06 Fortschritte im Erregernachweis

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

Erregernachweis Abb. 2: Ausstreichen der Blutkulturflaschen auf Agarplatten Abb. 3: Automatisierung der Kulturanlage me sind in den letzten zwei Jahrzehnten wesentlich kostengünstiger und benutzerfreundlicher geworden, sodass einige Hersteller bereits Geräte zur pointof-care-Diagnostik anbieten können. Nicht nur die auf klassischen PCR-Verfahren basierenden Systeme konnten optimiert werden, auch neue Methoden wie die isothermale Amplifikation oder die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ermöglichen inzwischen eine schnelle und einfache Diagnostik. Sogenannte Multiplex-Systeme erlauben die simultane Suche nach mehreren Erregern und Resistenzgenen in einem einzelnen Untersuchungsgang. Grundsätzlich können die Verfahren zur Untersuchung von Nativblut, bebrüteter Blutkulturen oder auch zur Analyse von bakteriellen Einzelkolonien nach Anzucht eingesetzt werden. Aufgrund der kurzen Untersuchungsdauer von Minuten bis wenigen Stunden wird die Diagnostik erheblich beschleunigt. Noch sind es vor allem die vergleichsweise hohen Kosten pro Untersuchungsgang, die einem häufigeren Einsatz im Weg stehen. Zukünftig ist jedoch ein weiterer Preisrückgang zu erwarten, sodass bereits diskutiert wird, ob molekularbiologische Methoden die konventionelle Blutkulturdiagnostik in Zukunft gänzlich ersetzen können. Um jedoch hier keinem Trugschluss zu unterliegen, müssen sich klinisch und diagnostisch tätige Ärzte der Grenzen dieser molekularbiologischer Verfahren bewusst sein. Im Gegensatz zur klassischen Blutkulturdiagnostik mit der prinzipiell alle kultivierbaren Erreger 26 nachgewiesen werden können, werden durch molekularbiologische Untersuchung nur zuvor definierte Erreger und Resistenzgene erfasst. Die Wahrscheinlichkeit falsch negativer Befunde bleibt daher groß und eine Ausschlussdiagnostik ist nicht möglich. Außerdem fehlen beim alleinigen Nukleinsäurenachweis wichtige Begleitparameter der konventionellen Blutkulturdiagnostik, wie die Bebrütungs dauer (time-to-positivity) oder die Anzahl positiver Blutkulturen, die helfen können, die klinische Relevanz des Befundes als tatsächliche Blutstrominfektion oder wahrscheinliche Hautkontamination einzuordnen. Darüber hinaus kann beim Nachweis mehrerer Erreger ein zusätzlich gefundenes Resistenzgen nicht sicher einem bestimmten Keim zugeordnet werden. So kann zum Beispiel bei gleichzeitigem Vorliegen von Staphylococcus aureus und Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokken nicht zwischen einer meldepflichtigen MRSA-Blutstrominfektion und einem MSSA-Befund mit zusätzlicher Hautkontamination unterschieden werden. Neue molekularbiologische Hochdurchsatzverfahren, die unter dem Schlagwort next-generation-sequencing (NGS) zusammengefasst werden, stellen ein vielversprechendes Werkzeug für die mikrobiologische Diagnostik der Zukunft dar. Diese Methoden erlauben es in wenigen Stunden die Basenpaarabfolge eines kompletten Bakteriengenoms zu beschreiben. Bioinformatische Analysen erlauben anschließend die Erregeridentifizierung oder die Bestimmung von Resistenzgenen. So handelt es sich dabei um ein universelles Verfahren – das heißt, es können theoretisch sämtliche bakteriellen und viralen Erreger sowie Pilze mit einem Untersuchungsschritt ermittelt werden. Eine erste Durchführbarkeitsstudie bei wenigen Patienten konnte bereits zeigen, dass die Methode in der Diagnostik von Blutstrominfektionen funktionieren kann und dabei sowohl quantitative Aussagen zur vermeintlichen Erregerlast als auch Aussagen zu Antibiotikaresistenzen erlaubt (Grumaz; Genome Med 2016; 8:73). Bisher bleibt der Ansatz jedoch rein experimentell und es fehlen aussagekräftige, klinische Studien, die den Einsatz der Systeme in der Routinediagnostik evaluieren. Massenspektrometrie – MALDI-TOF Neben molekularbiologischen Methoden hat in den letzten zwei Jahrzehnten vor allem die Massenspektrometrie, genauer die Matrix-assistierte Laser- Desorption-Ionisierung mit Flugzeitanalyse (engl. time of flight) oder kurz MALDI-TOF, die mikrobiologische Diagnostik revolutioniert. Aktuell werden mit diesem Verfahren Erreger sehr rasch identifiziert, jedoch keine Resistenztestungen durchgeführt. Das Verfahren beruht auf der Ionisierung bakterieller Proteine mittels Laserbestrahlung und Beschleunigung der ionisierten Partikel in einem elektrischen Feld. Abhängig von Ladung und molekularer Masse ergeben sich charakte- Nr. 4, 2017
Erregernachweis 20 15 10 5 0 1990 1995 2000 2005 2010 2015 Abb. 4: Anzahl der Publikationen zu den Stichworten „rapid detection“ und „blood culture“ in der Datenbank PubMed 1990-2016 ristische Flugzeitspektren, die mit einer Datenbank abgeglichen werden, die eine Vielzahl von Erregern enthält. Diese Methode eignet sich zuverlässig zur Erregeridentifizierung und hat seit ihrer Einführung zeitaufwendige biochemische Verfahren, wie die „bunte Reihe“, weitestgehend aus der Routinediagnostik verdrängt. Die Stärke des MALDI-TOF-Verfahrens liegt in den kurzen Bedienungs- und Analysezeiten von nur wenigen Minuten und dem geringen Kostenaufwand pro Probe. Standardmäßig kommt das Verfahren bisher zur Identifizierung von auf Festmedien angezüchteten Bakterienkolonien zum Einsatz. Mit entsprechenden Aufarbeitungsprotokollen kann aber auch eine Untersuchung direkt aus zuvor bebrüteten Blutkulturen erfolgen. Dieser Untersuchungsansatz funktioniert bereits stabil und ermöglicht in den meisten Fällen die Keimdetektion, noch bevor Reinkulturen des Erregers vorliegen. Zur Detektion von Antibiotikaresistenzen wird die Massenspektrometrie bisher nur experimentell angewandt. Zwar wurde bereits beschrieben, wie bestimmte Einzelresistenzen direkt oder indirekt mittels MALDI-TOF nachgewiesen werden können, bisher ist aber nicht absehbar, dass sich hieraus eine universell einsetzbare Methode für die Routinediagnostik ergibt, die der kulturbasierten Resistenztestung ebenbürtig ist. Nachteile der Massenspektrometrie sind die aufwendige technische Installation sowie die hohen Anschaffungskosten, die den wirtschaftlichen Einsatz eines MALDI-TOF-Systems nur in einem Großlabor mit entsprechend hohem Probenaufkommen ermöglichen und keine point-of-care-Diagnostik zulassen. Die Möglichkeit, die Massenspektrometrie mit Nukleinsäureamplifikationsverfahren zu kombinieren, soll an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben. Bei diesem Vorgehen werden universelle bakterielle Primer eingesetzt, um möglichst viele kurze Amplifikationsprodukte zu erhalten. Anschließend werden in einem zweiten Untersuchungsschritt die erzeugten Nukleinsäurestränge mittels Massenspektrometrie analysiert. Das Verfahren vereint die Vorteile beider Methoden, da es einerseits kulturunabhängig arbeitet, dabei aber ein wesentlich größeres Keimspektrum erfassen kann als handelsübliche Multiplex-PCRs. Ein erstes kommerzielles System, das auf diesem Untersuchungsprinzip beruhte, war jedoch nicht zuletzt aufgrund der sehr hohen Anschaffungskosten sowie hoher Kosten pro Untersuchung wenig attraktiv und wurde bereits kurze Zeit nach seiner Einführung wieder in Europa vom Markt genommen. Der Stellenwert neuer Methoden in der Sepsisdiagnostik Nach wie vor stellt die kulturbasierte Erreger- und Resistenzdiagnostik in der Medizinischen Mikrobiologie den Goldstandard dar, an dem sich andere Methoden messen lassen müssen. Darüber hinaus konnte in der letzten Zeit die kulturabhängige Diagnostik durch neue Verfahren zur automatisierten Probenverarbeitung entscheidend verbessert und auch beschleunigt werden (Abbildung. 3). Die konventionelle Blutkultur ist daher aktuell das Mittel der Wahl zur kostengünstigen und universellen Diagnostik von Blutstrominfektionen. Die konventionelle Blutkulturdiagnostik konnte in der jüngsten Zeit durch Massenspektrometrie und molekularbiologische Verfahren sinnvoll ergänzt werden. Während die Massenspektrometrie bereits ein Routineverfahren darstellt, werden molekularbiologische Methoden aufgrund der vergleichsweise hohen Kosten bisher nur optional eingesetzt. Gerade molekularbiologische Verfahren können jedoch Abkürzungen innerhalb des diagnostischen Pfades ermöglichen und zeitnah eine erste Aussage zu wichtigen Erregern und Resistenzen erlauben. Der Einsatz kulturunabhängiger Methoden sollte stets eingebettet in die klassische Blutkulturdiagnostik im Rahmen einer Stufendiagnostik erfolgen. Ausschlaggebende Parameter, die dem Diagnostiker Anlass zum Einsatz neuer Methoden geben können, sind beispielsweise die time-to-positivity, die Anzahl positiver Blutkulturen oder auch der mikroskopische Befund. Wichtig für die Indikationsstellung sind vor allem aber klinische Informationen, weshalb die Kommunikation zwischen behandelnden Ärzten und dem diagnostischen Labor entscheidend ist. Nur so kann eine fokussierte, schnelle Diagnostik und die korrekte Befundinterpretation bei kritisch kranken Patienten gewährleistet werden. Interessenkonflikte: Keine Prof. Dr. Bettina Löffler Dr. Steffen Höring Institut für Med. Mikrobiologie Universitätsklinikum Jena bettina.loeffler@med.uni-jena.de Nr. 4, 2017 27
Seite 1: Erregernachweis Fortschritte im Err

06 Fortschritte im Erregernachweis

Erfolgreiche ePaper selbst erstellen

Template löschen?

Als Template speichern?