SONDERDRUCK - Thermo Scientific

D 45 35 ISSN 0172-3790 August 2009, 34. Jahrgang
7/8
I N F E C T I O N C O N T R O L A N D H E A L T H C A R E
Offizielles Mitteilungsorgan des Arbeitskreises
Krankenhaus- und Praxishygiene der AWMF,
der Deutschen Gesellschaft für
Krankenhaushygiene (DGKH) und des
Verbundes für Angewandte Hygiene e. V. (VAH)
SONDERDRUCK
Schaal H, Schulze-Röbbecke R,
Thaneiser M, Glück W
Sterilisation von HEPA-Filtern in
Sicherheitswerkbänken der Klasse 2
mittels Formaldehydbegasung
Sterilization of HEPA-Filters in Class 2
Biological Safety Cabinets using
Vapourized Formaldehyde
Hyg Med 2009; 34 [7/8]: 282–286

Aus der Praxis
Schlüsselwörter
Formaldehydbegasung
HEPA-Filter Sterilisation
Sterilisationsverfahren
für Bioindikatoren
Keywords
Vapourized formaldehyde
HEPA-filter sterilization
Sterilization protocol for
bio-indicators
*Korrespondierender Autor:
Prof. Dr. Heiner Schaal
- Leiter BSL3 Labor -
Institut für Virologie
Universitätsstr.1 / Geb. 22.21
40225 Düsseldorf
E-Mail: schaal@uni-duesseldorf.de
Heiner Schaal 1 *, Roland Schulze-Röbbecke 2 , Marc Thanheiser 3 ,
Walter Glück 4
1 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Institut für Virologie, Düsseldorf
2 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene,
Düsseldorf
3 Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Abteilung Gentechnik /
Referat 402, Sicherheitsempfehlungen und ZKBS, Berlin
4 Thermo Fisher Scientific, 63505 Langenselbold
Sterilisation von HEPA-Filtern
in Sicherheitswerkbänken
der Klasse 2 mittels
Formaldehydbegasung
Sterilization of HEPA-Filters in Class 2 Biological Safety Cabinets
using Vapourized Formaldehyde
Zusammenfassung
Hintergrund: Die Sterilisation von High-Effi
ciency-Particulate-Air- (HEPA-) Filtern aus mikrobiologischen
Sicherheitswerkbänken ist ein
oft diskutiertes Problem. Da die Wirksamkeit der
Formaldehydbegasung zur Sterilisation von HEPA-
Filtern bislang nicht nachgewiesen wurde, stellt
eine in-situ-Formaldehydbegasung bislang keine
anerkannte Alternative zum Autoklavieren der Filter
dar. Vertreter aus Wissenschaft, Behörde und Industrie
fanden sich zu einem Expertenkreis zusammen,
um aufgrund der Inaktivierung von Bioindikatoren
(Sporen von Geobacillus stearothermophilus) einen
Wirksamkeitsnachweis der Formaldehydbegasung
von HEPA-Filtern in mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken
zu erbringen.
Methodik: Für die Nachweisführung eines wirksamen
Sterilisationserfolgs bei den Bioindikatoren
wurden diese im Arbeitsraum und in den
H14-HEPA-Filtern (Vor- und Hauptfilter) einer Sicherheitswerkbank
der Klasse 2 verteilt und über
einen Zeitraum von 9 Stunden bei ca. 65 °C und
einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100 % mit
Formaldehyd begast.
Ergebnisse: Die besonderen Materialeigenschaften
der typischen HEPA-Filter der Sicherheitswerkbänke
und die Anforderungen an eine Sterilisation
erfordern eine spezifizierte Anpassung des anerkannten
Raumdesinfektionsverfahrens mit Formaldehyd.
Unter Einhaltung der hier ermittelten
Parameter von Luftfeuchtigkeit, Temperatur und
verdampfter Formaldehydmenge wird ein Wirksamkeitsnachweis
der Formaldehydbegasung von
HEPA-Filtern einer Sicherheitswerkbank mittels
Bioindikatoren erbracht.
282
Hyg Med 2009; 34 [7/8] © mhp-Verlag GmbH
Schlussfolgerungen: Die hier beschriebene
Formaldehydbegasung erweist sich als wirksames
Verfahren zur Sterilisation von HEPA-Filtern einer
Sicherheitswerkbank für Mikroorganismen und deren
Dauerformen. Lediglich der Sonderfall der Prioneninaktivierung
ist hiervon ausgenommen. Diese
Ergebnisse beenden die Jahrzehnte andauernde
Debatte um die Wirksamkeit der Formaldehydbegasung
von HEPA-Filtern in Sicherheitswerkbänken.
Hyg Med 2009; 34 [7/8]: 282–286
Summary
Background: The sterilization of high efficiency
particulate air- (HEPA-) filters from biological safety
cabinets has often been discussed. Since vapourized
formaldehyde so far has not been tested for
HEPA-filter sterilization, it does not present an acceptable
alternative to autoclave sterilization at
present. In the study presented here, representatives
from science, government agencies and industry
got together to establish a new formaldehyde
sterilization protocol for HEPA-filters in
biological safety cabinets (BSC).
Method: To validate the effectiveness of formaldehyde
sterilization, spores of Geobacillus stearothermophilus
were used as bio-indicators and
placed in different positions inside the BSC and the
pre- and main H14-HEPA-filters of an enhanced
class 2 BSC. The BSC run over a period of 9 hours
with vapourized formaldehyde at approx. 65 °C and
relative humidity of 100 %.
Results: The particular characteristics of a typical
HEPA-filter of a BSC and the requirement for a
sterilization protocol necessitated specific cus-

tomization of the well-established disinfection
protocol using vapourized formaldehyde. Adhering
to the parameters determined here, (relative humidity,
temperature, and amount of vapourized
formaldehyde), the effectiveness of sterilization of
bio-indicators inserted into HEPA-filters of a class
2 BSC is demonstrated.
Conclusions: The new protocol for vapourized
formaldehyde presented in this study proves itself
as effective in the sterilization of HEPA-filters of a
BSC. However, this protocol is not suited to inactivate
prions. These results close the decade-long
controversy concerning the efficacy of vapourized
formaldehyde for the sterilization of BSC and their
HEPA-filters.
Einleitung
Die Inaktivierung von gefährlichen biologischen
Agenzien wird in Bereichen mäßigen
und höheren Risikos durch das anerkannte
Raumdesinfektionsverfahren der Begasung
mit Formaldehyd vorgenommen [1,2,3].
Da die Wirksamkeit der Formaldehydbegasung
zur Sterilisation von HEPA-Filtern
bislang nicht nachgewiesen wurde, gelten
die Filter auch nach einer Begasung nicht
als steril, sondern nur als „sicher für den
Gebrauch beim Tragen geeigneter Schutzkleidung“.
Solche Filter sollten daher nach
Entnahme autoklaviert oder einer zugelassenen
Verbrennung zugeführt werden
[4]. Der europäische Stand der Technik für
mikrobiologische Sicherheitswerkbänke
DIN EN 12 469 weist in seinem informativen
Anhang auf die Begasung der Filter
mit Formaldehyd hin, wenn die Filter
einer Werkbank beispielsweise gewechselt
werden müssen. Gleichzeitig besteht
der Auflassungsvermerk, dass zusätzlich
eine anerkannte Inaktivierungsmaßnahme
notwendig ist, zum Beispiel durch Autoklavieren
oder Verbrennen.
Die Gesetzgebung zum Arbeitsschutz
in Bereichen, in denen mit biologischen
Agenzien mit Risikopotential umgegangen
werden muss, schreibt in der Regel die
Verwendung von mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken
vor [6,7]. Die Sicherheitswerkbank
der Klasse 2 nach DIN
EN 12 469 hat sich hier weitestgehend
durchgesetzt, da sie die nötigen Schutzfunktionen
für den Anwender, das Bearbeitungsgut
und die Umgebung bietet.
Das mit über 70 % im Bereich der
mikrobiologischen Labore vertretene,
bekannteste und seit Jahrzehnten bewährte
System stellt die Sicherheitswerkbank
mit einem HEPA-Umluft- und einem
HEPA-Abluftfilter dar (Abbildung 1).
Die Qualität und Funktion des Luftvorhangs
an der Arbeitsöffnung zusammen mit
der Integrität des Filtersystems und der
Qualität der laminaren Umluftströmung
bilden die Faktoren für die Personen- und
Umgebungsschutzeigenschaften des Gerätes.
Die Filter sind mit der Klassifizierung H 14
nach DIN EN 1822 vorgeschrieben. Sie sind
danach so bemessen, dass sie Partikel mit
der Most Penetration Particle Size (MPPS)
von ca. 0,1–0,2 µm zu 99,995 % abscheiden.
Dies ist einer Abscheideleistung von 99,99 9%
bei einer Partikelgröße von 0,3 µm gleichzusetzen.
Der von oben nach unten gerichtete
turbulenzarme, laminare Umluftstrom
drückt eventuelle Aerosolfreisetzungen im
Arbeitsraum auf die Arbeitsoberfläche und
führt sie über die darin enthaltenen Luftschlitze
zu den Filtern ab.
Wenn besonders reine Arbeitsbedingungen,
erhöhte Abscheidegrade oder hohe
Sicherheit vor Kreuzkontaminationen durch
den Umluftstrom erforderlich sind, kommen
Abbildung 1: Schematische Zeichnung einer
mikrobiologischen Sicherheitswerkbank der
Klasse 2 in einfacher Ausführung. Durch die
Ventilatoren wird an der Gerätefront Luft als
Luftvorhang in die Werkbank gerichtet angesaugt
(Zuluftstrom, rote Pfeile). Ein Großteil der
Luft wird im Arbeitsraum über ein HEPA-Filter
(grauer Kasten oberhalb des Arbeitsraumes) gereinigt
als Umluft-Volumenstrom geführt (blautürkis),
der sowohl den Produkt- als auch den
Verschleppungsschutz des Gerätes für das Bearbeitungsgut
bestimmt. Nach Durchmischung mit
dem Umluftstrom wird der Teil der Luft, der an
der Gerätefront angesaugt wurde, als Mischluftstrom
aus Zu- und Umluftstrom (hellvioletter
Pfeil) über ein weiteres HEPA-Filter auch an
die Umgebung oder in ein übergeordnetes Abluftsystem
bauseits abgegeben. Nicht gefilterte
Bereiche in der Sicherheitswerkbank sind Beige-
Hellbraun unterlegt.
283
Hyg Med 2009; 34 [7/8] © mhp-Verlag GmbH
Aus der Praxis
seit mehr als 25 Jahren verstärkte Systeme
mit zusätzlicher HEPA-Filterstufe (~3-Filtersysteme)
genauso zum Einsatz, wie zum
Schutz vor hochwirksamen Stoffen mit
Gefährdungspotential oder zur Vermeidung
von Risiken bei der Filter-Handhabung und
-Entsorgung [8]. Hierbei handelt es sich um
so genannte 3-Filter-Systeme, die sowohl
im Umluftstrom des Arbeitsraums als auch
im Geräte-Abluftstrom mindestens 2 HEPA-
Filter in Reihe geschaltet haben (Abbildung
2). Dabei ist das zentrale Hauptfilter meist
segmentiert (Abbildung 3), leicht und mit
geringstem Kontaminationsrisiko für das
Wartungspersonal und die Umgebung
wechselbar. Das Filter ist in der Regel unterhalb
der eigentlichen Arbeitsfläche des Arbeitsraums
angeordnet. Die beiden anderen
HEPA-Filter dienen dann nur noch als „Verteilfilter“
des Luftstroms am klassischen
Einbauort der Klasse 2-Sicherheitswerkbank
in einfacher Ausführung.
Die Umluft und die Geräteabluft werden
so jeweils mindestens 2-fach filtriert. Der
Mindest-Abscheidegrad, des HEPA-Filtersystems
wird in Bezug auf (Nominal-)Partikel
der Größe 0,3 µm gegenüber einer
einfachen Sicherheitswerkbank um den
Faktor 100 000 erhöht (H 14-Filter nach DIN
EN 1822). Die segmentierten Filterelemente
des Hauptfilters lassen sich einzeln beurteilen
und im Falle des nötigen Wechsels
können diese während laufender Lüftung
sequenziell innerhalb des geschützten Arbeitsraums
verpackt und der geregelten
Sterilisation/Entsorgung zugeführt werden.
So ist ein Höchstmaß an Sicherheit des
Wechsels für das Wartungspersonal und die
Umgebung in Bezug auf mögliche Kontaminationsrisiken
gewährleistbar [9].
Da die Formaldehydbegasung zur Sterilisation
der Filter von Sicherheitswerkbän-
Abbildung 2: Schematische Zeichnung einer
mikrobiologischen Sicherheitswerkbank
der Klasse 2 in verstärkter Ausführung.
Ähnlich der klassischen Ausführung (vgl.
Abbildung 1 und Legende), jedoch wird
der Gesamtluftstrom, der in der Sicherheitswerkbank
gefördert wird, ständig über
mindestens 2 hintereinander geschaltete
HEPA-Filterstufen gereinigt. Hier wird das
durch ein segmentiertes HEPA-Hauptfilter
erreicht, das dafür sorgt, dass die restliche
Sicherheitswerkbank von Kontaminationen
frei gehalten wird. Sowohl der im Arbeitsraum
rezirkulierende Umluftstrom als auch
der Abluft-Volumenstromanteil des Systems
wird (mindestens) 2-fach über H14-HEPA-
Filter gefiltert. Durch diese Filteranordnung
wird der mögliche kontaminierte Bereich
deutlich verringert.

Aus der Praxis
ken bislang keine anerkannte Alternative
zum Autoklavieren darstellt, war es das Ziel
dieser Validierung, Parameter zu definieren,
die die Sporen von Geobacillus stearothermophilus
mittels Formaldehydbegasung aller
Filter in der laufenden Sicherheitswerkbank
sicher inaktivieren.
Material und Methoden
Nachweisführung, Testverfahren
und Testverlauf
Für die Nachweisführung eines wirksamen
Sterilisationserfolgs von Bioindikatoren nach
DIN ISO 11138-5:2006 mittels Formaldehydbegasungen
wurde eine Sicherheitswerkbank
der Klasse 2 in verstärkter Ausführung
(~ 3-Filter-System) herangezogen
(Abbildung 2 und 3A).
Technische Daten
der Sicherheitswerkbank
Hersteller: Thermo Fisher Scientific, Marke
Heraeus Modellreihe HERAsafe, Typ KSP
12, Länge der Arbeitsöffnung 1,2 m; Höhe
der Arbeitsöffnung 0,2 m; Nominaler Umluft-Volumenstrom
~823 m 3 /h; reduzierter
Luftstrom bei geschlossener Frontscheibe
~ 240–360 m 3 /h; Innenraum-Volumen /
Gesamt-Dampfraum der Sicherheitswerkbank
1,85 m 3 ; Filtermaterial auf Basis von
Borosilikatglasfasern.
Sterilisationsverfahren
Unabhängig vom Verfahren wurde die
technische Lüftung der Sicherheitswerkbank
während des gesamten Begasungszeitraums
bei reduzierter Stufe betrieben,
Öffnungen geschlossen bzw. die Umgebung
durch einen Aktivkohlefilter vom
Abluftsystem getrennt. Dies gewährleistet
einen Druckausgleich beim Erwärmen und
einen minimalen Abluftstrom, wodurch
das Abluftfilter der Werkbank vom Formaldehyd
gleichmäßiger durchströmt wird.
Desinfektionsmittel-Verdampfer
Der hier verwendete Desinfektionsmittel-
Verdampfer besteht aus einem Verdampferteil
für Formalin und einem davon
abhängig gesteuerten Verdampferteil für
Ammoniak-Wasser. Er wurde so konstruiert,
dass mehrheitlich nur Heißdampf den
Luftströmungen des Gerätes beigemischt
wird. Mittels Einschalt-Verzug wird zunächst
das Verdampfen des Formalins angesteuert.
Nach ca. 15–20 Minuten schaltet der Trockengehschutz
des Formalinverdampfers
auf ein Zeitglied, das abhängig von der
einzustellenden Einwirkzeit, nach deren
Ablauf das Verdampfen des Ammoniak-
Wassers ansteuert. Ist dessen Verdampfung
abgeschlossen, schaltet der zugehörige Trockengehschutz
das System aus.
Formaldehydbegasung
Verfahren A
In Anlehnung an das Standard-Raumbegasungsverfahren
gemäß RKI-Liste
[1] bzw. TRGS522 wurden 60 ml einer
Formaldehyd-Lösung (17,5 %) in einer
Sterilwerkbank verdampft und nach
Abbildung 3: Segmentierte H14-Hauptfilterstufe im Arbeitsraum. Seitenansicht (A)
einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank der Klasse 2 in verstärkter Ausführung.
Teilansicht (B) mit einem herausgenommenem Segment des H14-Hauptfilters.
284
Hyg Med 2009; 34 [7/8] © mhp-Verlag GmbH
12-stündiger Einwirkzeit mit 20 ml Ammoniak
(25 %) neutralisiert.
Verfahren B
Es wurden 1000 ml einer Formaldehyd-
Lösung (17,5 %) in einer Sterilwerkbank
verdampft und nach 12-stündiger Einwirkzeit
mit 300 ml Ammoniak (25 %)
neutralisiert. Die Luftfeuchtigkeit im Dampfraum
der betriebenen Sicherheitswerkbank
wurde durch zwei im Arbeitsbereich der
Sicherheitswerkbank seitlich aufgestellte
Wasserbäder (befüllt mit je 18 l H 2 O) erhöht.
Die Erhöhung der Luftfeuchtigkeit erfolgte
über das Aufheizen der Wasserbäder auf
96 °C. Durch die vollständige Einhausung
der Sicherheitswerkbank mit 40 mm Styroporplatten
wurde dem Wärmeabfluss
aus dem Dampfraum entgegengewirkt.
Durch diese Isolationsmaßnahme konnte
die allein durch die Wasserbäder erzeugte
Einwirktemperatur von ~65 °C aufrechterhalten
werden. Das Gerät zur Fomaldehyd-
Verdampfung wurde in der Mitte der Arbeitsfläche
auf die Ränder der Wasserbäder
aufgestützt, so dass sich das Gerät 15 cm
über der Arbeitsfläche befand. Zur Messung
der Luftfeuchte (kapazitiver Feuchtefühler;
Feuchtesensor FH A646-1; Ahlborn Mess-
und Regelungstechnik GmbH, Holzkirchen)
und der Temperatur (Widerstandsthermometer;
PT 100 4-LEITER 4mm M-FX 416,
Abbildung 4: Verwendete Bioindikatoren nach DIN ISO 11138-5:2006 in
Form von „Sporenstreifen“. Die Sporenstreifen (A) wurden an einem Ende
aufgefädelt (B), um sie dann entweder im Innenraum des Arbeitsraums oder
in den Filtern befestigen und steril wieder entnehmen zu können.
Abbildung 5: Verteilung der Sporenstreifen in den Filtern. Die aufgefädelten
Sporenstreifen (vgl. Abb. 4B) wurden an den mit Pfeilen markierten Positionen
(s. Längsschnitt durch eine Sicherheitswerkbank (A), Aufsicht (B) und
Frontansicht (C) eines Filtersegmentes) einseitig oder beidseitig eingebracht.

B; TMH Temperatur Messelemente, Hanau)
im Dampfraum wurden je zwei Messfühler
unterhalb des Umluftfilters in der Mitte und
am Rand der Arbeitsfläche positioniert. Die
Messwerte wurden über den gesamten
Begasungszeitraum im Abstand von 30 sec
aufgezeichnet. Alle Anschlusskabel wurden
durch die Stopfen an der Seite geführt, um
ein Maximum an Dichtigkeit des Dampfraums
zu gewährleisten.
Überprüfung des Sterilisationserfolgs
Zur Überprüfung des Sterilisationserfolgs
wurden Bioindikatoren nach DIN EN ISO
11138-5:2006 in Form von „Sporenstreifen“
verwendet (BAG-BioStrip, Fa. BAG Health
Care GmbH, Lich, Cat. No. 7479, Abbildung
4). Diese enthalten auf einem Trägermaterial
10 5 Sporen von Geobacillus stearothermophilus
ATCC 7953 als Testkeime (D-Wert 121 °C
1,7; D-Wert 134 °C 0,10; Z-Wert 9,1). Bei den
Sterilisationstests wurden die Sporenstreifen
im Raum, auf den inneren Oberflächen
und in den Filtern der Sicherheitswerkbank
verteilt (Abbildung 5).
Nach Formaldehyd-Exposition wurde
jeder Sporenstreifen mit einer sterilen
Pinzette in ein verschließbares Röhrchen
mit CASO-Bouillon und Zusatz von TLCH
zur Formaldehyd-Inaktivierung (Fa. heipha
Dr. Müller GmbH, Eppelheim, Art.
Nr. 58200090) gegeben. Zusätzlich wurde
je Versuch eine Positiv-Kontrolle mit nicht
exponierten Sporenstreifen mitgeführt.
Anschließend wurden die Röhrchen gemäß
DIN 58948 Teil 14 [10] zur Hitzeaktivierung
der Sporen 60 min im Wasserbad
bei 90 °C gehalten und danach 7 Tage bei
57 °C bebrütet. Kam es während der Bebrütungszeit
zur Vermehrung der Test-
keime (feststellbar anhand einer sichtbaren
Trübungs- bzw. Sedimentationsbildung
innerhalb eines Röhrchens), so
wurde der jeweilige Teststreifen als „nicht
sterilisiert“ beurteilt. Bei ausbleibender
Trübung bzw. Sedimentation galten die
Testkeime des Teststreifens als inaktiviert,
der Teststreifen somit als „sterilisiert“. Nur
bei Sterilisation ausnahmslos aller Teststreifen
wurde die Sterilisation der Sicherheitswerkbank
als erfolgreich bewertet.
Ergebnisse
Um die Inaktivierung von Sporen von
Geobacillus stearothermophilus (ATCC 7953)
durch Verfahren A nachzuweisen, wurden
160 Sporenstreifen in allen Filtern, an den
Scheiben und frei hängend im Arbeitsraum
der Sicherheitswerkbank eingebracht und
nach 12-stündiger Formaldehyd-Exposition
einem Sterilitätstest unterzogen. Überraschenderweise
kam es bei ausnahmslos
allen 160 Sporenstreifen nach eintägiger
Bebrütung bei 57 °C zu einer deutlichen
Vermehrung der Testkeime. Dieses Ergebnis
zeigt, dass das Standardverfahren zur
Raumbegasung gemäß RKI-Liste [1] zur
Inaktivierung von Geobacillus-stearothermophilus-Sporen
gänzlich ungeeignet ist.
Entsprechend den Empfehlungen zur
Anlagensterilisation mit Formaldehyd
sollte die Formaldehyd-Exposition optimalerweise
bei einer Temperatur oberhalb
von 60 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit
von 100 % stattfinden [3].
Um während des gesamten Expositionszeitraums
die Temperatur und Luftfeuchtigkeit
zu erhöhen, wurden nachfol-
285
Hyg Med 2009; 34 [7/8] © mhp-Verlag GmbH
Aus der Praxis
gend ein Wasserbad und ein Heizungsradiator
in den Arbeitsraum eingebracht und
die Formaldehydverdampfung bei eingeschaltetem
Wasserbad (96 °C) wiederholt.
Die Überprüfung des Sterilisationserfolges
erfolgte wiederum mittels Bioindikatoren.
Wenngleich über den gesamten Begasungszeitraum
nun eine mittlere erhöhte
Temperatur von ~45 °C gemessen werden
konnte, zeigte sich gleichzeitig, dass die
Luftfeuchtigkeit innerhalb des Arbeitsraums
der Werkbank zum Heizungsradiator
hin drastisch abnahm. Insgesamt lag
die mittlere Luftfeuchtigkeit, trotz des vom
Wasserbad erzeugten heißen Wasserdampfes
bei lediglich ~28 %. Da allerdings
einige Sporenstreifen in der Nähe des
Wasserbads ein verzögertes Wachstum
zeigten, deutete dieses Ergebnis darauf hin,
dass eine weitere Erhöhung der Lufttemperatur
bei gleichzeitiger konstant hoher
Luftfeuchtigkeit zu einem Sterilisationserfolg
führen könnte.
Als nächstes wurde daher ermittelt, wie
mit handelsüblichen Mitteln die Temperatur
über den gesamten Begasungszeitraum
oberhalb von 60 °C bei einer gleichzeitigen
relativen Luftfeuchtigkeit von 100 % aufrecht
erhalten werden kann. Als Ergebnis
einer Reihe von Vorversuchen stellte sich
der unter Verfahren B beschriebene Versuchsaufbau
als geeignet heraus.
Um mittels Bioindikatoren zu prüfen,
ob dieser Versuchsaufbau auch zur wirksamen
Sterilisation aller HEPA-Filter führt,
wurden 77 Sporenstreifen im Arbeitsraum
und in allen Filtern der Werkbank eingebracht.
Es wurde darauf geachtet, dass
Sporenstreifen insbesondere auch an kritisch
eingeschätzten Stellen (z. B. in den
Abbildung 6: Temperatur- und Luftfeuchteverlauf
während der Formaldehydbegasung.
Während der
Begasungsdauer wurde die Temperatur
und die relative Luftfeuchte alle
30 sec gemessen. Über den Begasungszeitraum
von 9 Stunden (hellgrau
markiertes Zeitfenster) ergab sich
bei erfolgreicher Sterilisation eine
100 %ige Luftfeuchte bei einer mittleren
Temperatur von 65 °C.

Aus der Praxis
äußerst seitlich angebrachten Filtern) positioniert
wurden. Um die Wahrscheinlichkeit
für einen wirksamen Sterilisationserfolg
zu erhöhen, wurde zusätzlich die
Menge der verdampften Formaldehyd-
Lösung erhöht. Die Werkbank selber wurde
vollständig mit Styroporplatten eingehaust,
um einem Temperaturverlust innerhalb
der Werkbank entgegen zu wirken.
Unter diesen Bedingungen (Verfahren
B) konnte über einen Zeitraum von
9 Stunden eine Durchschnittstemperatur
von 64,7 °C (Messfühler 1) bzw. 65,5 °C
(Messfühler 2) bei einer Luftfeuchte von
100 % erreicht werden (Abbildung 6).
Erwartungsgemäß konnte nun auch tatsächlich
eine Sterilisation ausnahmslos
aller 77 Sporenstreifen nachgewiesen werden.
Diese Ergebnisse lassen den Schluss
zu, dass die HEPA-Filter gleichmäßig vom
Formaldehyddampf erfasst wurden und
die Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens
an allen erfassten Stellen innerhalb
der Sicherheitswerkbank und der Filter
gleichermaßen gegeben war.
Diskussion
Obwohl die Raumbegasung mit Formaldehyd
als anerkanntes Desinfektionsverfahren
und die Niedrigtemperatur-Dampf-
Formaldehyd-Sterilisation als anerkanntes
Sterilisationsverfahren gilt, gibt es viele unterschiedliche
Meinungen über die Sicherheit
des Verfahrens für die Applikation an
mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken,
da ein eindeutiger Wirksamkeitsnachweis
bislang nicht erbracht wurde. Die einzige
gesicherte Erkenntnis ist, dass sich Formaldehyd
nicht zur Inaktivierung von Prionen eignet.
Aufgrund der fixierenden Wirkung und
der damit verbundenen Resistenzerhöhung
gegenüber anderen Inaktivierungsverfahren
ist Formaldehyd dort kontraindiziert [5].
Bereits 1991, vor Erscheinen der TRGS
522, wurde durch die Hanauer Firma Heraeus
eine mikrobiologische Untersuchung zur
Sterilisation von Sicherheitswerkbänken
mittels Formaldehyd durchgeführt. Die
Versuche wurden an einer Sicherheitswerkbank,
ganz ähnlich der heutigen Klasse 2 in
verstärkter Ausführung mit so genanntem
3-Filter-System, durchgeführt, da diese die
höchsten Anforderungen an die Sterilisation
der gesamten Werkbank mitsamt der Filter
stellen. Es wurde nachgewiesen, dass der
Formaldehyddampf alle eingesetzten HEPA-
Filterstufen durchdringt. Die Versuche
wurden mit Bacillus-subtilis-Sporen durchgeführt,
die im Arbeitsraum der Werkbank
vernebelt worden waren. Die anschließende
Begasung erfolgte nach der damals gültigen
DIN 12 950, wie sie auch heute noch im
informativen Anhang J der aktuellen DIN
EN 12 469 beschrieben ist (vgl. Verfahren
A). Unter diesen Bedingungen konnte gezeigt
werden, dass Keime im Arbeitsraum
und auf der Oberfläche des Hauptfilters inaktiviert
worden waren. Ungeklärt blieb
jedoch insbesondere die Frage, inwiefern die
Filterinnenräume mit Testkeimen beaufschlagt
waren und wie hoch die erzielte
Keimreduktion war.
Die hier nun vorgestellten Untersuchungen
zeigen, dass Sporen in Sporenstreifen,
die unmittelbar auf die Filter und zwischen
die Falten der Filter gebracht wurden, durch
den Formalddampf wirksam inaktiviert
werden können, dass aber die relative Luftfeuchtigkeit
und die Temperatur kritische
Parameter darstellen, die während des Inaktivierungsvorgangs
bestimmte Mindestwerte
erreichen müssen. Sterilisationsversuche
im Rahmen unserer Vorversuche
zeigten, dass selbst bei einer relativen Luftfeuchtigkeit
von 100 % eine Durchschnittstemperatur
von lediglich ~47 °C nicht zur
Inaktivierung aller Keime führte, sondern
erst Temperaturen von ca. 65 °C.
Wenngleich die minimal wirksame
Sterilisationstemperatur bei der Begasung
zwischen 47 °C und 65 °C liegen wird und
ebenso die eingesetzte Formaldehydmenge
reduziert werden könnte oder spezifische
Validierungen mit den resistentesten umhüllten
und unbehüllten Viren für ausschließlich
virologisch arbeitende Laboratorien
zu einer Reduzierung der notwendigen
Begasungsparameter führen könnte,
können bei Durchführung des hier beschriebenen
Verfahrens B nicht nur die
entnommenen Filter, sondern der gesamte
Innenraum der Sicherheitswerkbank als
praktisch steril betrachtet werden.
In Bereichen höheren Risikos erscheint
neben dem Erfassen der physikalischen
Parameter das Überprüfen der
Wirksamkeit des Sterilisationsverfahrens
durch Bioindikatoren nach DIN EN ISO
11138-5 als sinnvoll.
Das hier geschilderte Sterilisationsverfahren
ist dem Autoklavieren, bei dem
lediglich die Filter selbst sterilisiert werden,
vorzuziehen, insbesondere dann,
wenn eine Sicherheitswerkbank gewartet
oder ausgemustert werden soll.
286
Hyg Med 2009; 34 [7/8] © mhp-Verlag GmbH
Danksagung
Wir danken Herrn Björn Wefers, Institut für
Virologie, Frau Hanne Monix und Barbara
Noske, Institut für Medizinische Mikrobiologie
und Krankenhaushygiene sowie den
Herrn Klaus Hauck, Rudi Kampfmann und
Heinrich Müller (Thermo Fisher Scientific)
für ihre exzellente technische Unterstützung
bei der Durchführung dieses Projekts.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt
im Sinne der Richtlinien
des International Committee of Medical
Journal Editors besteht.
Literatur
1. Liste der vom Robert Koch-Institut geprüften und anerkannten
Desinfektionsmittel und -verfahren (Desinfektionsmittelliste,
15. Ausgabe), 2007, Bundesgesundheitsbl
- Gesundheitsforsch. - Empfehlung Gesundheitsschutz;
50: 1335–1356.
2. Technische Regel für Gefahrstoffe 522, Raumdesinfektion
mit Formaldehyd (TRGS 522), Ausgabe: Juni 1992,
zuletzt geändert: BArbBl. Heft 9/2001.
3. Wallhäuser, K. H.; Praxis der Sterilisation, Desinfektion,
Konservierung, Keimidentifizierung, Betriebshygiene; 5.
völlig überarbeitete Auflage; 1995; Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, New York.
4. DIN Deutsches Institut für Normung e. V.; DIN EN 12469,
Ausgabe: 2000-09; Biotechnik - Leistungskriterien für
mikrobiologische Sicherheitswerkbänke; Beuth Verlag
GmbH.
5. Die Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJK)
Abschlussbericht der Task Force vCJK zu diesem
Thema. Bundesgesundheitsbl-. Gesundheitsforsch-
Gesundheitsschutz. (4/2002) 45:376–394.
6. Verordnung über Sicherheit und Gesundheitsschutz bei
Tätigkeiten mit biologischen Arbeitsstoffen (Biostoffverordnung
– BioStoffV) vom 27. Januar 1999; BGBl. I S. 50;
zuletzt geändert März 2007; BGBl. I S. 261.
7. Verordnung über die Sicherheitsstufen und Sicherheitsmaßnahmen
bei gentechnischen Arbeiten in gentechnischen
Anlagen (Gentechnik-Sicherheitsverordnung
- GenTSV) vom 14. März 1995; BGBl. I S. 297; zuletzt
geändert März 2007; BGBl. I S. 261.
8. DIN Deutsches Institut für Normung e. V.; DIN 12980,
Ausgabe: 2005-06; Laboreinrichtungen – Sicherheitswerkbänke
für Zytostatika; Beuth Verlag GmbH.
9. Stellungnahme der ZKBS zur Entsorgung der nachgeschalteten
HEPA-Filter aus einer mikrobiologischen
Sicherheitswerkbank der Klasse 2 in einer gentechnischen
Anlage der Stufe 3; Az.: 6790-07-47; 6. Mai 2008;
www.bvl.bund.de.
10. DIN Deutsches Institut für Normung e. V.; DIN 58948
Teil 14, Ausgabe: Jan. 1987; Bio-Indikatoren zur
Prüfung auf Wirksamkeit von Formaldehydgassterilisatoren.
Weitere Informationen:
www.thermo.com/bsc
Lit.Code: PFBSC_HEPASterilisation_2009