fürForschungszwecke dienen sollen, eine schonende Behandlung durch allmählicheSteigerung des Alkoholgehaltes der Entwäs serungsbäder durchgeführtwerden" Ist die Entwösserung nicht restlos gelungen, so zeigen sich beimSchneiden weiße Flecken und der Schnitt splittert. Nach kurz et Zeit schrumpftdas Material innerhalb des Paraffins bzw" Celloidins und wird hart und spröde.Zur Beseitigung dieses Fehlers muß nochmals entparaffiniert werden, wasam zweckmäßigsten mit Methylbenzoat geschieht. Ist der Paraffinblock nichtvon gleichrnaßiger Beschaffenheit, das zeigen die weißen Flecken und einigeBlasen, so daß beim Schneiden das Paraffin abbröckelt, so war das Paraffinbeim Gießen nicht warrn genug. Es fehlt die innige Verbindung zwischen demMaterial und dem Gießparaffin. Bröckeln des Schnittes kann aber auch einZeichen dafür sein, daß noch Reste des Intermediums, wie Benzol, Chloroformod,er ähnliches, im Paraffin enthalten sind. Der Block rnuß nochmalsaufgelöst werden. Die Reste des Intermediums können durch starkes Erhitzenaus dem Paraffin errtfernt werden" Größere Luftblasen innerhalb des Objekteslassen sich nachträglich durch heißes Paraffin evtl. unter Zuhilfenahmeeiner erwärmtenNadel leicht ausfüllen.wichtig ist die 'w'ahl des Paraffins. F\ir Teile aus dem zentralen Nervensystemgenügt ein weicheres Paraffin als es für die bindegewebsreichen Organebenötigt wird.Schwieriger und langwieriger ist die Einbettung in Celloidin, da man daraufachten muß, daß man einen Celloidlnblock von durchgehend gleichmäßigerFestigkeit bekommt. Zweckmäßig ist es, das Objekt nur soweit mit Celloidinzu überschichten, daß es gerade bedeckt ist. Von Zeit zu Zeit wird etwasdickeres Celloidin nachgegossen. Dadurch wird erreicht, daß die obersteSchicht nicht schon erhärtet ist, während die Mitte noch weich ist. Der größteFeind des Celloidins ist die Feuchtigkeit. Ist diese im Celloidin' so erscheintes trübe oder milchig, und ein solcher Block bekommt nie die richtigeFestigkeit. Das Celloidin muß wieder abgeschnitten werden, der Restmittels Aetheralkohol gelöst und anschließend in absolutem Alkohol nochrnalsgründlich entwässert werden. Ist das Celloidin zu hart geworden undfängt es an, sich zu krümmen' so kann man dieses durch Übergießen mit etwasCelloidin rückgängig machen.Das eingebettete Objekt muß nun auf einem Objekttisch befestigt werden. Esist empiehlenswert, Kunststofftische, wie sie von den Mikrotom-Herstellerngeliefert werden, zu verwend.en. Aus Billigkeitsgründ.en behilft man sich oftmit Holzklötzchen. Diese haben jedoch den Nachteil, daß sie einmal, wennsie zum Kühlen des Paraffinblockes in'Wassef, gelegt werden, quellen, andererseitsin der Objektklamrner zusammengedrückt werden. Der Block sltztdann nicht richtig fest und falls man ihn bei einem dickeren Schnitt nichtgarlz ablöst, so werden doch die schnitte meist ungleichmäßig.Von großer Bedeutung ist es, daß rnan für die vorliegenden Arbeiten den jeweilsam besten geeigneten Mikrotorntyp auswäh1t u4d vor jedem Schneidenb. wo

die Gleitflächen ölt" Den Objektblock schneidet man auf das unbedingt erforderlicheMaß, um d.as Messer nicht stärker a1s nötig zu beanspruchen.Sollen Serienschnitte oder Schnittbänder hergestellt werden, ist darauf zuachten, daß die beiden paral1el zum Messer verlaufenden Blockkanten wirklichparallel sind. Erhält man keine gleichmäßigen Schnitte, so ist zu prüfen,ob a1le Schrauben auch wirklich fest angezoger. sind. Ferner ist daraufzu achten, daß das Messer den optimaLen Anstellwinkel zum Objekt hat. Istdies nicht der Fall, so kann der Schnitt entweder splittern od.er er wird. zusammengedrückt.- Jedoch auch die Konsistenz des Paraffinblockes kanndie Ursache dieser Erscheinung sein. Ist er zu weich, schieben sich dieSchnitte zusammen. Meist versucht man, durch Kühlen Abhilfe zu schaffen,ehe man in ein hartes Paraffin umbettet. Ist der Block zu inart, splitterndie Schnitte. Abhilfe kann durch Anhauchen, Erwärmen mit dem Handballenoder Erhöhung der Raumtemperatur durch Aufstellen einer Lampe odereiner Heizsonne geschaffen werden. Je nach Konsistenz läßt sich durchschnelles oder langsames Durchziehen des Messers die Qualität der Schnitteverbessern. Ein sich zusammenschiebender Schnitt kann oft durch zartesPusten gestreckt werden. Längsstreifen im Schnitt treten entwed.er auf beiVerunreinigung der Messerschneide, durch Paraffinreste, die rnittels Xylolentfernt werden können, oder durch Scharten im Messer, d.ie durch y'.bziehenbeseitigt werden müssen. Es können aber auch kalkhaltige Partikel nochim Block vorhanden sein, die durch ein Calciumlösungsmittel entfernt werdenmüssen. Seht hinderlich können elektrostatische Aufladungen sein, diebewirken, daß der Schnitt am Messer klebt. Es ist dann empfehlenswert,einen rnöglichst großen Wassertropfen a.rrJ 4"" Messer aufzubringen, aufdem der Schnitt dann schwimmt. Auch das Überziehen d,es Messers miteiner Paraffinschicht, indem man es mit einem Stück harten Paraffins bestreicht,hat sich bewährt.Beim Herstellen von Celloidinschnitten muß grundsätzlich nicht nur das Messer'sondern vor allem auch der Block stark mit Alkohol befeuchtet werden,und man muß darauf achten, den Block gLeich nach dem Schnitt wiederzu befeuchten, damit er nicht einen Augenblick trocken ist. Erst dann kannman sich der W'eiterbehandlung des Schnittes zuwenden. Will man über langeZeit ein zuverlässiges Mikrotom haben, dann vergesse man nicht, nachjeder Benutzung dasselbe zu reinigen.

5. rtDie klas sischen Einbettungsverf ahren in der Mikrotomiemit Paraf f in , C elloidin 11'2."m6rtVortragender: Prof. Dr" J. KisserBei der Einbettung wird eine vollkommene Durchtränkung und Homogenisierungdes Materials angestrebt, wobei gleichzeitig eine gute Schneidkonsistenz erreichtwerd.en soll. Hier hat sich die Paraf f in- Method e seit langem ausgezeichnetbewährt. Es gibt Paraffin mit verschiedenen Schmelzpunkten zwischen45o bis 701 und je niedriger der Schmelzpunkt ist, desto weicher istdas Paraffin. Dadurch ist man in der Lage, die Paraffinsorte nach der Härtedes Objektes zu wählen. Außerdem hat man die Möglichkeit, die Schneidetemperaturzu ändern und damit die Härte des Paraffins zu regulieren. Paraffingestattet auch die Herstellung von lückenlosen Serienschnitten, bei denen dieVorderkante däs folgenden Schnittes mit der rückwärtigen Kante des jeweilsvoraufgegangenen fest zusammenklebt. Ein weiterer Vorteil der Paraffineinbettungenist darin zu sehen, daß bei entsprechend richtiger Anwendung dasObjekt nicht nachteilig deforrniert wird.Das lebende Objekt muß zunächst abgetötet, d.h. fixiert werden, damit seinStrukturaufbau erhalten bleibt" Das Fixierungsrnittel muß gründlich rnit Wasserund, z:uletzt rnit dest. Wasser ausgewaschen werden. Anschließend wirddas Objekt entwässert. Dieses geschieht durch Alkohol. Bei unempfindlicherenObjekten kann gleich ein höherprozentiger Alkohol verwendet werden. Ist jedocheine schonende Behandlung erforderlich, so passiert das Objekt eine Reihevon Bädern mit steigend.em Alkoholgehalt und gelangt zuLetzt in 96/oigen.Dieser muß auf alle Fä1le zweimalgewechselt werden. Anschließend wird einIntermedium, das sowohl mit'W'asser als auch mit einem Lösungsmittel fürParaffin mischbar ist, genommen. Da der Athylalkohol einerseits mit Wasser,andererseits mit einem Lösungsmittel für Paraffin mischbar ist, kann,man jetzt das Objekt in ein derartiges Lösungsmittel übertragen. 11 Fragekomrnen Chloroform (Siedepunkt 6L,zoC), Benzol (Sied.epunkt q0,4oC), >fl.tgt(sieaepun@oaü;2ältr@e Cedernholzöl. A- bu"t"tt g""igttjt t-"t Chl.ungeeignetsten Xylol, das wegen desäITffiffiiä-aliäffiund vlele Ub:verwendeti rnaraus dem 96/oigen Alkohol nicht direkt in Ben-zo|, sond.ern zunächst in eine Mischung von 3 Teilen Alkohol und I Teil Benzoi,dann in eine aus gleichen Teilen Alkohol und Benzol und zum Schluß in ein Gemischaus I Teil Alkohol und 3 Teilen Benzol. Das Material wird in jeder Mischungsolange belassen, bis beim Schütteln keine Schlieren mehr bemerkbarsind, ein Zeichen daftir, daß die Diffusion des 96/"igen Alkohols in das Alkohol-Benzol-Gernisch restlos vor sich gegangen ist. Anschließend kommt das Materialin reines Benzol, das ebenfalls 2weimal gewechselt werden muß. Infolgeseiner hohen Lichtbrechung macht das Benzol das Material aot"h"i!htlg-g-9-man efKennf, erKe SOtOff,, ffiIähreihafteOD 1n lnm elne Ienlefnalle trübe fXuoe Stelle Df,eIIe vorhanden vu-cILLIIqeII ist. r.uL.@eizi'nrnertemperaturvonZeitzuZeitetwasParaffirLzI.Meist kommt man mit den Sorten der Schmelzpunkte 54' 56oC bzw. 60 - 6ZoCaus. Das Paraffin muß rein und frei von flüchtigen Kohlenwasserstoffen sein.Am besten 1äßt man es deshalb vor Gebrauch längere Zeit irn geschmolzenenZustand stehen; dabei gehen die flüchtigen Bestandteile heraus und Verunreinigungensetzen sich zu Boden. Ist das Benzol bei Zimmertemperatur mitParaffin gesättigt, so bringt man es in einen Thermostaten bei 30 bis 35oCund setzt vonZeit zwZeit wieder etwas Paraffin zu. Dann sorgt rnan durchErhöhung der Temperatur für die Verdunstung des Benzols.b. w.

z -Um aber a1le Spuren des Lösungsmittels zu entfernen, wird das Paraffin abgegossenund durch reines, benzolfreies ersetzt. Soweit die Durchtrönkung desMaterial s.Zum eigentlichen Einbetten gießt man in ein geeignetes Gefäß reines Paraffin.Ist dieses Gefäß z"Bo einPorzellanschälchen, so müssen die Wände mit Glyzerineingerieben werden, damit der Block sich später herauslöst" Mit einerangewärmten Nadel werden die Objekte im Paraffin orientiert und dann läßtman dieses erstarren. Sobald sich eine entsprechend starke oberflächlicheParaffinhaut gebildet hat, kommt das Gefäß mit dem Paraffin zum raschen Erstarrenin kaltes Wasser. Läßt man Paraffin langsam erstarren, so kristalli"i.rt."; ." *ird *"iß onDer so gewonnene Block wird entsprechend der in ihm enthaltenen Objekte ineinzelne K1ötzchen zerteilt, die mit der notwendigen Orientierung auf den Objekttischendes Mikrotoms mit Paraffin aufgeklebt werden. W'ennmanP;r,raffinschnittein eine Farbstofflösung bringt, so erkennt man, daß sich trotz d.erUmhüllung mit Paraffin der Schnitt anfärben läßt. Das ist ein Zeichen dafür,daß das Paraffin wohl irn ZeLleninnern, aber nicht in den submikroskopischenRäumen der Membrane ist. Daher verrnag man auch ein in Paraffin eingebettetesMaterial zur nachträglichen Erweichung zLL quellen, wenn man einen Anschnittherstellt und diesen über längere Zeit in Wasser oder besser in einensehr verdünnten Alkohol (20 bis 30 %) einlegt. Ein Antiseptikum sollte nichtvergessen werden.Die Schnitte werden auf dem Objektträger mittels Eiweißglyzerin aufgeklebt,das man sich aus einer Mischung von gfeichen Teilen Hühnereiweiß und Glyzerinunter Zasatz von I g Natriumsilizylat oder I /o Karbolsäure-Phenol alsAntiseptikum herstellt. Das Ganze wird kräftig geschüttelt und filtriert undist lange Zeit haltbar. - Der Objektträger muß völlig fettfrei sein, ehe er miteiner Spur Eiweißglyzerin hauchdünn eingerieben wird.Die Schnitte werden entweder in einer W'asserschale mit temperiertem Wasseroder direkt auf den Objektträgern gestreckt, indem man auf diese reichlichWasser bringt, den Schnitt darauf schwimmen läßt und vorsichtig auf ungefahr40 bis 45o C erwärmt. Das überschüssige'Wasser wird abgesaugt unddann läßt man den Objektträger vollkommen trocken werden. Dann schmilztman das Paraffin über einer Flamme kurz auf und kann es mit Benzol herauslösen,während der schnitt auf dem objektträger kleben bleibt.Die Celloidin-MethodeDas Celloidin ist in einem Gemisch aus gleichen TeilenAlkohol und Aether ge-Iöst. Bei höchsten Ansprüchen, wenn sehr dünne Schnitte gemacht werden müssen,muß absoluter Alkohol und wasserfreier Aether verwandt werd.en. In normalenFöllen reicht jedoch 96/"iget Alkohol und gewöhnlicher Aether. Manstellt sich 2-, 4- und 8/oige Celloidin-Lösungen her und überträgt das nachobigem Verfahren entwässerte Material zunächst in ein Gemisch aus Alkohol*Aether und aus diesem zunächst in die Z/"ige Celloidin-Lösung. Die Einwirkungsdauerbeträgt je nach Material Stunden bis Tage. Dann wird die Z/"igeCelloidin-Lösung durch eine /oige und nach errtsprechend.er Einwirkungsdauerdurch eine 8/oige Lösung ersetzt. Ist die Durchtränkung beend.et, so muß dasLösungsmaterial zum Verdunsten gebracht und das Celloidin eingedickt werden.Dieses geschieht in einem Exsikkator,damit der Alkohol kein Wasser ausder Luft anziehen kann. Die Verdunstung muß so reguliert werden, daß sichnicht oberflächlich eine Kruste bildet, während im Innern das Celloidin nochweich ist (vergl. Vortrag von Frl. Marthen).

" 3 -Fthlt sich das Celloidin nicht mehr plastisch an, so kann es gehärtet werden.Dieses geschieht,inCem maninden Exsikkator entweder ein Schälchen mit Chloroformoder rnit 7}/"igem Alkohol hineinstellt, so daß die Chloroform- bzw.'W'irkungAlkohldämpfe ihre härtendeausüben können. Nach 24 Stunden schneidetman dieses Celloidin in einzelne Blöcke, die zur weiteren Härtung in 70%-igen Alkohol kommen. Je länger dieser einwirkt, umso günstiger ist die Schneidekonsistenz.Zum Schneiden werden die Blöcke entweder zwischen Kork, Holundermarkoder Lindenholz eingespannt oder auf den Objekttisch mit einer 8/oigenCelloidinlösung aufgeklebt. Dazw muß die untere F1äche des Celloidinklötzchensmit einer Nadel aufgerauht und durch einen Tropfen Alkohol-Aetheraufgeweicht werden. Dann drückt man ihn auf die 8/"ige Celloidin-Lösung undumschmiert noch rundherum mit derselben. Eine Viertelstunde muß er zurVerfestigung stehen bleiben; jedoch darf in dieser Zeit dey Block selber nichtaustrocknen. Er muß deshalb von Zeit zu Zeit rnit T}/"igern Alkohol befeuchtetwerden. Nach einer Viertelstunde kommt das ganze in 7l/oigen Alkohol, wodurchauch das zum Aufkitten verwendete Celloidin gehärtet wird. Geschnittenwird unter reichlicher Befeuchtung rnit 7}/rigemAlkohol mit schräggestell.temMesser bei möglichst kleinem Schnittwinkel.Di e C e 11o i d in - P ar aff ir.r.- M et hod ewird in der 'Weise durchgefülirt, daß das Mateial nach Einbettung in Celloidinmittels Chloroformdämpfe und anschließend durch Chloroform selbst gehärtetwird. Um nun alle Wasserspuren aus dem Celloidinblock zu entfernen, kommter in das apäthysche Ölgemisch. Dieses besteht aus 4 Gewichtsteilen Chloroform,Z Teilen Origanumöl, 4 Teilen CedernhoLzöL, I Teil absolutem Alkoholund I Teil kristallisiertem Phenol. Die Blöcke bleiben in diesem Gemisch bissie vollkommen durchsichtig sind. Dann kommen sie in mehrfach gewechseltesBenzol und dann werden sie in normaler Weise in Paraffin eingebettet.Man erhölt dann eine Masse von hornartiger Konsistettz, die mit schräggestelltemMesser Schnitte bis zu 2 yuohne Schwierigkeit zuläßt.Hat man Material zu schneiden, wie Papier oder Karton, von dem die Schnitteleicht zerfasern, so hat man die Möglichkeit, diese mittels eines Klebefilms(Tesafilm), dut vor dem Schneiden auf die Anschnittfläche gedrückt wird,sehr dünne Schnitte herzustellen, ohne daß sie auseinanderfallen können. Eineweitere Möglichkeit besteht in dem sog. Celloidonageverfahren, das daraufberuht, daß man auf die Objektoberfläche eine verdünnte l- bis Z/"ige Celloidinlösungauftropft, einige Minuten wartet, bis der Alkohol-Aether verdunstetist, dann zur Härtung einen Tropfen 7}/oi,gen Alkohol aufbringt und auch unterBefeuchtung mit diesem schneidet. Es ist dies eine Schnelleinbettung der oberstenSchicht in Cell'oidin, die deshalb möglich ist, weil ja in diesem Fall nichtdie Bestandteile des Objektes, z.B. die Fasern, sondern nur die Hohlräumezwischen ihnen durchdrungen werden sollen.Eine andere Einbettungsmöglichkeit für Papier besteht in einem Versteifen desselbendurch beidseitiges Aufkleben von Tesafilm. Geschnitten wird d.ann zwischenKork. Ein weiteres Verfahren wurde von Jayme und Harders-steinhäuserangegeben, die das Papier zwischen zwei starken Polyäthylenfolien klemm en,das ganze in einem Trockenschrank auf I lOoC erwärmen, so daß die d.as Papierrundherum überragenden Polyäthylenfolien rnit ihr en Rändern ver s chm eLz en.Hier wird also das Papier zusammen mit dem Polyäthylen geschnitten.Auf andere Kunstharzeinbettungen wird in einern anderen Vortrag eingegangen.

6. ttDie Gef riermethode und typische obj ekte dafürrtVortragende: Frl. RötticherNach der Gefriermethode wird Gewebegut geschnitten, von dem irr möglichstkurzer Zeit eine Diagnose benötigt wird. Es sollte stets in einer S/"igen Formalin-Lösungfixiert werden, wobei man eine halbe bis eine Stunde in einemWasserbad gut erwärmt" Die Schneidbarkeit hängt nicht von der Größe, sorrdernvon der Konsistenz des Gewebes ab, d.h. ob es fest oder lose und zetfallenist. Die Gefriermethode wird anderen auch deshalb gern vorgezogen'da bei ihr das Gewebe am besten erhalten bleibt, während die verschiedenenEinbettungsverfahren stets zu Schrumpfungen des Materials führen.Das abgespülte Gewebestück wird auf ein angefeuchtetes Filterpapier und beid.esgemeinsam auf den Gefriertisch des Mikrotoms gelegt. Dabei ist daraufzu achten, daß äußere Kapseln od.er Häute an der dem Messer zugewandtenSeite liegen, damit sie beim Schneiden nicht abgerissen werden" Muskelfasernorientiert man arn günstigsten quer zum Messer"Indem man in kurzen Abständen etwas Kohlensäure in den Gefriertisch einläßt'1äßt man das Gewebestück von unten her etwa 3 bis 4 mm hoch gefrieren. Derweiche ungefrorene Teil wird nun vorsichtig geschnitten, wobei rnan daraufachtet, daß das Mikrotommesser nicht in die härtere gefrorene Zote gerät.Niemals darf man von gefrorenen Objekten dicke Schnitte abschneiden, wennman nicht die Schneide des Me*e ers stark gefährden will" Die übliche Schnittstörkebewegt sich zwischen l0 und 20 1u,Miteinem Pinsel oder auch der Fingerkuppeüberträgt man den Schnitt in dine Schale mit Wasser" Wenn rnan denpinsel vorher rniiSOTigem Alkohol benetzt, streckt er sich besonders gut aufder .lMasseroberfläche. Von hier wird er mit einem Objektträger aufgenomrnenund mit einer feinen Nadel auseinandergezogen" Fettreiches Gewebe rnachtSchwierigkeiten, weil es leicht am Messer kleben bleibt" Hier hilft stets Alkoholoder Aether. Beides darf man jedoch nur nehmen, wenn kein Fettnachweiserbracht werden muß, da Alkohol und Aether das Fett zerstören. Sind Fettnachweiseerforderlich, so wählt rnan eine Gelatine-Einbettung. Die Gelatineblöckichen werden in ZO/"igem Formalin gehartet und dann im Gefrierzustand geschnitten"Das Aufkleben der Schnitte erfolgt rnit EiweißgLyzerin.Hat man einen Gefrierapparat mit einer Messerkühlvorrichtung,, so ist man auchin der Lage, völlig unfixiertes Material zu schneiden'Sollen Diagnosen in wenigen Minuten, d. h. noch während der Operation gestelltwerden, so wird das errtnornmene Gewebe in einer 5/oigen Formalinlösung starkerhitzt, und die Schnitte werden in eine angewärrrrte Farbe gebracht, da durchdas Erwärmen der Arbeitsgang erheblich abgekürzt wird" Er kann in 5 bis 10Minuten beendet sein.Auch in der Botanik ist die Gefriermethode sehr gut anwendbar' wenn es sichdarum handelt, sehr saftige und großzellige Gewebe zu schneiden. Sind diesejedoch sehr locker, so ist es zweckmäßiger, sie mit Gelatine zu durchtränken.Dazw bringt man sie zunächst in eine I?,S/oige Gelatinelösung in I)/"igem Karbolwasser,die im Thermostaten bei 3?oC stehen muß. Nach etwa 24 Stundenwird diese Gelatinelösung durch eine Z1/"ige ersetzt.Auch die Anfertigung von Papierschnitten ist sehr gut nach der Gefriermethodemöglich, wie von Jayme und Harders-steinhäuser angegeben wurde. Dabei wirdein schrnaler Papierstreifen, der nur 3 bis 4 mm hoch sein kann, mit der Pinzetteaufrecht in etwas Wasser gehalten, das rnan auf den Gefriertisch gebrachtbo W.

hat. Dann läßt man Kohlensäure einströmen, damit der Papierstreifen anfriertund'aufrecht steht. Nun wird nach und nach soviel Wasser dazugegeben,bis er völlig in Eis eingeschlossen ist" Statt in'W'asser, kann manPapier auch gut in Gummi-Arabicum-Lösung oder Gelatine einfrieren.Liegen weiche Papiersorten vor, die keine Benetzung vertragen, so tauchtman sie kurz in Paraffin, damit sich eine oberflächliche dünne Paraffinhautbildet. Dieses von einem Paraffinmantel umgebene Papier wird nachder oben geschilderten lr,{ethode eingefroren.

7. rtErfahrungen über Einbettungen in Kunstharze für Textilienund andere MaterialienslVortragender: Prof. Dr. J" KisserBei der Untersuchung, z.B. von Textilien,muß man sich zuerst die Frage vorlegen,was mit dieser Untersuchung bezweckt werden soll; ist sie rein diagnostischoder so1len bestimmte Teilstrukturen oder chemische Veränderungen zu erkennensein. Danach richtet es sich, ob man mit einer einfachen Methodik auskommtoder eine kompliziertere anwenden muß. Ein einfaches Verfahren besteht im Umhü1lendieser Fasermaterialien mit Gummi-Glyzerin. Gummi-Glyzerin ist einedünne Lösung von Gummi-Arabicum mit etwas Glyzerin. Man 1äßt die Umhüllungeintrocknen und kann die verklebten Fasern zwischen Kork einklemmen und schneiden.Oft genügt es auch, mit Hilfe einer Nadel und eines Zwirnfadens ein Faserbünde1in ein Stück Kork hineinzuziehen, den Kork anzuschneiden und die An:s chnittfläche im auffallenden Licht zu untersuchen.Fasern sind trotz ihrer Geschmeidigkeit im trockenen Zustand von ziemlicherHärte, so daß Einbettungen in Paraffin und Celloidin zu weich sind. Sehr gut hatsich jedoch die Celloidin-Paraffin-Methode bewährt, die nur den Nachteil hat, daßsie sehr lange dauert. Diese Einbettungsmethode wurde bereits an anderer Stelleausführlich beschrieben" Die Schnittanfertigung erfolgt mit schräggestelltem Messer.In neuerer Zeit werden Textilien viel in Gießharze eingebettet. Dazw werdensie in einem Papprahmen montiert und in ein geeignetes Gefäß gebracht und mitdem mit 2 /o eines Härters versetzten Gießharz übergossen. nei 65oC im Trokkenschrankpolymerisiert das Harz zu einer harten, gut schneidbaren Masse.Sehr gut geeignet ist Plexiglas, ein Polymerisationsprodukt der Methacrylsäureester.Man unterscheidet hier das Butyl-Methacrylat und das Methyl-Methacrylat.W'ährend das erstere die Härte eines Paraffins hat, ist das letztere erheblich härter.Durcln Zugaben von 5 bis Z0 % Methyl-Methacrylat zu Butyl-Methacrylat kannman die Härte des Plexiglases der des einzubettenden Objektes anpassen. DieMethacrylate liefert Röhm & Haas als Monomere, die mit einem Stabilisator versetztsind, damit sie länger haltbar bleiben. Vor Gebrauch muß der Stabilisatorentfernt werden. Man kann auch eine gebrauchsfertige Lösung, das sog. Plexigumbeziehen, das jedoch im Eisschrank aufbewahrt werden muß, damit es einigeZeit haltbar bleibt. Die Ob.jekte müssen durch Alkohol entwässert werden. Dabeimuß auf jeden FaIl zum Schluß absoluter Alkohol verwendet werden, damit keinW'asser in das Methacrylat gelangt. Das Duichtränken mit Methacrylat geschiehtam besten stufenweise, indem man zunächst ein Gemisch von 3 Teilen absolutemAlkohol und I Teil Methacrylat, später ein Gemisch von gleichen Teilen und daraufein Gemisch aus I Teil Alkohol und 3 Teilen Methacrylat verwendet" Erst dannüberträgt man in reines Methacrylat, das dann jedoch noch zweimal gewechseltwerden muß. Dern letzten Methaerylat wird a1s Polyrnerisations-Katalysator eineMenge von 2 % Oictttorbenzol-Peroxyd zagesetzt. Luftblasen werden entfernt, indemman das Einbettgefäß etwa l0 Minuten im evakuierten Exsikkator beläßt. AlsPolymerisations-Gefäß verwendet man Gelatine-Kapseln, die rnöglichst bis zumRand gefüllt und durch einen kleinen Deckel so verschlossen werden, daß möglichstwenig Luft mit dem Methacrylat in Berührung kommt. Die Polyrnerisation erfolgtinnerhalb von 12 bis 24 Stunden in einem Thermostaten bei etwa 47oC.Als weitere Umschließungsmittel wären zu nennen: das Celluloseacetat und dasLeguval. Dabei handelt es sich um ziemlich zähe honigartige Flüssigkeiten, dieähnlich wie das Methacrylat nach Zusatz eines Härters bei erhöhter Temperaturpolymerisieren.

polymerisierten fest. Je höher polymerisiert sie sind, desto höher liegt ihrSchmelzpunkt und desto fester sind sie'. Die Durchtränkung der Objekte erfolgtebenfalls stufenweise durch allmähliche Steigerung der Konzentration. ZwrnSchluß wird dem reinen Mononler ein Zusatz vonZ /o Benzoyl-Peroxyd als Polymerisationskatalysatorbeigegeben. Im Thermostaten bei etwa 60oC trittinnerhalb von 24 Stunden die Polymerisation ein" Geschnitten wird bei 10 bis15oC. Am zweckmäßigsten ist es, mit etwas Trockeneis zu kühlen. Es istein Nachteil der synthetischen Wachse, daß sie stark hydroskopisch sind.Man kann diesen Nachteil jedoch beheben, indem man die Einbettung in diesemit der Paraffineinbettung kombiniert, indem man das eingebettete Materialim Thermostaten bei 60oC völlig trocknet, dann,10 Minuten in Xy1ol und 30Minuten in geschmolzenes Paraffin legt. Dann wird es wie Paraffin-Material.eingebettet und weiter behandelt. Dadurch ist es von einem wasserundurchlässigenParaffinmante1 umgeben. Man braucht"also eine'lMasseraufnahmeaus der Luft nicht mehr zu befürchten.In diese Gruppe gehören auch die Cremolane der BASF. Es sind dies Athylenoxydpolykondensations-bzw. -Polymerisationsprodukte. Diese sind in dengleichen Flüssigkeiten 1öslich wie die Syntherwachse. Die Einbettung in diesesMaterial ist recht einfach: Das Objekt wird leicht abgetrocknet und in reinesCremolan 60 gebracht, das man bei einer Temperatur von 55oC stehen läßt,bis das Objekt untersinkt, also durchtränkt ist. Das Cremolan wird mehrfachgewechselt und zum Schluß in den Eisschrank gestellt, wo es erstarrt. DieSchnitte werden auf entspanntem W'asser gestreckt. Dabei löst sich das (lremolanund die Schnitte sinken unter. Sie werden dann in der üblichen Weise weiterbehandelt.

9. rrFärbung und Dif f erenzierung von histologischen Ob j ekt enttVortragender: Prof. Dr. J. KisserDie Färbetechniken wurden in erster Linie für das menschliche und tierischeMaterial entwickelt. Wenn man einen Schnitt unter dem Mikroskop betrachtet,erkennt man rneist nicht aII zu viele Einzelheiten. Werden jedoch die Zellkernemit dem blauen Hämatoxylin und ihre Umgebung mit Eosin rot gefärbt, sotreten die einzelnen Bestandteile deutlich hervor.Die Frage, warum dieser Farbstoff dieses Detail und ein anderer Farbstoffjenes Detail anfärbt, ist nicht in al1en Punkten restlos geklärt. Es sind eineganz e Reihe von physikalisch- chemischen Er1äuterungsversuchen g emachtworden. Eine wesentliche Ro1le spielen die elektrischen Faktoren,und zwarsowohl die der Farbstoffe als auch die des Substrates. Dadurch gelingt es,Strukturen, die eine bestimmte H-Ionen-Konzentration aufweisen, durch entsprechendeFarbstoffe elektiv anzufärben.W'ir unterscheiden aber auch saure und basische Farbstoffe, also solche, dieeine Säure-Gruppe enthalten oder das Salz einer Säure darstellen und solche,die eine Base oder das Salz einer Base darstellen. Richtiger wäre es wohl,von positiv oder negativ geladenen Farbstoffen zu sprechen. Natürlich gibtes auch neutrale Farbstoffe, die weder basische noch saure Gruppen besitzen,wie das z.'8. bei den Fettfarbstoffen d.er FaIl ist. A1s amphotere Farbstoffebezeichnet man solche, in denen eine Farbsäure mit einer Farbbase zu einerSalzbildung geführt haben.Unter Methachromasie versteht man die Tatsache, daß man mit einem Farbstoffverschiedene Gewebe- oder Zellelemente mit unterschiedlicher Farbeanfärben kann. Jedoch muß man hier zwischen der echten und der falschenMethachromasie unterscheiden, da bei der falschen Methachromasie ein Zusatzbzvt. eine Verunreinigung mit einem anderen Farbstoff zu methachromatischenErscheinungen führt.Die Färbungen können hinsichtlich der Art der Bindung des Farbstoffes aneinzelne Strukturelemente recht unterschiedlich sein. Man unterscheidet indieser Hinsicht die progressiv,:n und die degressiven Färbungen. Bei derprogressiven Färbung werden nur ganz bestimmte Zellstrukturen angefarbt.Wenn sie mit dem Farbstoff vollgeladen sind, können sie keinen weiteren aufnehmen,d.h. es tritt eine gewisse Sättigung ein" Bei der degressiven Färbungjedoch wird zunächst alles angefärbt, und man muß jetzt rückwärts gehen, damanche Zellstrukturen den Farbstoff stärker festhalten als andere. Man erhältalso eine Differenzierung durch Herauslösen des lockergebundenen Farbstoffes.Man muß auch zwischen den sog. substantiellen oder direkten Färbungen oder adjektivischenofuindirekten Färbungen unterscheiden. Bei den ersteren läßt trran,gleichgültig, ob die Färbung progressiv oder degressiv ist, den Farbstoff aufdas Objekt einwirken. Bei den adjektivischen oder indirekten Färbungen wirdder Farbstoff von dem betreffenden Strukturelement nicht oder nur sehr schwachfestgehalten. In diesem Fall wird das Gewebe zunächst gebeizt, z. B. mit Eisenalaun,Zinkchlorid etc. Die Beizflüssigkeit wird von bestimmten Strukturenfestgehalten, und wenn rnan jetzt färbt, so verbindet sich die Beize mit demFarbstoff zu einem sog. Farblack.b. w.

Man kannSchnitte mil einem einzigen Farbstoff färben oder auch mit zwei oderdrei. Man spricht dann von einer Mehrfachfärbung. Diese ist sehr wichtig, wennin einem Objekt mehrere Strukturen durch unterschiedliche Färbung ,o" b""-stellung gebracht werden sollen. Man erhält ftir diesen Zweck oft Farbstoff- .gemische mit zwei oder drei Komponenten und spricht bei Verwendung derselbenvon einer simultanen Mehrfachfärbung. Farbstoffe sind aber oft nicht gegenseitigverträglich. Dann muß man sie nacheinander verwenden. Man sprichtdann von einer sukzessiven Mehrfachfärbung.Man unterscheidet auch zwischen der Schnittfärbung und der Stückförbung. Esist einleuchtend, daß es bequemer ist, wenn man im Stück vor der Einbettungin Paraffin oder Celloidin färben kann, d.a man dann gleich fertig gefärbteSchnitte erhält. Viele Farbstoffe haben jedoch so große Moleküle, daß sie eingrößeres Gewebestück nur schwer durchdringen können. Aus dies'em Grundsind die Stückfärbungen sehr beschränkt anwendbar. Wir sind in den meistenFällen gezwungen, den fertigen Schnitt, der ja relativ dünn und durchlässigist, zu förben..fDie Färbung selbst wird auch von verschiedenen Außenfaktoren wesentlichbeeinflußt, so durch die Art der Fixierungr wie der Struktur d.es Materials.Man kann daher anhand eines unterschiedlichen färberischen Verhaltens Strukturveränderungennachw eis en.Die Farbstoffe sind teils wasserlöslich, teils alkohollöslich, und sie werd.enmeist mit Angabe des pH-W'ertes der Lösung, d.h. d.er Angabe ihrer H-Ionen-Konzentration geliefert. Man sollte stets bedenken, daß nicht alle l1arbstoff-Lösungen unbegrenzt haltbar sind, und auf jeden Fall sollten die Farbstoff-Lösungen vor Licht geschützt werden.Eine besondere Art der Färbung gewinnt auch bei manchen technischen produktenBedeutung, und zwar die Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen.Eine Reihe von Objekten besitzt schondinerrattirllöHe Fluoresz eraz, z. B. pflänzenstengel'die es erlaubt, im Fluoreszenz-Mikroskop verschiedöne Strukturelementenachzuweisen. Dann gibt es aber d.ie sog. Sekundär-Fluores zerLz.Das ist ein Einfärben mit stark verd.ünnten fluoreszierenden Lösungelr. Diefluoreszierenden Farbstoffe werden nur von bestimmten Zellelementen festgehalten,die nun in allen möglichen Farben unter dem Fluoreszertz-Mikrq"kolaufleuchten. Gerade bei der Uritersuchung von verschiedenen Verleimungen .oder verschiedenen Oberflächenbehandlungen spielt diese Methode heute einewesentliche Rolle.,tt