06 Fortschritte im Erregernachweis

Erregernachweis
Fortschritte im Erregernachweis?
Was kulturunabhängige Verfahren dem Kliniker bringen
Mit mehr als 250.000 Erkrankungsfällen
pro Jahr und einer Sterblichkeitsrate
von ca. 25% zählt die Sepsis zu den
häufigsten Todesursachen in Deutschland.
Die hohe Letalität wird zum einen
durch das größtenteils schwer kranke
Patientenkollektiv bedingt, andererseits
führen bereits geringe Verzögerungen
bei der Therapieeinleitung oder die falsche
Antibiotikawahl zu einer deutlichen
Prognoseverschlechterung bei einer
Sepsis.
Leider liegt zum Zeitpunkt der Diagnosestellung
für gewöhnlich kein mikrobiologischer
Befund mit Erregernachweis
und Resistenztestung vor, weshalb
die antibiotische Therapie zunächst empirisch
geführt werden muss. Die Idealvorstellung
einer schnellen mikrobiologischen
Diagnostik, die womöglich direkt
am Patientenbett stattfindet und
innerhalb von wenigen Minuten einen
endgültigen Befund erbringt, könnte im
Fall einer Sepsis wesentlich zum Therapieerfolg
beitragen, lässt sich derzeit
aber noch nicht verwirklichen.
Im Gegensatz dazu erscheint die konventionelle,
kulturabhängige Blutkulturdiagnostik,
die für den Erregernachweis
und eine erste, orientierende Resistenztestung
mindestens sechzehn
bis vierundzwanzig Stunden benötigt,
Transportzeiten in das Labor nicht eingerechnet,
viel zu langsam. Neue kulturunabhängige
Verfahren werden daher
als vielversprechende, schnelle Alternative
zur vermeintlich altmodischen, kulturabhängigen
Diagnostik gehandelt.
Wie läuft die konventionelle
Blutkulturdiagnostik ab?
Der Zeitaufwand für die kulturbasierte
Erregerdiagnostik ergibt sich aus den
Abb. 1: Bebrütung der Blutkulturflaschen
langen Bebrütungszeiten. Zunächst
werden die beimpften Blutkulturflaschen
in speziellen Inkubationsautomaten
bebrütet (Abbildung 1), die bakterielles
Wachstum automatisch registrieren
und anzeigen können. Die benötigte
Bebrütungsdauer hängt hierbei vor allem
von der eingeimpften Keimzahl,
also der Erregerkonzentration im Patientenblut,
ab und beträgt im Fall einer
schweren Sepsis üblicherweise weniger
als zehn, eher zwei bis sechs Stunden.
Nach der initialen Bebrütung in Blutkulturflaschen
müssen die positiven
Blutkulturen auf feste Nährmedien ausgestrichen
und für weitere zwölf Stunden
inkubiert werden (Abbildung 2).
So können letztlich Reinkulturen gewonnen
werden, die für die abschließenden
Tests zur Erregeridentifizierung
und Resistenztestung verwendet
werden können.
Um die Diagnose von Blutstrominfektionen
zu beschleunigen, werden seit der
Jahrtausendwende zunehmend neue,
kulturunabhängige Methoden, wie die
Massenspektrometrie oder verschiedene
molekularbiologische Verfahren, in
der Sepsisdiagnostik eingeführt und erprobt
(Abbildung 4). Die Vorteile einer
schnellen Diagnose liegen auf der
Hand: Die Therapie kann zeitnah gezielt
auf besondere Resistenzen ausgerichtet
werden, während gleichzeitig
der Verbrauch von Reserveantibiotika
vermindert und die Entwicklung neuer
Antibiotikaresistenzen verhindert werden
können. Die Einsatzmöglichkeiten
der einzelnen Methoden sowie ihre
Vor- und Nachteile sollen im Folgenden
vorgestellt werden.
Molekularbiologische Verfahren
Kommerzielle molekularbiologische Systeme
sind mittlerweile zu einem festen
Bestandteil des mikrobiologisch-diagnostischen
Labors geworden. Die Syste-
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Erregernachweis
Abb. 2: Ausstreichen der Blutkulturflaschen auf Agarplatten
Abb. 3: Automatisierung der Kulturanlage
me sind in den letzten zwei Jahrzehnten
wesentlich kostengünstiger und benutzerfreundlicher
geworden, sodass einige
Hersteller bereits Geräte zur pointof-care-Diagnostik
anbieten können.
Nicht nur die auf klassischen PCR-Verfahren
basierenden Systeme konnten
optimiert werden, auch neue Methoden
wie die isothermale Amplifikation oder
die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
ermöglichen inzwischen eine schnelle
und einfache Diagnostik. Sogenannte
Multiplex-Systeme erlauben die simultane
Suche nach mehreren Erregern
und Resistenzgenen in einem einzelnen
Untersuchungsgang.
Grundsätzlich können die Verfahren
zur Untersuchung von Nativblut, bebrüteter
Blutkulturen oder auch zur
Analyse von bakteriellen Einzelkolonien
nach Anzucht eingesetzt werden.
Aufgrund der kurzen Untersuchungsdauer
von Minuten bis wenigen Stunden
wird die Diagnostik erheblich beschleunigt.
Noch sind es vor allem die
vergleichsweise hohen Kosten pro Untersuchungsgang,
die einem häufigeren
Einsatz im Weg stehen. Zukünftig ist
jedoch ein weiterer Preisrückgang zu erwarten,
sodass bereits diskutiert wird,
ob molekularbiologische Methoden die
konventionelle Blutkulturdiagnostik in
Zukunft gänzlich ersetzen können.
Um jedoch hier keinem Trugschluss zu
unterliegen, müssen sich klinisch und
diagnostisch tätige Ärzte der Grenzen
dieser molekularbiologischer Verfahren
bewusst sein. Im Gegensatz zur klassischen
Blutkulturdiagnostik mit der
prinzipiell alle kultivierbaren Erreger
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nachgewiesen werden können, werden
durch molekularbiologische Untersuchung
nur zuvor definierte Erreger und
Resistenzgene erfasst. Die Wahrscheinlichkeit
falsch negativer Befunde bleibt
daher groß und eine Ausschlussdiagnostik
ist nicht möglich. Außerdem fehlen
beim alleinigen Nukleinsäurenachweis
wichtige Begleitparameter der konventionellen
Blutkulturdiagnostik, wie die
Bebrütungs dauer (time-to-positivity)
oder die Anzahl positiver Blutkulturen,
die helfen können, die klinische Relevanz
des Befundes als tatsächliche Blutstrominfektion
oder wahrscheinliche Hautkontamination
einzuordnen.
Darüber hinaus kann beim Nachweis
mehrerer Erreger ein zusätzlich gefundenes
Resistenzgen nicht sicher einem
bestimmten Keim zugeordnet werden.
So kann zum Beispiel bei gleichzeitigem
Vorliegen von Staphylococcus aureus und
Methicillin-resistenten Koagulase-negativen
Staphylokokken nicht zwischen
einer meldepflichtigen MRSA-Blutstrominfektion
und einem MSSA-Befund
mit zusätzlicher Hautkontamination
unterschieden werden.
Neue molekularbiologische Hochdurchsatzverfahren,
die unter dem
Schlagwort next-generation-sequencing
(NGS) zusammengefasst werden, stellen
ein vielversprechendes Werkzeug
für die mikrobiologische Diagnostik
der Zukunft dar. Diese Methoden erlauben
es in wenigen Stunden die Basenpaarabfolge
eines kompletten Bakteriengenoms
zu beschreiben.
Bioinformatische Analysen erlauben
anschließend die Erregeridentifizierung
oder die Bestimmung von Resistenzgenen.
So handelt es sich dabei um
ein universelles Verfahren – das heißt,
es können theoretisch sämtliche bakteriellen
und viralen Erreger sowie Pilze
mit einem Untersuchungsschritt ermittelt
werden.
Eine erste Durchführbarkeitsstudie bei
wenigen Patienten konnte bereits zeigen,
dass die Methode in der Diagnostik
von Blutstrominfektionen funktionieren
kann und dabei sowohl quantitative
Aussagen zur vermeintlichen Erregerlast
als auch Aussagen zu Antibiotikaresistenzen
erlaubt (Grumaz; Genome
Med 2016; 8:73). Bisher bleibt der Ansatz
jedoch rein experimentell und es
fehlen aussagekräftige, klinische Studien,
die den Einsatz der Systeme in der
Routinediagnostik evaluieren.
Massenspektrometrie – MALDI-TOF
Neben molekularbiologischen Methoden
hat in den letzten zwei Jahrzehnten
vor allem die Massenspektrometrie,
genauer die Matrix-assistierte Laser-
Desorption-Ionisierung mit Flugzeitanalyse
(engl. time of flight) oder kurz
MALDI-TOF, die mikrobiologische
Diagnostik revolutioniert. Aktuell werden
mit diesem Verfahren Erreger sehr
rasch identifiziert, jedoch keine Resistenztestungen
durchgeführt.
Das Verfahren beruht auf der Ionisierung
bakterieller Proteine mittels Laserbestrahlung
und Beschleunigung der ionisierten
Partikel in einem elektrischen
Feld. Abhängig von Ladung und molekularer
Masse ergeben sich charakte-
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5
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1990 1995 2000 2005 2010 2015
Abb. 4: Anzahl der Publikationen zu den Stichworten „rapid detection“ und „blood culture“
in der Datenbank PubMed 1990-2016
ristische Flugzeitspektren, die mit einer
Datenbank abgeglichen werden,
die eine Vielzahl von Erregern enthält.
Diese Methode eignet sich zuverlässig
zur Erregeridentifizierung und hat seit
ihrer Einführung zeitaufwendige biochemische
Verfahren, wie die „bunte
Reihe“, weitestgehend aus der Routinediagnostik
verdrängt. Die Stärke des
MALDI-TOF-Verfahrens liegt in den
kurzen Bedienungs- und Analysezeiten
von nur wenigen Minuten und dem geringen
Kostenaufwand pro Probe.
Standardmäßig kommt das Verfahren
bisher zur Identifizierung von auf Festmedien
angezüchteten Bakterienkolonien
zum Einsatz. Mit entsprechenden
Aufarbeitungsprotokollen kann aber
auch eine Untersuchung direkt aus zuvor
bebrüteten Blutkulturen erfolgen.
Dieser Untersuchungsansatz funktioniert
bereits stabil und ermöglicht in
den meisten Fällen die Keimdetektion,
noch bevor Reinkulturen des Erregers
vorliegen.
Zur Detektion von Antibiotikaresistenzen
wird die Massenspektrometrie
bisher nur experimentell angewandt.
Zwar wurde bereits beschrieben, wie bestimmte
Einzelresistenzen direkt oder
indirekt mittels MALDI-TOF nachgewiesen
werden können, bisher ist aber
nicht absehbar, dass sich hieraus eine
universell einsetzbare Methode für die
Routinediagnostik ergibt, die der kulturbasierten
Resistenztestung ebenbürtig
ist. Nachteile der Massenspektrometrie
sind die aufwendige technische
Installation sowie die hohen Anschaffungskosten,
die den wirtschaftlichen
Einsatz eines MALDI-TOF-Systems
nur in einem Großlabor mit entsprechend
hohem Probenaufkommen ermöglichen
und keine point-of-care-Diagnostik
zulassen.
Die Möglichkeit, die Massenspektrometrie
mit Nukleinsäureamplifikationsverfahren
zu kombinieren, soll an dieser
Stelle nicht unerwähnt bleiben. Bei diesem
Vorgehen werden universelle bakterielle
Primer eingesetzt, um möglichst
viele kurze Amplifikationsprodukte zu
erhalten. Anschließend werden in einem
zweiten Untersuchungsschritt die
erzeugten Nukleinsäurestränge mittels
Massenspektrometrie analysiert.
Das Verfahren vereint die Vorteile beider
Methoden, da es einerseits kulturunabhängig
arbeitet, dabei aber ein
wesentlich größeres Keimspektrum
erfassen kann als handelsübliche Multiplex-PCRs.
Ein erstes kommerzielles
System, das auf diesem Untersuchungsprinzip
beruhte, war jedoch nicht zuletzt
aufgrund der sehr hohen Anschaffungskosten
sowie hoher Kosten pro Untersuchung
wenig attraktiv und wurde bereits
kurze Zeit nach seiner Einführung wieder
in Europa vom Markt genommen.
Der Stellenwert neuer Methoden
in der Sepsisdiagnostik
Nach wie vor stellt die kulturbasierte
Erreger- und Resistenzdiagnostik in
der Medizinischen Mikrobiologie den
Goldstandard dar, an dem sich andere
Methoden messen lassen müssen.
Darüber hinaus konnte in der letzten
Zeit die kulturabhängige Diagnostik
durch neue Verfahren zur automatisierten
Probenverarbeitung entscheidend
verbessert und auch beschleunigt
werden (Abbildung. 3). Die konventionelle
Blutkultur ist daher aktuell das
Mittel der Wahl zur kostengünstigen
und universellen Diagnostik von Blutstrominfektionen.
Die konventionelle Blutkulturdiagnostik
konnte in der jüngsten Zeit durch
Massenspektrometrie und molekularbiologische
Verfahren sinnvoll ergänzt
werden. Während die Massenspektrometrie
bereits ein Routineverfahren
darstellt, werden molekularbiologische
Methoden aufgrund der vergleichsweise
hohen Kosten bisher nur optional eingesetzt.
Gerade molekularbiologische
Verfahren können jedoch Abkürzungen
innerhalb des diagnostischen Pfades
ermöglichen und zeitnah eine erste
Aussage zu wichtigen Erregern und
Resistenzen erlauben.
Der Einsatz kulturunabhängiger Methoden
sollte stets eingebettet in die
klassische Blutkulturdiagnostik im Rahmen
einer Stufendiagnostik erfolgen.
Ausschlaggebende Parameter, die dem
Diagnostiker Anlass zum Einsatz neuer
Methoden geben können, sind beispielsweise
die time-to-positivity, die
Anzahl positiver Blutkulturen oder auch
der mikroskopische Befund. Wichtig
für die Indikationsstellung sind vor allem
aber klinische Informationen, weshalb
die Kommunikation zwischen behandelnden
Ärzten und dem diagnostischen
Labor entscheidend ist. Nur so
kann eine fokussierte, schnelle Diagnostik
und die korrekte Befundinterpretation
bei kritisch kranken Patienten gewährleistet
werden.
Interessenkonflikte: Keine
Prof. Dr. Bettina Löffler
Dr. Steffen Höring
Institut für Med. Mikrobiologie
Universitätsklinikum Jena
bettina.loeffler@med.uni-jena.de
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