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Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung................................................................................................................ 1
1.1. Das Säugetierskelett ........................................................................................ 1
1.2. Die Knochen- und Knorpelbildung.................................................................... 2
1.3. Die molekulare Steuerung der endochondralen Ossifikation ........................... 5
1.3.1. Der Ihh/PTHrP-Signalweg ......................................................................... 6
1.3.2. Der FGF-Signalweg................................................................................... 7
1.3.3. Der Wnt-Signalweg.................................................................................... 8
1.4. Heparansulfat-Proteoglykane........................................................................... 9
1.5. Die Sulfatase-Genfamilie der Säugetiere ....................................................... 11
1.6. Heparansulfat-6-O-Endosulfatasen................................................................ 13
1.7. Zielsetzung der Arbeit .................................................................................... 15
2. Materialien und Methoden .................................................................................... 16
2.1. Molekularbiologische Methoden..................................................................... 16
2.1.1. Isolierung von genomischer DNA zur Genotypisierung ........................... 16
2.1.2. Isolierung von DNA.................................................................................. 16
2.1.3. Isolierung von Gesamt-RNA.................................................................... 16
2.1.4. Reverse Transkription ............................................................................. 16
2.1.5. Standard-PCR und DNA-Sequenzierung ................................................ 17
2.1.6. Quantitative RT-PCR............................................................................... 17
2.1.7. Klonierung von ArsI, Sulf1 und Sulf2 Expressionskonstrukten ................ 18
2.1.7.1. pcDNA3.1/V5-His Expressionskonstrukte ............................................ 18
2.1.7.2. ArsI-RCAS Konstrukt............................................................................ 19
2.1.8. Sulf1 und Sulf2 Peptid-Antikörper ........................................................... 19
2.1.9. SDS-PAGE und Western blot.................................................................. 19
2.2. Histologie und Skelettpräparation .................................................................. 20
2.2.1. Paraffinschnitte........................................................................................ 20
2.2.2. Histologische Färbungen......................................................................... 21
2.2.3. Bestimmung der Proliferationsrate .......................................................... 21
2.2.4. β-Gal-Färbung ......................................................................................... 22
2.2.5. Knorpel- und Knochenfärbung von Skelettpräparationen........................ 22
2.3. In situ-Hybridisierung ..................................................................................... 22
2.3.1. DNA-Templates der antisense-RNA Sonden .......................................... 23
2.3.2. ISH an Paraffin Gewebeschnitten ........................................................... 25
2.3.3. ISH an ganzen Embryonen (WISH)......................................................... 26
2.4. Genetrap-Mausmutanten ............................................................................... 27
2.4.1. Sulf1 gt und Sulf2 gt Mausmutanten ........................................................... 28
2.4.2. Bestimmung der Genetrap-Vektor Integrationsstelle............................... 29
2.5. Überexpressions-Mausmutanten ................................................................... 29
2.5.1. Col2a1-Sulf1 und Col2a1-Sulf2 Mausmutanten ...................................... 29
2.5.2. Bestimmung der Col2-Sulf1 tg199 Integrationsstelle................................... 30
2.6. Genotypisierung der Mausmutanten .............................................................. 31
2.6.1. Col2-Sulf1 Genotypisierung..................................................................... 31
2.6.2. Col2-Sulf2 Genotypisierung..................................................................... 31
2.6.3. Shh Genotypisierung............................................................................... 31
2.6.4. Sulf1 gt Genotypisierung ........................................................................... 32
2.6.5. Sulf2 gt Genotypisierung ........................................................................... 32
2.7. Zellkultur ........................................................................................................ 32
2.8. RCAS-ArsI Produktion und Injektion in Hühnerembryonen............................ 33
2.9. Materialien ..................................................................................................... 34
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