Isolierung und Identifizierung von Dermatophyten und ... - Laboklin

Isolierung und Identifizierung von
Dermatophyten und Haut relevanten Sprosspilzen
Da Dermatophyten vom Tier auf den Besitzer
übergehen können, kommt der Dermatophytendiagnostik
eine besondere Bedeutung
zu.
Gewinnung des Untersuchungsmaterials:
Beim Pilzverdacht müssen die Haare am
Übergang von der veränderten zur gesunden
Haut hin entnommen werden. Da die Pilze in
der Regel die Haarfollikel besiedeln, muss ein
tiefes Hautgeschabsel genommen bzw. die
Haare ausgezupft werden. Einfaches
Abschneiden kann ein falsch negatives
Ergebnis vortäuschen. Da Tiere sich gerne auf
der Erde wälzen und somit eine hohe
Belastung mit Umweltkeimen besteht, sollte
man für die mykologische Untersuchung
vorher das zu untersuchende Hautarreal mit
70%igem Äthylalkohol oder 50%igem
Isopropylalkohol desinfizieren. (Diese
Desinfektion muss natürlich unterbleiben,
wenn gleichzeitig eine bakteriologische Untersuchung
durchgeführt werden soll.) Das
gewonnene Material wird ohne Zusatz in ein
steriles Gefäß gegeben. Dermatophyten sind
in Hornmaterial mehrere Tage bis Wochen
lebensfähig, einige Dermatophyten und Hefen
vertragen allerdings Kühlschranktemperaturen
schlecht.
Mikroskopische Untersuchung der Hautgeschabsel:
Da bei einem Hautgeschabsel die Hornschollen
eine mikroskopische Diagnostik erschweren,
muss das entnommene Material
entsprechend vorbehandelt werden:
1. Mazeration mit Kalilauge
Das zerkleinerte Untersuchungsmaterial wird
auf einen Objektträger aufgebracht, mit
10%iger Kalilauge überschichtet und für 1 bis
2 Stunden bei Zimmertemperatur am besten in
einer feuchten Kammer inkubiert. Die
Keratinolyse kann durch vorsichtiges
Erwärmen des Objektträgers beschleunigt
werden.
2. Paraffinöl
Das Geschabsel wird auf dem Objektträger
mit Paraffinöl überschichtet und mit einem
Deckglas abgedeckt.
Bei der KOH Präparation mazerieren die
Hornschuppen, nach leichtem Quetschen sind
Pilzstrukturen (Sporen, Myzel) und Milben
besser erkennbar. Als Nachteil gilt hier, dass
die Kalilauge verdunsten kann und sich
Kristallniederschläge bilden, die dann das
Mikroskopieren erschweren, wenn nicht
unmöglich machen.
Bei der Überschichtung mit Paraffinöl werden
die Schuppen nicht mazeriert, die Erkennung
wird dadurch erschwert. Man kann jedoch das
Präparat länger liegen lassen, ohne dass
Kristalle ausfallen und das Mikroskopieren
erschweren. Eine Anfärbung der KOH
Präparate ist möglich, bringt aber kaum
Vorteile.
Isolierung der Dermatophyten und Spross-
Pilze in der Pilzkultur
Nach Zerkleinerung wird das Untersuchungsmaterial
auf zwei feste Nährböden
so aufgebracht, dass die Haare und Schuppen
gut haften.
Wir verwenden einen Sabouraud Gelose Agar
mit Gentamicin und Chloramphenicol Zusatz
zur Unterdrückung der bakteriellen Begleitflora,
außerdem einen Sabouraud Agar mit
Chloramphenicol und Actidion Zusatz zur
Unterdrückung der Schimmelpilze. Dieser
Nährboden eignet sich nach unserer Erfahrung
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auch sehr gut zur Kultivierung von
Malassezia pachydermatis und wird deshalb
auch zur mykologischen Kultur von
Ohrabstrichen verwendet. Die beimpften
Nährböden werden mit einem Klebeband
zugeklebt und bei 28°C bebrütet. Zweimal pro
Woche werden die Kulturen auf Wachstum
hin überprüft, bis zu einem endgültig
negativen Ergebnis werden die Kulturen
mindestens 3 Wochen bebrütet.
Identifizierung:
Die Identifizierung erfolgt nach ihren
makroskopischen und mikroskopischen
Merkmalen.
Als makroskopische Merkmale wird die
Größe der Kolonien, ihre Form, die Kolonie
Oberflächenstruktur, Randbeschaffenheit
sowie die Pigmentbildung an der Oberfläche
und an der Rückseite herangezogen. Die
Pigmentintensität ist vom verwendeten
Nährboden abhängig.
Zur mikroskopischen Beurteilung wird ein
Tropfen Lactophenol-Baumwollblaulösung
auf einen Objektträger gegeben. Ein Stück
klarer Tesafilm wird auf die Kolonieoberfläche
gedrückt und anschließend auf den
vorbereiteten Objektträger aufgeklebt. An
mikroskopischen Merkmalen wird die Größe,
Form und Anordnung der Makrokonidien und
Mikrokonidien herangezogen, außerdem
werden Chlamydosporenbildung spezielle
Hyphenformen (Spiralhyphen, Bambushyphen,
Teleskophyphen), Verzweigungsmodus
und reflexives Wachstum beurteilt.
Zusätzlich können zur Identifizierung der
Dermatophytenarten spezielle Testmedien
(z.B. Difco Trichophyton-Agar 1-7) verwendet
werden. Zur Identifizierung von
Hefen kann ein System standardisierter und
miniaturisierter Assimilationsreaktionen (ID
32 C von bioMerieux) verwendet werden.
Ergebnisse bei der Katze:
Im Jahr 2001 wurden 890 Hautgeschabsel von
Katzen mykologisch untersucht, 627 oder
70.45 % wiesen ein aus mikrobiologischer
Sicht relevantes Pilzwachstum auf. Mit Abstand
am häufigsten wurde mit 45.6%
Mikrosporum canis nachgewiesen (204
Kulturen wiesen einen hohen Gehalt, 43 einen
mittleren und 39 einen geringen Gehalt auf).
Am zweit häufigsten wurden bei der Katze
Hefen nachgewiesen (Candida spp. 23.1%,
Malassezia pachydermatis 10.7%), an dritter
Stelle wurde Trichophyton mentagrophytes
mit 8.6% (30 wiesen eine hohen Gehalt, 13
einen mäßigen und 11 einen geringen Gehalt
auf). Andere Dermatophyten Arten wurden
nur in wenigen Fällen nachgwiesen.
Ergebnisse beim Hund
Es wurden 3053 Haut und Haarproben vom
Hund mykologisch untersucht, davon wiesen
1593 oder 52.2 % ein aus mikrobiologischer
Sicht relevantes Pilzwachstum auf.
Mit Abstand am häufigsten wurde beim Hund
Malassezia pachydermatis mit 51.8%
nachgewiesen (hohes Wachstum: 19.95%,
mäßiges Wachstum: 14.9% und geringes
Wachstum 16.95%). Malassezia pachydermatis
wird zunächst zur physiologischen
Hautflora gezählt. Bei entsprechender
Veranlagung und einer zusätzlichen Noxe
(Feuchtigkeit, Stress u.a.m.) können sich
diese Hefen jedoch massiv vermehren und zu
einem seborrhoeischen Ekzem führen. Am
zweit häufigsten wurden Hefen der Gattung
Candida spp. in 22.7% der positiven Proben
nachgewiesen. Die Dermatophyten folgten bei
den Hunden erst an dritter Stelle.
Mikrosporum canis dominierte in unseren
Ergebnissen mit 7.6% vor Trichophyton mentagrophytes
3.7%.
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