Neue Naturstoffe aus schwamm-assoziierten Pilzen des Mittelmeeres

Neue Naturstoffe aus schwamm-assoziierten Pilzen
des Mittelmeeres
- Isolierung, Strukturaufklärung und Evaluierung
der biologischen Aktivität -
I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n
zur Erlangung
des naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Jan Hiort
aus Marburg an der Lahn
Düsseldorf, 2002

5. Zusammenfassung
Zusammenfassung
Auf der Suche nach neuen Leitstrukturen bietet die Natur unvergleichliche
Ressourcen an chemisch-struktureller Vielfalt, kombiniert mit biologischer Aktivität.
Seit der Entdeckung des Penicillins 1928 gewannen Pilze als Produzenten von
Anitibiotika und anderen pharmakologisch aktiven Naturstoffen mehr und mehr an
Bedeutung. Obwohl terrestrische Pilze nach wie vor intensiv untersucht werden,
nahm aufgrund der Replikation von bekannten Verbindungen die Zahl der aus ihnen
isolierten, neuen Naturstoffe in den letzten Jahren ab, und Naturstoffchemiker haben
daher ihre Suche nach neuen Naturstoff-Ressourcen unter anderem auf die
Mikroflora der Meere ausgeweitet.
Marine Makroorganismen werden bereits seit ca. 25 Jahren sehr intensiv untersucht.
Das Interesse an marinen Pilzen nahm erst in den letzten zehn Jahren mehr und
mehr zu. Der Vorteil des mikrobiellen Ansatzes der marinen Naturstoffforschung liegt
in der guten Umweltverträglichkeit der Methode und der Möglichkeit der
Fermentation in großem Maßstab zur Gewinnung von genügend Substanz für die
klinische Prüfung und spätere Anwendung von potentiellen Arzneistoffen.
Aus marinen Schwämmen können Bakterien und Pilze in großer Zahl isoliert werden,
um anschließend in Kultur genommen zu werden. Auf diese Weise wurden aus
marinen Pilz-Isolaten bereits viele neue Naturstoffe mit vielversprechender
biologischer Aktivität isoliert. Strukturell sind diese Verbindungen zum Teil ähnlich,
einige sogar identisch mit den Inhaltsstoffen terrestrischer Pilze, andere wiederum
weisen ungewöhnliche Strukturmerkmale auf.
Das chemische Potential der assoziierten Mikroflora mediterraner Schwämme wurde
im Rahmen dieser Arbeit, die Teil des BMBF-Verbundprojektes „Bioaktive
Naturstoffe: Biologisch aktive Naturstoffe aus marinen Schwämmen und assoziierten
Mikroorganismen“ war, erstmals eingehend untersucht. Auf zwei Sammelexkursionen
auf der Insel Elba in Italien wurden 15 Schwammspezies gesammelt und vor Ort
zwecks Isolierung der assoziierten Mikroflora bearbeitet. Die gesammelten
Schwämme sowie die Kulturen von über 100 Mikroorganismen wurden extrahiert und
die Extrakte in vier Testsystemen auf ihre biologische Aktivität hin untersucht.
163

fett = neu, * = biologisch aktiv
Zusammenfassung
Abb. Z1: Screening nach biologisch aktiven Naturstoffen.
Insgesamt wurden so die Extrakte von 15 Schwammspezies, 69 Bakterienstämmen
und 40 Pilzstämmen untersucht. Unter Berücksichtigung der biologischen Aktivität
und chemischen Diversität der Extrakte, der Extraktmengen und des verfügbaren
biologischen Materials wurden vier Pilzstämme ausgewählt, um sie in großem
Volumen in Standkultur auf Salzmedium anzuziehen. Aus den Extrakten dieser
Kulturen wurden durch bioassay-geleitete Fraktionierung 15 Naturstoffe isoliert,
identifiziert, ihre Struktur aufgeklärt und anschließend ihre biologische Aktivität
charakterisiert (Abb. Z1 und Z2).
Auf diese Weise wurde aus dem Penicillium-Stamm E99-1/95 das bekannte
zyklische Pentapeptid Cycloaspeptid 1 isoliert. Für diese Verbindung konnte zum
ersten Mal eine moderat zytotoxische Wirkung beschrieben werden (IC50-Werte je
nach Zelllinie = 2 - 9 µg/ml).
15 Schwammspezies
69 Bakterienstämme 40 Pilzstämme
biologisches und chemisches Screening, Literaturrecherche
E99-1/95
Penicillium
Cycloaspeptid*
E99-1/7
Penicillium
Citrinin*
Phenylessigsäureamid
Aus einer zweiten Penicillium-Kultur (E99-1/7) wurden das bekannte zytotoxische
Pilzpigment Citrinin 2 und ein neues, chloriertes Phenylessigsäureamid 3 isoliert.
164
E99-3/341
Aspergillus
Cycloleucomelon
4 Pyranopyrrole*
Biscumarin*
2 Benzylpyridine
E99-1/17
Verticillium
2 Indole
Cyclo(alanyltryptophyl)
Leptosin*

OH
HO
H
1
HO
O
N
H
O
11
O
O
NH
O
O
O
NH
O
N
O
N
HO O
O
OH
6
O NH 2
N
O
OCH 3
10
O
HN
O
NH
R 1O
4
R 2O
HO
N
O NH 2
O
Zusammenfassung
OH
Abb. Z2: Aus Kulturen schwamm-assoziierter Pilze des Mittelmeeres isolierte Naturstoffe.
Aus dem Extrakt einer Kultur von Aspergillus niger (E99-3/341) wurden insgesamt
acht Naturstoffe isoliert. Der einzige bekannte Naturstoff aus dem Extrakt dieses
Pilzes war das Terphenylchinon Cycloleucomelon 4. Diese Verbindung wurde im
Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal aus einem Ascomyceten isoliert.
OH
O
O
O
HO
3
R
12: H
13: OH
N
H
165
R
OH
5
HO
Cl
R1 R2
2
7: H CH 3
8: CH 3 H
15
HN
O
H
O
HO
OH
O
O
NH 2
O
O
O
O
O
N
H
H
N
HO
N
H
N
H
H
O
OH
OCH 3
S
O
N
O
O
N
H
O
O
N
OH
14
S
O
OCH 3
OH
9

Zusammenfassung
Zu den neuen Naturstoffen zählten ein Biscumarin-Derivat 5, vier Pyranopyrrole 6 - 9
und zwei Benzylpyridine 10, 11. Das Biscumarin-Derivat ist erst das zweite, 3,3'-
verknüpfte Biscumarin, das aus der Natur bekannt ist. Zum ersten Mal konnten hier
13 C-NMR-Daten für ein auf diese Weise verknüpftes Biscumarin präsentiert werden.
Im Zytotoxizitätstest gegen verschiedene Zelllinien wirkte diese Verbindung schwach
antiproliferativ bei Konzentrationen zwischen 10 und 20 µg/ml.
Die vier Pyranopyrrole sind neue Naturstoffe mit einer ungewöhnlichen Verknüpfung
eines 2-Propenyl-γ-pyranons mit einem Pyrrolring. In Kultivierungsexperimenten des
Aspergillus-Stamms E99-3/341 auf Medien mit verschiedenen Salzkonzentrationen
konnte gezeigt werden, daß diese Verbindungen offensichtlich bevorzugt in
Salzwasserkultur gebildet werden. Pyranopyrrol A wirkt bei einer Konzentration von
100 ppm im Futterstück fraßhemmend auf die frischgeschlüpften Raupen von
Spodoptera littoralis.
Der Extrakt einer Kultur von Verticillium cf. cinnabarinum (E00-13/33) enthielt unter
anderem zwei gewöhnliche Indol-Derivate 12, 13 und ein Diketopiperazin 14 aus
Tryptophan und Alanin. Darüberhinaus wurde aus diesem Extrakt ein neues
Leptosin-Derivat 15 isoliert. Hierbei handelt es sich um das erste beschriebene
monomere Leptosin, bei dem keine Sulfidbrücke im Diketopiperazin-Ring vorliegt.
Verbindungen dieses Typs sind bekannt für ihre starke zytotoxische Aktivität mit IC50-
Werten zwischen 44 - 86 ng/ml.
Insgesamt wurden aus den Kulturen von vier verschiedenen schwamm-assoziierten
Pilzstämmen 15 Verbindungen isoliert. Fünf dieser Verbindungen fielen in einem der
eingesetzten Biotests durch ihre biologische Aktivität auf. Neun Verbindungen
wurden als neue Naturstoffe im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal beschrieben.
Damit konnte gezeigt werden, daß der im Rahmen dieser Arbeit verfolgte Ansatz, die
Isolierung schwamm-assoziierter Pilze und die Anzucht der Isolate in
Salzwasserkultur, auch im Hinblick auf zukünftige Arbeiten vielversprechend ist.
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