Southern Blot Methode

Weitere Magazine

Empfehlungen

Info

2.2 Aufbau des Southern Blots 2 a) In eine Schale wird die 20xSSC Lösung gegeben. Darüber wird eine Glasscheibe gelegt. Als „Docht“ werden zwei Whatman 3 MM Papiere blasenfrei aufgelegt. Das Gel wird mit der Unterseite nach oben (d.h. die Geltaschenöffnungen nach unten ) auf den Docht gelegt. Auf das Gel, also auf die Unterseite werden wiederum folgende Schichten (blasenfrei) aufgelegt: 1. eine Lage Hybond N (vorher in 2xSSC Lösung angefeuchtet ). 2. drei Lagen (in 2xSSC Lösung) angefeuchtete 3MM Whatmann Papiere. 3. als saugfähiges Material werden Zellstoff oder Apura handtücher Papier aufgelegt.. 4. Den Abschluß bildet eine Glassplatte mit einem Gewicht, sodaß ein effizienter kapillarer Transfer gewährleistet ist. 5. Der Blot erfolgt für 4 Stunden oder über Nacht. b) Nachdurchgeführtem Blot wird dieser vorsichtig abgebaut und die Gelspuren werden hierbei auf dem HybondN-Filter mit einem Kugelschreiber markiert. Anschließend wird das Filter getrocknet auf 3MM-Papier. c) Schließlich muß noch die DNA entweder mit cross-linking oder durch Backen im Trockenschrank bei 80°C 30 min fixiert werden. B. Hybridisierung Methode Herstellen der Sonde Digoxigenin-Markierung der λDNA Zur Markierung der Sonden mit Digoxigenin-11-dUTP wird der DIG-High-Prime-Kit (Roche; http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1585606a.pdf) verwendet. Das dabei verwendete Verfahren der "random primed" DNA-Markierung basiert auf der Methode von Feinberg und Vogelstein (1983; 1984).
Material, Chemikalien und Lösungen 1. DIG-High-Prime-Gemisch (DIG-High Prime Kit) 2. EDTA, 0,2 M, pH 8,0 3 Durchführung • 0,02 µg gereinigte λ-DNA in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit sterilem Aqua dest. auf ein Endvolumen von 16 µl auffüllen • λ-DNA durch 10 minütiges Erhitzen in einem Wasserkocher denaturieren und schnell in einem Eis/Ethanol-Gemisch abschrecken • 4 µl DIG-High Prime zugeben, mischen und kurz Zentrifugieren • Gemisch für 1Stunde bei 37°C inkubieren • Reaktion stoppen durch Zugabe von 2 µl EDTA und Erhitzen auf 65°C Vor-Hybridisierung und Hybridisierung der Filter Material und Lösungen 20x SSC: 3M NaCl 0.3M Na-citrate; pH7.0 Hybridisierungslösung: 5 x SSC 0,5%- ige (G/V) Blocking Reagenzien (*) 0,1%-ige (G/V) N-lauroylsarkosin, Na- Salz 0,02%-ige (G/V) Sodiumdedocylsulfat (SDS) 50%-ige (V/V) Formamid (*) Blocking Reagenzien lösen nicht so schnell, daher bitte bei 50 – 70°C aufwärmen, die Lösung bleibt trübt. Bitte diese Lösung 1 Stunde vorher vorbereiten. Die Hybridisierung Lösung wird in einer Glasflasche bei 4°C und in einem 50 ml Kunsstoffröhrchen bei -20°C aufbewahrt. Achtung, Vor(Prä)hybridisierung Lösung besteht aus Hybridisierungslösung ohne die markierte Sonde. 1. 15 minutige Prähybridisieren des Filters in der 15 ml Prähybridisierung-lösung in einem Roll-Inkubator bei 42°C 2. λDNA Probe (Dig-dUTP Markierte) wird 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad (90°C – 100°C) denaturiert und anschließend in einem Eisbad abgekühlt , bevor man in der Hybridisierungslösung zugibt. 3. Die Prähybridisierunglösung herausgenommen und durch Hybridisierungslösung ersetzt. 4. Die Inkubation des Filters im Rollinkubator bei 42°C erfolgt übernacht. Filter Waschen
Seite 1: Southern Blot Methode 1 In diesem V

Southern Blot Methode

Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.

Template löschen?

Als Template speichern?