Theorie zum Histidase- Versuch

Histidase Enzymkinetik
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Theorie zum Histidase- Versuch
1.)Charakterisierung der Histidase
Die Histidase hat ein Molekulargewicht von 210- 220 kDa je nach biologischer Herkunft.
Histidase aus Pseudomonas putida ist ein Homotetramer mit einem Molekulargewicht von
216kDa. Jede Untereinheit weist 509 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 54 kDa
auf( Beweise dazu wurden durch SDS- und Disk- Gelelektrophorese erbracht).
Die einzelnen Untereinheiten sind für sich enzymatisch nicht aktiv.
Histidase weist vier essentielle SH- Gruppen auf, die an der Enzymkatalyse beteiligt sind.
Diese SH- Gruppen sind leicht oxidierbar und nur in ihrer reduzierten Form katalytisch
wirksam.
Durch reduzierende Verbindungen wie z.B. Mercaptoethanol, Glutathion oder
Natriumthioglycolat kann eine Gruppenaktivierung erzielt werden. Die Aufgabe dieser SH-
Gruppen besteht vermutlich in der Bindung des Substratmoleküls im aktiven Zentrum des
Enzyms.
Die Histidase verfügt über einen Metall- Cofaktor, der wahrscheinlich ebenfalls bei der
Bindung des Substratmoleküls während der Enzymkatalyse beteiligt ist. Bei diesen Metall-
Cofaktor handelt es sich vermutlich um Mangan.
Die Substratspezifität der Histidase ist sehr hoch. Histidase reagiert ausschließlich mit L-
Histidin, nicht aber mit D- Histidin. Ihr pH- Optimum liegt bei pH 8,5- 9,5.
Die Histidase ist sehr hitzestabil, sie kann bis zu einer Temperatur von 80°C erhitzt werden,
ohne dass daraus ein nennenswerter Aktivitätsverlust resultieren würde. Diese Eigenschaft
macht man sich bei der Histidase- Isolierung zunutze.
Früher vermutete man als prosthetische Gruppe im aktiven Zentrum der Histidase das
sogenannte Dehydroalanin. Dehydroalanin ist eine chemisch stark modifizierte Aminosäure,
welche in 2 isomeren Formen vorliegen kann.
N
H 2
CH 2
O
OH
Imin- Enamin-
Tautomerie
Erst durch Aufklärung der Kristallstruktur konnte im aktiven Zentrum der Histidase die
prosthetische Gruppe, das sog. MIO- System nachgewiesen werden. MIO ist die Abkürzung
für 4- Methyliden-imidazol-5-on. MIO wird durch zwei aufeinanderfolgende H2O-
Eliminierungsschritte aus dem Tripeptid Ala-Ser-Gly ( Alanin- Serin- Glycin) in den
Positionen 142-144 auf der Aminosäuresequenz gebildet.
HN
CH 3
O
OH

MIO- Bildung:
H
N
142
N
O
142
H +
H
NH
142
Histidase Enzymkinetik
N
H
N
H
HO
N
H
143
143
143
N
N
OH
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MIO konnte bis jetzt nur noch in der Phenylalanin- Ammoniak- Lyase (PAL) nachgewiesen
werden.
2.)Physiologische Bedeutung der Histidase
OH
OH
H
N
144
O
H 2O
144
O
O
144
O
O
H
N
NH
N
H
H 2O
Die Histidase katalysiert die Eingangsreaktion im Hauptabbauweg des Histidins, nämlich die
nicht – oxidative Desaminierung von L- Histidin zu trans-Urocaninsäure.
Bei dieser Reaktion wird NH3 unter Ausbildung einer Doppelbindung eliminiert.
Die Histidase ist demnach auch eine Ammoniak- Lyase.
N
Ala- Ser- Gly-
N
H
H SiHRe
H 2N
L- Histidin
H
O
COOH
Histidase
-NH 3
NH
142
N
143
N
CH 2
144
O
O
NH
MIO = 4- Methyliden- imidazol- 5- on
N
N
H
H
H
trans-Urocaninsäure
COOH

Mechanismus der Histidase- Reaktion:
N
NH
142
N
Histidase Enzymkinetik
N
NH
142
N
143
MIO
N
CH 2
NH
144
O
H Si
L- Histidin
143
N
CH 2
NH
NH
+
3
144
H
O
H Re
H
H
N
O
H
trans- Urocaninsäure
COO -
H
N
O
COO -
- 3 -
1,4-Michael-
Addition
Desaminierung
- NH 3
NH
142
N
H
N
143
N
CH 2
NH
142
+ NH
N
H
N
143
144
N
CH 2
O -
H Si
NH
+
3
NH
H
N
O
H Re
144
O -
H
H
NH
+
3
- B
COO -
Regeneration
H
N
O
H
BH
COO -

Histidin- Stoffwechsel:
Histidase Enzymkinetik
NH
Histidin- Ammoniak- Lyase
= Histidase
NH
Urocaninsäuredehydratase
= Urocanase
Imidazolonpropionase
Glutaminsäureformiminotransferase
O
H 2N
NH
NH
H
N
N
COOH
N
NH 3
N
H 2O
COOH
THF
H 2O
- 4 -
COOH
NH 2
COOH
COOH
COOH
5- Formimino- THF
COOH
L- Histidin
trans-Urocaninsäure
HO
NH
N
COOH
4- Imidazolon-5-propionsäure
N- Formiminoglutaminsäure
L- Glutaminsäure

Histidase Enzymkinetik
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Der oxidative Abbau des Histidins zu Glutaminsäure stellt den Hauptabbauweg dieser
Aminosäure dar. Glutaminsäure ist nicht nur das Hauptabbauprodukt im Histidinstoffwechsel
sondern auch im Katabolismus der Aminosäuren Arginin, Prolin und Glutamin.
Die Glutaminsäure nimmt somit eine zentrale Stellung im Stoffwechsel dieser Aminosäuren
ein. Zusammen mit NAD + wird sie zur entsprechenden Iminosäure dehydriert und
anschließend durch eine oxidative Desaminierung in α- Ketoglutarat überführt.
Diese 2- Oxosäure kann durch eine oxidative Decarboxylierung in Succinyl- CoA übergehen.
Damit wäre der Anschluss an den Endabbau aller Nährstoffe im Tricarbonsäure- Cyclus
gefunden.
Zu einem geringen Teil kann Histidin auch durch Transaminierung ( zu α- Keto- β-
imidazolpropionsäure) und durch Decarboxylierung ( Histamin ) katabolisiert werden.
3.) Generelle Abbauwege von Aminosäuren
1. nicht- oxidative Desaminierung
2. oxidative Desaminierung
3. Umwandlung der Seitenkette unter Erhalt der α- Amino- carbonsäure- Gruppierung. Es
entsteht hierbei stets Glycin.
4. Decarboxylierung von Aminosäuren unter Entstehung der entsprechenden biogenen
Aminen
5. Transaminierung von Aminosäuren. Als Aminogruppen- Akzeptoren fungieren hierbei 2-
Oxosäuren wie z.B. Oxalacetat oder α- Ketoglutarat.
Bei den Reaktionsweisen 3,4,5 handelt es sich um Pyridoxalphosphat- abhängige Reaktionen.
Pyridoxalphosphat ist ein Derivat von Vitamin B6.
4.)Induktion der Enzymsynthese auf der Genebene
Werden Bakterienzellen der Gattung Pseudomonas in einem Nährmedium angezogen, das L-
Histidin als einzige Kohlenstoff- und Stickstoff- Quelle enthält, so müssen diese
chemotrophen Bakterien den gesamten Energiebedarf für ihren Stoffwechsel aus dem
L- Histidinkatabolismus beziehen.
Hierzu werden die am Histidinabbau beteiligten Enzyme verstärkt syntetisiert, so daß deren
Gehalt in der Zelle bis zum 1000- fachen des Normalwertes ansteigen kann. Solche Enzyme,
die bei Bedarf verstärkt gebildet werden, nennt man induzierbare Enzyme.
Die Induktion der Enzymsynthese erfolgt dabei durch Stoffwechselmetabolite oder wie auch
in diesem Fall durch das Substrat (L- Histidin ) selbst.
Die Regulation der Enzyminduktion vollzieht sich auf der Genebene.

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Der Regulationsmechanismus hierbei kann u.a. mit Hilfe des Jacob- Monod- Modells anhand
des Lactose- (lac)- Operons von Escherichia coli erklärt werden ( siehe hierzu Lehrbücher zur
Genetik oder Mikrobiologie).
Die Induzierbarkeit der Synthese bestimmter Enzyme kann natürlich auch bei deren
Isolierung aus einem Zellrohextrakt ausgenutzt werden.
4.) Stereospezifität der Histidase- Reaktion
Setzt man L- Histidin in Anwesenheit von D2O mit Histidase um, so entsteht trans-
Urocaninsäure. Da aber die Reaktion reversibel ist, wird Histidin zu einem geringen
Prozentsatz wieder zurückgebildet. Anstelle des abgespaltenen Protons wird nun aber
Deuterium (aus dem Lösungsmittel) eingebaut (direkt nachweisbar mittels NMR-
Spektroskopie).
Die Tatsache, dass nur eines der beiden H- Atome am β- C- Atom des Histidins durch
Deuterium ersetzt wird, weist darauf hin, dass bei der Eliminierungsreaktion durch die
Histidase nur ein bestimmtes der beiden H- Atome eliminiert wird.
Die Reaktion verläuft demnach stereospezifisch d.h. das Enzym kann die beiden H- Atome
des Histidins am β- C- Atom voneinander unterscheiden.
Wäre dies nicht der Fall, so wären beide H- Atome am β- C- Atom durch Deuterium ersetzt.
Diese beiden H- Atome sind zueinander diastereotop. Diastereotope Gruppen können generell
durch Enzyme unterschieden werden. Die durch die Histidase katalysierte Eliminierung
verläuft antiperiplanar.
N
N
H
H SiHRe
H 2N
L- Histidin
H
COOH
Histidase
-NH 3
N
N
N
H
H
H
trans-Urocaninsäure
N
H
H SiD
H 2N
+D 2O
+NH 3
H
COOH
COOH

Histidase Enzymkinetik
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4.) Histidase ( Histidin Ammoniak- Lyase)
Zur Bestimmung der Gesamtaktivität der Histidase aus Pseudomonas Putida ( welche in
Escherichia coli überexprimiert wurde), wird ihre Eigenschaft L- Histidin zu trans-
Urocaninsäure umzusetzen, ausgenutzt.
Über die Bestimmung der Proteinkonzentration nach Warburg kann dann die spezifische
Aktivität berechnet werden.
Anschließend wird mit dieser Histidase eine Inhibitionskinetik- zur Bestimmung des Ki-
Wertes von L- Cystein- erstellt.
Zuletzt soll noch der molare Extinktionskoeffizient einer ausgegebenen trans- Urocaninsäure
spektrometrisch ermittelt werden.
N
N
H
H SiHRe
H 2N
L- Histidin
H
COOH
Histidase
-NH 3
N
N
H
H
H
trans-Urocaninsäure
COOH

Histidase Enzymkinetik
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Reagenzien für den gesamten Versuchsteil Histidase:
1.) 10 mM Tris- HCL- Puffer pH = 7,2
Die erforderliche Menge für 200 ml dieses Puffers wird in ein geeignetes Gefäß eingewogen,
in H2O bidest. gelöst und mit HCL oder NaOH der pH- Wert eingestellt.
M Tris- HCL= 121,14g/mol
2.) 0,1M Pyrophosphatpuffer 10 µM ZnCL2 pH = 9,3
Die erforderliche Menge an Na4P2O7 * 10 H2O und ZnCL2 für 200ml Puffer wird in ein
geeignetes Gefäß eingewogen, in H2O bidest. gelöst und mit H3PO4 oder NaOH der pH- Wert
eingestellt. In Anbetracht der geringen Menge an ZnCL2 ist es sinnvoll eine 10 mM
Stammlösung herzustellen und die erforderliche Menge durch Verdünnung zum Puffer
hinzuzufügen.
M Na4P2O7 * 10 H2O = 446,06g/mol
M ZnCL2 = 136,29g/mol
3.) 0,1M DTT, 10 ml
Berechnete Menge in ein 15 ml Falcon- Tube einwiegen und in 10 ml H2O bidest. lösen.
MDTT = 154,20g/mol
4.) 0,5M L- Histidin, 10 ml
Berechnete Menge an L- Histidin- Monohydrochlorid- Monohydrat in ein 15 ml Falcon- Tube
einwiegen und in 10 ml H2O bidest. lösen.
ML- Histidin- Monohydrat = 209,63 g/mol
5.) 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH = 7,4 ; 1000 ml
In ein geeignetes Gefäß werden 6,98g K2HPO4 und 1,35g KH2PO4 eingewogen und in
1 Liter H2O bidest. gelöst, Mit H3PO4 oder KOH wird der pH- Wert gegebenenfalls auf 7,4
korrigiert.
6.) 20 mM L- Cystein, 10 ml
Berechnete Menge an L- Cystein in ein 15 ml Falcon- Tube einwiegen und in 10 ml H2O
bidest. lösen.
ML- Cystein = 121,16g/mol

Durchführung:
Histidase Enzymkinetik
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4.1. Isolierung der Histidase aus Escherichia coli:
E.coli- Histidase- Zellen aus 125 ml Anzucht werden in ca. 30 ml (soviel, dass das
Ultraschallaufschlußgefäß bis ca. 1 cm unter den Rand gefüllt ist) 10 mM Tris- HCL
pH 7,2 auf Eis resuspendiert, in ein Ultraschall- Aufschlußgefäß überführt und
5- 10 min bei 65- 70 % Leistung mit Ultraschall aufgeschlossen (solange, bis die Lösung klar
ist). Das Aufschlußgefäß wird dabei immer mit Eis gekühlt.
Danach wird die aufgeschlossene Proteinsuspension in einen gekühlten Metall-
Zentrifugenbecher umgefüllt und 40 min bei 4°C und 18000 rpm abzentrifugiert, um
Zellrückstände zu entfernen
( Sorvall- Zentrifuge, Rotor SS 34 ).
Die überstehende, noch trübe Lösung des Rohextraktes wird in einen 100 ml Rundkolben
überführt und pro 10ml Volumen mit 100 µl 0,1 M MgSO4, 100 µl 0,5 M L- Histidin und
100 µl 0,1 M DTT versetzt. Der Rohextrakt wird im Ölbad unter Rühren 15 min bei 80°C
erhitzt
Unter diesen rigorosen Bedingungen denaturieren nahezu alle Enzyme außer der Histidase,
welche nach erneuter Zentrifugation bei 4°C, 18000 rpm und 30 min Dauer im Überstand
bleibt.
Das Volumen des Überstandes (ml) wird bestimmt und die Enzymlösung kaltgestellt,
während die Histidase- Gesamtaktivität bestimmt wird.
4.2. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Warburg
Zu bestimmende Proteinproben werden gegen eine Referenzküvette mit Puffer bei 260 nm
und 280 nm gemessen. Zuvor muss bei diesen Wellenlängen der Nullabgleich mit Puffer
durchgeführt werden.
Die Proteinkonzentration wird wie folgt berechnet:
Proteinkonzentration (mg/ml) = 1,5 x A280 – 0,75 x A260 x Verdünnungsfaktor
Puffer für die Messung der Histidase- Konzentration: 10 mM Tris- HCL pH 7,2
Die Menge an Histidase- Lösung sollte so gewählt sein, so dass ungefähr eine Absorption im
Bereich von E = 0,2 bis E = 1 gemessen wird.

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4.3. Test der Histidase- Gesamtaktivität
Testmedium:
In eine 1ml Quarzküvette werden folgende Lösungen einpipettiert:
865µl 0,1M Pyrophoshatpuffer 10 µM ZnCL2 pH = 9,3
15µl 0,1M DTT
50µl Histidaselösung
Den Testansatz 5 min bei 25°C inkubieren lassen, Nullabgleich am Spektrometer
durchführen. Anschließend erfolgt der Reaktionsstart durch Zugabe von 70µl 0,5M
Histidinlösung.
Die Messung wird bei 277nm , 25°C, in 1cm Quarzküvetten (1 ml Volumen) durchgeführt.
Die Menge an Histidase soll so gewählt werden, so dass eine 5- minütige Messung im
Absorptionsbereich von E = 0 bis E = 3 möglich ist.
Berechnung der Histidase- Gesamtaktivität:
Definition einer internationalen enzymatischen Einheit (IU).
Wellenlänge und pH- Wert hier speziell für Histidase:
1 IU = Umsatz von einem µmol Substrat pro Minute
bei 25°C, 277nm und pH 9,3
Die Berechnung basiert auf der Messung der zeitlichen Änderung der optischen Dichte des
Testmediums, unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten von
Urocaninsäure bei 277nm und pH 7,4 (ε = 18,8 ml* µmol -1 * cm -1 ).

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Die Formel für die Berechnung der IU basiert auf dem Lambert- Beer- Gesetz:
I
log
I
* c
d
dt
0
=
Ε = ε
Ε = ε
mit c
=
dn
mit
dt
Ε
* l
*
n
V
d
dt
→
c * 1
d
dt
= IU →
Ε = ε *
d
dt
dn
Vdt
Ε = ε *
1*
* 1,
IU
V
wenn
V zeitlich kons
tan t
Weil die Änderung von E nicht nach unendlich kleinen Zeitabschnitten bestimmt wird, kann d
durch ∆ ersetzt werden. Wird außerdem nicht die gesamte Enzymlösung, sondern nur ein
kleiner Teil und der noch in Verdünnung für die Messung verwendet wurde, muß ein
Verdünnungsfaktor berücksichtigt werden.
Aus dem Lambert- Beer- Gesetz ergibt sich dann folgende Formel für die Berechnung der
enzymatischen Einheiten ( International Units):
IU
∆Ε*
Vk
* V
∆t
* ε * l * v
= Die Einheit der IU ist [ µmol/ min].
In diesen Formeln bedeuten die Variablen:
I0 = Lichtintensität bestimmter Wellenlänge nach 0cm
I = Lichtintensität bestimmter Wellenlänge nach 1cm
n = Molzahl [ mol ]
E = Adsorption oder optische Dichte
ε = molarer Extinktionskoeffizient [ml * µmol -1 * cm -1 ]
l = Lichtweg ( Küvettenbreite) [1cm]
c = Konzentration [mol* l -1 ]
V = gesamtes Volumen der Enzymlösung [ml]
Vk = Volumen in der Küvette befindlichen Lösung [ml]
v = zur Messung verwendetes Volumen der Enzymlösung [ml]
t = Zeit [min]

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4.4. Bestimmung der spezifischen Aktivität der Histidase
Aus der ermittelten Proteinkonzentration aus 4.2. und der Gesamtaktivität der Histidase aus
4.3. kann nun bequem die spezifischen Aktivität der Histidase in IU/mg berechnet werden.
4.5. Histidase/Inhibitionskinetik
Bestimmung des Ki-Wertes von L- Cystein:
Der Ki-Wert wird mit Hilfe des Lineweaver- Burk- Diagrammes ermittelt. Das Diagramm
wird mit Hilfe von bekannten L- Histidinkonzentrationen (L- Histidinlösung 1-5) erstellt. Die
Menge an Histidase sollte so gewählt werden, dass ca. 0,500 ∆E pro min erreicht werden. Die
Konzentrationen der L- Histidin- Lösungen (verdünnt aus der 0,5 M Stammlösung) sollen
1.) 5mM,
2.) 8mM,
3.)10mM,
4.) 15mM und
5.) 35mM
in der Küvette betragen.
Küvettenbestückung für jeden der 5 Ansätze (UV, 277 nm, 1 ml Quarzküvetten) ohne
Inhibitor:
Histidase z.B.10 µl
0,1M Pyrophosphat-Puffer pH 9,3/10µM 923 µl bzw. mehr zum Auffüllen auf 1ml
ZnCl2
Küvettenvolumen
0,1 M DTT 17 µl
Zur Reduktion der Disulfidbrücken wird das Enzym 5 min inkubiert. Nach Ablauf der
5 min wird ein Nullabgleich durchgeführt. Dann wird durch Zugabe von L- Histidinlösung
der Konzentrationen 1-5 die Reaktion gestartet.

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Küvettenbestückung für jeden der 5 Ansätze (UV, 277 nm, Quarzküvette) mit 0,8 mM bzw.
0,1 mM L-Cystein in der Küvette:
Histidase z.B. 10 µl
0,1M Pyrophosphat-Puffer pH 9,3/10µM 873 µl bzw. mehr zum Auffüllen auf 1ml
ZnCl2
Küvettenvolumen
0,1 M DTT 17 µl
Zur Reduktion der Disulfidbrücken wird das Enzym 5 min inkubiert. Dann wird durch
gleichzeitige Zugabe von L-Histidinlösung der Konzentrationen 1-5 und 0,8 mM bzw. 0,1
mM L-Cystein ( Konzentration in der Küvette) die Reaktion gestartet.
4.6. Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten
von trans- Urocaninsäure
Zur Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten werden ca. 170 mg ( genauen Wert
notieren ) trans- Urocaninsäure in einem 500 ml Meßkolben in 500 ml
50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 gelöst. Dabei ist äußerst genau zu arbeiten, außerdem
sollte darauf geachtet werden, dass die trans- Urocaninsäure vollständig in Lösung ist!
Mit dem 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 wird bei 277nm ein Nullabgleich
durchgeführt. Anschließend soll die trans- Urocaninsäurelösung in der Küvette so verdünnt
werden, so dass die Extinktion, welche von 3,4mg trans- Urocaninsäure in einem Liter
verursacht wird, in der Küvette gemessen werden kann.
Über die gemessene Extinktion und der in der Küvette vorhandenen Konzentration der trans-
Urocaninsäure in mol/l kann nun bequem über das Lambert- Beersche Gesetz der molare
Extinktionskoeffizient berechnet werden.
E = ε * c* l
l = 1cm
Literaturwert: ε ( 277nm , pH= 7,4) = 18,8ml*µmol -1 *cm -1