201249
201249
201249
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
ΑTEI ΑΘΗΝΑΣ<br />
ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ<br />
ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ<br />
ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ<br />
ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ ΥΓΡΗΣ ΦΑΣΗΣ<br />
ΤΕΧΝΙΚΗ, ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΤΑ, ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ<br />
ΣΑΜΑΡΑ ΕΝΙΝΤΑ<br />
ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΡΕΒΕΛΟΣ ΚΥΡΙΑΚΟΣ<br />
ΑΘΗΝΑ 2012
ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ<br />
ΤΤΕΕΧΧΝΝΙΙΚΚΗΗ,, ΠΠΛΛΕΕΟΟΝΝΕΕΚΚΤΤΗΗΜΜΑΑΤΤΑΑ,, ΠΠΡΡΟΟΟΟΠΠΤΤΙΙΚΚΕΕΣΣ
ΠΠΕΕΡΡΙΙΕΕΧΧΟΟΜΜΕΕΝΝΑΑ<br />
11 ΕΕΙΙΣΣΑΑΓΓΩΩΓΓΗΗ ............................................................................................ 1<br />
1.1 Τι είναι η τεχνολογία της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης; ................... 3<br />
1.2 Συστήματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ......................................... 4<br />
1.3 Εφαρμογή της κυτταρολογίας υγρής φάσης και στην μηγυναικολογική<br />
κυτταρολογία ........................................................................ 5<br />
22 ΤΤΕΕΧΧΝΝΙΙΚΚΗΗ ΤΤΗΗΣΣ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ................... 8<br />
2.1 Παρασκευή γυναικολογικών δειγμάτων ............................................ 8<br />
2.1.1 Συσκευές δειγματοληψίας ......................................................... 8<br />
2.1.2 Λήψη δειγμάτων ....................................................................... 9<br />
2.1.3 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς ................................... 11<br />
2.1.4 Προετοιμασία δειγμάτων ......................................................... 12<br />
2.1.5 Επεξεργασία δειγμάτων και παρασκευή επιχρισμάτων .......... 13<br />
2.1.5.1 ThinPrep 2000 Processor (Hologic) ................................. 14<br />
2.1.5.2 BD PrepStain Slide Processor (Becton Dickinson) ...... 16<br />
2.2 Λήψη και παρασκευή μη-γυναικολογικών δειγμάτων ...................... 20<br />
2.2.1 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς ................................... 20<br />
2.2.2 Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων ..................................... 21<br />
2.3 Αξιολόγηση επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης στο<br />
μικροσκόπιο .............................................................................................. 25<br />
2.4 Αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου .......................................... 30<br />
2.4.1 Ιστορική Αναδρομή ................................................................. 30<br />
2.4.2 FocalPoint Slide Profiler ...................................................... 31<br />
2.4.3 Διαδραστικά συστήματα ελέγχου ............................................ 33<br />
33 ΠΠΛΛΕΕΟΟΝΝΕΕΚΚΤΤΗΗΜΜΑΑΤΤΑΑ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ........ 36<br />
3.1 Απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ................................... 37<br />
3.1.1 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων ........................................................... 37<br />
3.1.1.1 Δημοσιευμένες έρευνες και στοιχεία που υποστηρίζουν την<br />
χρήση της κυτταρολογίας υγρής φάσης στην κλινική πράξη .............. 37<br />
3.1.1.2 Έρευνες του Κολλεγίου των Αμερικανών Παθολόγων ..... 40<br />
i
3.1.1.3 Βασικές μελέτες (pivotal studies) σύγκρισης των<br />
τεχνολογιών κυτταρολογίας υγρής φάσης με την συμβατική<br />
κυτταρολογία ..................................................................................... 42<br />
3.1.2 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο<br />
επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας .................................. 43<br />
3.1.3 Συμπέρασμα ........................................................................... 44<br />
3.2 Επάρκεια δειγμάτων ....................................................................... 45<br />
3.2.1 Ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων και οι αιτίες που τα<br />
προκαλούν ............................................................................................ 46<br />
3.3 Οι επιδόσεις των κυτταροπαθολόγων στην ερμηνεία<br />
επιχρισμάτων Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ............................................. 50<br />
3.4 Επικουρικές εξετάσεις σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης .. 52<br />
3.5 Αυτοματοποίηση στην ανάλυση επιχρισμάτων γυναικολογικής<br />
κυτταρολογίας ............................................................................................ 53<br />
44 ΕΕΦΦΑΑΡΡΜΜΟΟΓΓΗΗ ΜΜΟΟΡΡΙΙΑΑΚΚΩΩΝΝ ΜΜΕΕΘΘΟΟΔΔΩΩΝΝ ΣΣΕΕ ΔΔΕΕΙΙΓΓΜΜΑΑΤΤΑΑ<br />
ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ΚΚΑΑΙΙ ΗΗ ΧΧΡΡΗΗΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥΣΣ ΣΣΤΤΗΗΝΝ<br />
ΔΔΙΙΑΑΓΓΝΝΩΩΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥ ΚΚΑΑΡΡΚΚΙΙΝΝΟΟΥΥ:: ΠΠΡΡΟΟΚΚΛΛΗΗΣΣΕΕΙΙΣΣ ΚΚΑΑΙΙ ΠΠΡΡΟΟΟΟΠΠΤΤΙΙΚΚΕΕΣΣ 57<br />
4.1 Ο ρόλος της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στην ανίχνευση<br />
μοριακών δεικτών για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της<br />
μήτρας ....................................................................................................... 57<br />
4.1.1 Μοριακή διάγνωση του HPV ................................................... 58<br />
4.1.2 Παραδείγματα εφαρμογής του HPV DNA test στον<br />
πρωτοβάθμιο έλεγχο ............................................................................. 60<br />
4.1.3 Μοριακοί δείκτες ..................................................................... 63<br />
4.1.4 Νέοι τρόποι προσέγγισης στην πρόληψη του καρκίνου του<br />
τραχήλου της μήτρας με σημαντική προγνωστική αξία ......................... 66<br />
4.1.4.1 Διπλή χρώση p16 INK4a / Ki-67 ........................................... 66<br />
4.1.4.2 Διάγνωση του ΚΤΜ ανιχνεύοντας το mRNA των E6/E7 ... 67<br />
4.2 Μοριακοί δείκτες για την ανίχνευση του θυρεοειδούς<br />
καρκινώματος σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ......................... 68<br />
4.3 Εξελίξεις στην κυτταρολογία του καρκίνου του μαστού ................... 71<br />
55 ΣΣΧΧΕΕΣΣΗΗ ΚΚΟΟΣΣΤΤΟΟΥΥΣΣ--ΑΑΠΠΟΟΤΤΕΕΛΛΕΕΣΣΜΜΑΑΤΤΙΙΚΚΟΟΤΤΗΗΤΤΑΑΣΣ ΤΤΗΗΣΣ<br />
ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗ ....................................................... 74<br />
66 ΣΣΥΥΜΜΠΠΕΕΡΡΑΑΣΣΜΜΑΑ ................................................................................. 78<br />
ΠΠΕΕΡΡΙΙΛΛΗΗΨΨΗΗ ............................................................................................... 83<br />
AABBSSTTRRAACCTT ............................................................................................... 84<br />
ΒΒΙΙΒΒΛΛΙΙΟΟΓΓΡΡΑΑΦΦΙΙΑΑ ........................................................................................ 85<br />
ii
Στην οικογένειά μου<br />
iii
11 ΕΕΙΙΣΣΑΑΓΓΩΩΓΓΗΗ<br />
επανάσταση στην διαγνωστική κυτταρολογία ήρθε ως<br />
γνωστόν, με την εφαρμογή του τεστ Παπανικολάου. Με την<br />
καθιέρωση της Κλινικής Κυτταρολογίας ως νέα επιστήμη<br />
αναγνωρίστηκε επίσημα ο τομέας της Διαγνωστικής Αποφολιδωτικής<br />
Κυτταρολογίας στις αρχές της οποίας στηρίχτηκε το τεστ Παπανικολάου. Ο<br />
νέος κλάδος έθεσε τα θεμέλιά του μέσα από την συνεργασία του έλληνα<br />
γιατρού Γεώργιου Παπανικολάου με κορυφαίους ειδικούς που οδήγησε<br />
στην δημοσίευση του «Διάγνωση του καρκίνου της μήτρας μέσω των<br />
κολπικών επιχρισμάτων» (The diagnosis of uterine cancer by the vaginal<br />
smear) το 1943, η οποία υπεγράφη από τα μέλη των μεγάλων ιατρικών<br />
σχολών του Χάρβαρντ, της Βοστόνης και της Νέας Υόρκης. Έκτοτε το τεστ<br />
Παπανικολάου μπήκε στην ζωή των γυναικών σε όλο τον κόσμο και συνεχίζει<br />
να χρησιμοποιείται έως και σήμερα. Στην ουσία η τεχνική αφορούσε την<br />
συλλογή κυττάρων από τον τράχηλο της μήτρας, την επίστρωσή τους<br />
σε αντικειμενοφόρο πλάκα, την μονιμοποίηση του με υγρό ή σπρέι για να<br />
αποφευχθεί η εκφύλισή τους, ύστερα την εφαρμογή ειδικής χρώσης κατά<br />
Παπανικολάου ώστε να μπορούν να διακριθούν τα κύτταρα και οι πυρήνες<br />
τους κάτω από το μικροσκόπιο. Στην συνέχεια τα επιχρίσματα αυτά<br />
εξετάζονται από εκπαιδευμένο προσωπικό, αναζητώντας τυχόν μη<br />
φυσιολογικά κύτταρα ανάμεσα σε χιλιάδες κύτταρα που περιέχει το κάθε<br />
επίχρισμα. Τότε η μέθοδος δεν αξιολογήθηκε ποτέ σε ελεγχόμενες<br />
διερευνητικές μελέτες, όμως τα αποτελέσματα που ακολούθησαν την<br />
εφαρμογή της την συνέδεσαν απόλυτα με την πρόληψη του καρκίνου της<br />
μήτρας 1 .<br />
Έως τώρα υπήρχε ελάχιστη κατανόηση των περιορισμών της<br />
μεθόδου, όμως τώρα οι επιστήμονες γνωρίζουν ότι η μέθοδος της<br />
συμβατικής κυτταρολογίας στερείται ευαισθησίας, ειδικότητας, αξιοπιστίας και<br />
επαναληψιμότητας 2 . Οι αναλύσεις σχετικών ερευνών έχουν δείξει<br />
συστηματικά ότι στις μισές στον αριθμό γυναίκες που φέρουν ενδοεπιθηλιακή<br />
αλλοίωση, η εξέταση του συμβατικού κολποτραχηλικού επιχρίσματός τους θα<br />
δείξει τουλάχιστον μια φορά ψευδο-αρνητικό αποτελέσματα 3-5 Η<br />
. Η επιτυχία του<br />
πρωτοβάθμιου ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων οφείλεται στον<br />
1
τακτικό ανά διαστήματα επανέλεγχο των γυναικών, πράγμα που<br />
αντισταθμίζει την χαμηλή ευαισθησία που έχει το συμβατικό τεστ<br />
Παπανικολάου. Τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα ήταν πάντα θέμα όσον<br />
αφορά τα επιχρίσματα γυναικολογικής κυτταρολογίας. Μια ακριβής μέθοδος<br />
«απαιτεί», αν υπάρχουν μη φυσιολογικά κύτταρα, αυτά να συλλεχθούν και να<br />
μεταφερθούν από τον τράχηλο της μήτρας στην αντικειμενοφόρο πλάκα<br />
ώστε στην συνέχεια να αξιολογηθούν στο μικροσκόπιο. Διάφορες έρευνες<br />
έχουν αναλύσει τα ποσοστά ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων της<br />
συμβατικής μεθόδου, άλλα δείχνουν χαμηλά ποσοστά και άλλα υψηλά<br />
ποσοστά, πιθανώς η αλήθεια να βρίσκεται κάπου ενδιάμεσα. Βάση<br />
μεταναλύσεων θεωρείται ότι διεθνώς τα ποσοστά ψευδο-αρνητικών<br />
αποτελεσμάτων απαντούν στο 50% των περιπτώσεων 6 . Οι πιθανοί λόγοι<br />
ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων φαίνονται στον πίνακα 1.1.<br />
Το παρασκεύασμα στερείται άτυπων κυττάρων (ανακριβής δειγματοληψία),<br />
αυτό απαντά στο 60-70% των περιπτώσεων.<br />
Το επίχρισμα φέρει άτυπα κύτταρα αλλά δεν μπορούν να προσδιοριστούν<br />
λόγω κακής μονιμοποίησης και/ή επικάλυψης από βλέννη, αίμα ή άλλων<br />
κυττάρων.<br />
Το επίχρισμα φέρει άτυπα κύτταρα αλλά δεν μπορούν να διαγνωστούν από<br />
τους εξεταστές (σφάλμα ελέγχου).<br />
Το επίχρισμα φέρει άτυπα κύτταρα τα οποία εντοπίζονται από τους<br />
εξεταστές αλλά δεν ερμηνεύονται σωστά.<br />
Πίνακας 1.1 Πιθανές αιτίες ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων στα συμβατικά<br />
κολποτραχηλικά επιχρίσματα.<br />
Η βελτίωση της ευαισθησίας και της ειδικότητας του συμβατικού<br />
προσυμπτωματικού ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έπρεπε να<br />
αρχίσει από την βελτίωση στην τεχνική συλλογής δείγματος ώστε να<br />
παρασκευάζονται καλύτερης ποιότητας δείγματα, καλύτερα<br />
παρασκευάσματα για πιο εύκολη και γρήγορη μικροσκοπική αξιολόγηση, τα<br />
οποία και θα παρέχουν την δυνατότητα εφαρμογής επιπλέον εξετάσεων.<br />
Προτάθηκε ότι οι περιορισμοί των συμβατικών επιχρισμάτων θα μπορούσαν<br />
να αντιμετωπιστούν με την χρήση της τεχνολογίας υγρής φάσης, ενώ τα<br />
σφάλματα κατά την εξέτασή τους θα μπορούσαν να αντιμετωπιστούν με την<br />
χρήση υπολογιστικών αυτοματοποιημένων συσκευών ελέγχου.<br />
2
1.1 Τι είναι η τεχνολογία της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης;<br />
Ενώ τις δεκαετίες του ’70 και ’80 η αυτοματοποίηση στην ανάλυση<br />
των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έκανε την εμφάνισή του στις ΗΠΑ κα<br />
στην Ευρώπη και ενώ διεξαγόντουσαν πολλά προγράμματα για την<br />
χρηματοδότηση και την ανάπτυξή τους, έγινε ξεκάθαρο ότι εάν έπρεπε να<br />
χρησιμοποιηθούν αυτές οι μηχανές, παράλληλα τα κυτταρολογικά<br />
παρασκευάσματα έπρεπε να πληρούν ορισμένα κριτήρια (πίνακας 1.2). Η<br />
διαπίστωση αυτή οδήγησε στην ανάπτυξη τεχνικών μεμονωμένων κυττάρων<br />
και στον διαχωρισμό των κυττάρων και καθαρισμού του υποστρώματος, που<br />
αποτελούσαν τα βασικά βήματα της υγρής κυτταρολογία * . Ο ιδανικός σκοπός<br />
της τεχνικής μεμονωμένων κυττάρων (μονοδιασπορά) είναι η παραγωγή<br />
μεμονωμένων κυττάρων σε μια οπτική στοιβάδα (μονοστιβάδα),<br />
αποφεύγοντας έτσι τον σχηματισμό κυτταρικών συστάδων.<br />
Προϋποθέσεις Τεχνικές λύσεις<br />
Τα κύτταρα να παρουσιάζονται μεμονωμένα<br />
Τα κύτταρα να παρουσιάζονται σε ένα οπτικό<br />
επίπεδο (μονοστιβάδα)<br />
Να υπάρχει υψηλή αντίθεση μεταξύ πυρήνα,<br />
κυτταροπλάσματος και υποστρώματος<br />
Το παρασκεύασμα να παρουσιάζει καθαρό<br />
υπόστρωμα<br />
Διαχωρισμός μεμονωμένων<br />
κυττάρων (μονοδιασπορά)<br />
Διαχωρισμός κυττάρων και<br />
καθαρό υπόστρωμα<br />
Πίνακας 1.2 Προϋποθέσεις κυτταρολογικών παρασκευασμάτων για να χρησιμοποιηθούν<br />
στην αυτοματοποίηση.<br />
Ενώ ο όρος «μονοδιασπορά διαχωρισμένων κυττάρων»<br />
επικεντρώνεται στην τοποθέτηση μεμονωμένων κυττάρων στο επίχρισμα, η<br />
έκφραση «παρασκευάσματα μονοστιβάδωσης» τονίζει το γεγονός ότι τα<br />
κύτταρα βρίσκονται σε ένα επίπεδο. Ωστόσο η τεχνολογία της<br />
Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης δεν πληροί ακόμα αυτά τα κριτήρια: τα<br />
κύτταρα στα παρασκευάσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης έχουν, θα έλεγε<br />
κανείς, μια πιο τρισδιάστατη δομή συγκρίνοντας με την συμβατική<br />
κυτταρολογία, γεγονός που απαιτεί από τον εξεταστή να επανεστιάζει<br />
συνεχώς κατά την ανάλυση του επιχρίσματος. Επομένως είναι συνεπές να<br />
* Συνώνυμα της «υγρής κυτταρολογίας» είναι «κυτταρολογία λεπτής επίστρωσης,<br />
μονοστρωματική κυτταρολογία, κυτταρολογία υγρής φάσης».<br />
3
αντικατασταθεί ο όρος «κυτταρολογία μονοστιβάδας» με τον όρο<br />
«κυτταρολογία λεπτής επίστρωσης ή υγρής φάσης».<br />
Η ΚΥΦ αποτέλεσε το υπόβαθρο για την ανάπτυξη<br />
αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων<br />
καθώς εκπληρούσαι όλα τα κριτήρια ώστε τα συστήματα αυτά να<br />
χρησιμοποιηθούν στα κυτταρολογικά εργαστήρια. Όμως η απόδοση της ΚΥΦ<br />
ήταν τόσο καλή σε κλινικές δοκιμές έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας,<br />
που βρήκε μια θέση στην αγορά ανεξάρτητα από τα συστήματα<br />
αυτοματοποίησης. Αν και υπάρχουν εξαιρέσεις 7 , η πλειοψηφία των ερευνών<br />
με ομότιμη αναθεώρηση, έδειξαν αυξημένα ποσοστά ανίχνευσης<br />
αλλοιώσεων χαμηλού βαθμού (LSIL) ή υψηλού βαθμού (HSIL) με την χρήση<br />
της ΚΥΦ 8 . Ενώ ο διάλογος περί αυξημένης ανίχνευσης νόσου με την μέθοδο<br />
ΚΥΦ συνεχίζεται μέχρι και σήμερα, παρόλα αυτά η ΚΥΦ προσφέρει<br />
αδιάσειστα πλεονεκτήματα έναντι της συμβατικής μεθόδου: όπως η<br />
δυνατότητα να προετοιμαστούν διπλές διαφάνειες ακόμα και<br />
παρασκευάσματα κύβων παραφίνης από το υπολειπόμενο δείγμα, η επιλογή<br />
να αφαιρεθεί μια μικρή ποσότητα από το διάλυμα για την εκτέλεση<br />
συμπληρωματικών εξετάσεων ή μοριακών εξετάσεων όπως ανίχνευση HPV,<br />
χλαμύδια, γονόρροια, αλλά και άλλους μοριακούς δείκτες ανίχνευσης<br />
νεοπλασμάτων, δυνατότητα χρήσης αυτοματοποιημένων συστημάτων<br />
ελέγχου, καθώς το υπόστρωμα των επιχρισμάτων εμφανίζεται καθαρό, και η<br />
παραγωγή παρασκευασμάτων με μια λεπτή στρώση κυττάρων,<br />
χαρακτηριστικό που βοηθάει πολύ τους κυτταροτεχνολόγους και<br />
κυτταροπαθολόγους στον έλεγχο τον επιχρισμάτων, σε αντίθεση με τα<br />
συμβατικά παρασκευάσματα.<br />
1.2 Συστήματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης<br />
Αρχές της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης (ΚΥΦ) για την προετοιμασία των<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων<br />
Ένα δείγμα κυττάρων συλλέγεται από τον τράχηλο με τον κανονικό τρόπο<br />
χρησιμοποιώντας μια σπάτουλα ή ψήκτρα ως συσκευή δειγματοληψίας<br />
Το δείγμα μεταφέρεται σε ένα υγρό με συντηρητικό μέσο μεταφοράς<br />
Τα κύτταρα διασκορπίζονται στο υγρό<br />
Ένα υποπολλαπλάσιο του διαθέσιμου υλικού επιλέγεται για την επεξεργασία<br />
Τα κύτταρα χωρίζονται με φυγοκέντρηση ή φιλτράρισμα και κατατίθενται σε μια<br />
αντικειμενοφόρο πλάκα ως λεπτό στρώμα μιας στιβάδας κυττάρων με<br />
ιζηματοποίηση ή εφαρμογή πίεσης<br />
Τα επιχρίσματα βάφονται επικαλύπτονται και ετοιμάζονται για τν μικροσκόπηση<br />
4
Ένα σημαντικό ορόσημα στην ιστορία του τεστ Παπανικολάου<br />
αποτέλεσε το 1996 όταν ο αμερικανικός Οργανισμός Τροφίμων και<br />
Φαρμάκων (US Food and Drug Administration, FDA) ενέκρινε το ThinPrep<br />
Pap test (Hologic, Marlborough, Mass.) ως μια εναλλακτική μέθοδος για τον<br />
έλεγχο των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τρία χρόνια μετά ακολούθησε η<br />
έγκριση από τον FDA της μεθόδου SurePath Pap Test (τότε γνωστή ως<br />
AutoCyte Prep; BD TriPath, Burlington, NC). Η τελευταία τεχνολογία ΚΥΦ<br />
που εγκρίθηκε από τον FDA ήταν η MonoPrep (MonoGen, Inc. Lincolnshire,<br />
IL) το 2006. Τα συστήματα που χρησιμοποιούνται ευρέως και για τα οποία<br />
έχουν διεξαχθεί όλες σχεδόν οι έρευνες για την αξιολόγηση της τεχνολογίας<br />
ΚΥΦ, είναι το σύστημα ThinPrep και το σύστημα SurePath. Η διαδικασία<br />
συλλογής του δείγματος παραμένει ίδια. Η συσκευή που χρησιμοποιείται για<br />
την δειγματοληψία είτε ξεπλένεται μέσα σε υγρό μέσο μονιμοποίησης και<br />
συντήρησης (ThinPrep), είτε η αποσπώμενη κεφαλή της συσκευής<br />
τοποθετείται μέσα στο υγρό (SurePath). Τα υγρά είναι ρυθμιστικά διαλύματα<br />
κυττάρων με βάση την αλκοόλη καθώς ο ρόλος τους είναι να αποτελούν μέσο<br />
μεταφοράς των κυττάρων (συντηρητικό μέσο) και να μονιμοποιούν τα<br />
κύτταρα (μέσο μονιμοποίησης).<br />
Στόχος της κυτταρολογίας υγρής φάσης είναι:<br />
η συλλογή ολόκληρου του αποφολιδωτικού υλικού για κυτταρολογική<br />
εξέταση<br />
να συμπεριλαμβάνει μέθοδο αξιολόγησης κυτταροβρίθειας ως μέτρο<br />
διασφάλισης ποιότητας<br />
να βελτιστοποιήσει την οπτική μορφολογική εξέταση μέσω της<br />
βελτιωμένης παρουσίασης του κυτταρικού υλικού<br />
να πληροί τα κριτήρια ώστε να είναι δυνατή η εφαρμογή της<br />
αυτοματοποίησης στον πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών<br />
επιχρισμάτων<br />
να αποθηκεύει προσωρινά το κυτταρικό υλικό για περεταίρω μορφολογική<br />
και μη-μορφολογική εξέταση<br />
να «προσφέρει» στους τεχνολόγους και παθολόγους μια ασφαλέστερη<br />
και λιγότερο κουραστική εργασία, όσον αφορά την εξάλειψη στοιχείων του<br />
επιχρίσματος που κάνουν την διάγνωση πιο δύσκολη (π.χ. φλεγμονώδη<br />
κύτταρα, βλέννα, αίμα, ινώδες).<br />
1.3 Εφαρμογή της κυτταρολογίας υγρής φάσης και στην μηγυναικολογική<br />
κυτταρολογία<br />
Η κυτταρολογία υγρής φάσης έχει βρει μια σπουδαία θέση ως<br />
διαγνωστική μέθοδος στην γυναικολογική κυτταρολογία αντικαθιστώντας σε<br />
πολλές χώρες του πλανήτη το συμβατικό τεστ Παπανικολάου. Ωστόσο η<br />
5
χρήση της στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία, αν και έχει εξαπλωθεί<br />
αρκετά, φέρει πολλές διφορούμενες απόψεις.<br />
Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία μηγυναικολογικών<br />
δειγμάτων με την μέθοδο ΚΥΦ είναι η ThinPrep και η<br />
SurePath, με την ThinPrep να έχει επικρατήσει κατά πολύ της άλλης<br />
τεχνολογίας. Η ThinPrep έχει εγκριθεί το 1991 από το FDA για την χρήσης<br />
της στα μη-γυναικολογικά δείγματα: για δείγματα που προέρχονται είτε από<br />
εκπλύσεις οργάνων, είτε από υγρά του σώματος, είτε από αναρρόφηση μέσω<br />
λεπτής βελόνης κ. ά. Η τεχνολογία αυτή βρέθηκε να είναι ισοδύναμη με τις<br />
άλλες ήδη υπάρχουσες τεχνολογίες (Cytospin, Millipore), οι οποίες<br />
χρησιμοποιούνταν ευρέως για την επεξεργασία δειγμάτων μη-γυναικολογικής<br />
κυτταρολογίας. Για αυτόν τον λόγο δεν απαιτήθηκαν και δεν διενεργήθηκαν<br />
έρευνες που να αξιολογήσουν και να επικυρώσουν την αποτελεσματικότητα<br />
της μεθόδου πριν την υιοθέτησή της από τα εργαστήρια. Αντιθέτως από ότι<br />
έγινε στην γυναικολογική κυτταρολογία που ο πήχης ήταν υψηλότερα εξαιτίας<br />
της δημοσίευσης δύο άρθρων στο Wall Street Journal, που είχαν μεγάλη<br />
απήχηση από το κοινό, και τα οποία αποκάλυπταν ανησυχητικά ζητήματα<br />
σχετικά με την γυναικολογική κυτταρολογία 9 , με αποτέλεσμα να διενεργηθούν<br />
μια πληθώρα ερευνών πριν την έγκριση της μεθόδου από τον FDA για την<br />
εισαγωγή της στην γυναικολογική κυτταρολογία.<br />
Τα τελευταία 10 χρόνια η ΚΥΦ έχει χρησιμοποιηθεί όλο και<br />
περισσότερο για την επεξεργασία ποικίλων δειγμάτων στην μη-γυναικολογική<br />
κυτταρολογία. Σε μερικά ιδρύματα η ΚΥΦ έχει συνδυαστεί με άλλες τεχνικές<br />
παρασκευάσματος όπως οι κύβοι παραφίνης, και σε άλλα ιδρύματα, αν και<br />
δεν είναι πολλά, η ΚΥΦ αποτελεί την μόνη διαγνωστική μέθοδο. Από<br />
διάφορες έρευνες και ανακοινώσεις σε επιστημονικά συνέδρια 9 έχει γίνει<br />
ξεκάθαρο ότι οι γνώμες διίστανται όσον αφορά την χρήση της ΚΥΦ έναντι της<br />
συμβατικής μεθόδου στα κυτταρολογικά δείγματα, με θερμούς υποστηρικτές<br />
και των δύο πλευρών. Η επιλογή της τεχνικής που θα εφαρμόσει το<br />
κυτταρολογικό εργαστήριο επηρεάζει τόσο τον πρακτικό χειρισμό του<br />
δείγματος από την πρώτη στιγμή που συλλέγεται, έως την επεξεργασία του<br />
στο εργαστήριο και την μικροσκοπική εξέταση του, όσο και την διαγνωστική<br />
μεθοδολογία που θα ακολουθείται για την εξέταση του προκύπτοντος<br />
επιχρίσματος. Τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η ΚΥΦ στην μηγυναικολογική<br />
κυτταρολογία είναι ίδια με αυτά που περιγράφτηκαν πιο πάνω<br />
και αφορούσαν τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα, δηλαδή η καλή<br />
μονιμοποίηση και διατήρηση των κυττάρων, η απουσία αίματος, η<br />
δυνατότητα παρασκευής πολλαπλών δειγμάτων από το ίδιο δείγμα, και<br />
επίσης το γεγονός ότι δεν απαιτείται ο κυτταροτεχνολόγος ή<br />
κυτταροπαθολόγων να εξασκηθεί στην τεχνική επίστρωσης. Οι υποστηρικτές<br />
της ΚΥΦ διαφωνούν με τις απόψεις της άλλης ομάδας ότι δεν υπάρχουν<br />
αρκετά δημοσιευμένα στοιχεία που να δηλώνουν την υπεροχής της ΚΥΦ<br />
έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας. Από την άλλη, οι υποστηρικτές της<br />
συμβατικής κυτταρολογίας δηλώνουν ότι μερικά σημαντικά χαρακτηριστικά<br />
που χρησιμοποιούνταν ανέκαθεν για την αξιολόγηση καλοηθών και<br />
κακοηθών ευρημάτων έχουν μειωθεί αρκετά ή δεν είναι διαθέσιμα για να<br />
αξιολογηθούν σε επιχρίσματα ΚΥΦ, διακυβεύοντας έτσι την διαγνωστική<br />
ακρίβεια 10-12 . Αν και η ΚΥΦ φέρει τεράστιες δυνατότητες και πλεονεκτήματα<br />
6
στην επεξεργασία μη-γυναικολογικών δειγμάτων, η θέσπιση διαγνωστικών<br />
μορφολογικών κριτηρίων αποτελεί σημαντικό στοιχείο για την πλήρη<br />
αποδοχή του.<br />
«Η επιστήμη της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης βρίσκεται ακόμα σε<br />
πρώιμο στάδιο. Στοιχηματίζω ότι ο Γεώργιος Παπανικολάου θα ήταν ο<br />
μεγαλύτερος υποστηρικτής του.»<br />
(Leiman 2007) 13<br />
7
22 ΤΤΕΕΧΧΝΝΙΙΚΚΗΗ ΤΤΗΗΣΣ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ<br />
ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ<br />
2.1 Παρασκευή γυναικολογικών δειγμάτων<br />
Η λήψη γυναικολογικών δειγμάτων γίνεται με σκοπό την ανίχνευση<br />
καρκινικών και προκαρκινικών αλλοιώσεων καθώς και άλλων βλαβών στον<br />
τράχηλο της μήτρας. Ο τρόπος δειγματοληψίας και επεξεργασίας δείγματος<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης, όπως παρουσιάζεται παρακάτω, περιγράφεται<br />
στο εγχειρίδιο «Εγκεκριμένες Κατευθυντήριες Γραμμές της Τεχνικής<br />
Παπανικολάου, 2η έκδοση» * . Γενικά οι κατευθυντήριες γραμμές αναφέρουν<br />
ότι το δείγμα που λαμβάνεται δεν πρέπει να περιέχει αίμα, βλέννη,<br />
φλεγμονώδεις εκκρίσεις ή λιπαντική ουσία.<br />
2.1.1 Συσκευές δειγματοληψίας<br />
Για την κυτταρολογική εξέταση του τραχήλου της μήτρας απαιτείται<br />
δείγμα από τον εξωτράχηλο και τον ενδοτράχηλο, το οποίο λαμβάνεται με τις<br />
απαραίτητες συσκευές. Παραδοσιακά, η λήψη δειγμάτων για την παρασκευή<br />
επιχρισμάτων Παπανικολάου γινόταν με μια ξύλινη σπάτουλα, γνωστή ως<br />
σπάτουλα Ayre. Στην συνέχεια υιοθετήθηκε η μέθοδος συνδυασμού<br />
σπάτουλας Ayre, για την λήψη κυτταρολογικού υλικού από τον εξωτράχηλο,<br />
και κωνικής βούρτσας, για την λήψη κυτταρολογικού υλικού από τον<br />
ενδοτράχηλο (εικόνα 2.1 Α). Μια παραλλαγή της σπάτουλας Ayre είναι η<br />
σπάτουλα Aylesby της οποίας το ένα άκρο προεξέχει πιο πολύ και<br />
σχηματίζει ελαφρώς μια γωνία με τον κεντρικό άξονα της σπάτουλας. Η<br />
* Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων, Έγγραφο GP15-A2 (CLSI Document<br />
GP15-A2). «Papanicolaou Technique Approved Guidelines - 2 nd edition».<br />
8
καμπύλη που σχηματίζεται μεταξύ των δύο άκρων της είναι πιο μεγάλη σε<br />
σχέση με την σπάτουλα Ayre. Την τελευταία δεκαετία κυκλοφόρησε στην<br />
αγορά μια συσκευή η οποία συνδυάζει την χρήση της σπάτουλας και της<br />
βούρτσας για την λήψη ενδοτραχηλικού και εξωτραχηλικού κυτταρολογικού<br />
υλικού. Η Cervex brush (εικόνα 2.1 Β), όπως ονομάζεται, είναι μια συσκευή<br />
που μοιάζει με σκούπα της οποίας οι κεντρικές τρίχες είναι πιο μακριές, ώστε<br />
να εισέρχονται στην ενδοτραχηλική κοιλότητα, ενώ παράλληλα οι ακριανές<br />
τρίχες είναι πιο κοντές κατάλληλα σχεδιασμένες ώστε να εφάπτονται στην<br />
εξωτραχηλική επιφάνεια (ζώνη μετάπτωσης)(εικόνα 2.2). Η συσκευή αυτή<br />
συστήνεται για την λήψη δειγμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης, κατάλληλος<br />
όμως θεωρείται επίσης και ο κλασικός τρόπος συνδυασμού πλαστικής<br />
σπάτουλας και βούρτσας 14 . Για το σύστημα SurePath χρησιμοποιείται μόνο<br />
συσκευή Cervex broom με αποσπώμενη κεφαλή. Αυτό που πρέπει να<br />
τονιστεί είναι ότι η δειγματοληψία για κυτταρολογία υγρής φάσης πρέπει να<br />
γίνεται πάντα με πλαστικές συσκευές καθώς θεωρείται ότι η ξύλινη<br />
σπάτουλα μειώνει την ευαισθησία της ΚΥΦ λόγω των απορροφητικών<br />
ιδιοτήτων του ξύλου 15 .<br />
2.1.2 Λήψη δειγμάτων<br />
Εικόνα 2.1 Α) σπάτουλα Ayre και<br />
βουρτσάκι Β) Cervex broom<br />
Ο τρόπος δειγματοληψίας στην κυτταρολογία υγρής φάσης δεν<br />
διαφέρει γενικά από αυτόν που χρησιμοποιείται για την προετοιμασία<br />
συμβατικών επιχρισμάτων 16 . Με την βοήθεια του κολποδιαστολέα ανοίγονται<br />
τα τοιχώματα του κόλπου τόσο ώστε να υπάρχει μια πλήρης εικόνα του<br />
τραχήλου της μήτρας. Ο γυναικολόγος πριν προβεί στην λήψη του δείγματος<br />
παρατηρεί με γυμνό μάτι τον τράχηλο για την παρουσία ορατών αλλοιώσεων<br />
9
Εικόνα 2.2 Οι μακριές κεντρικές τρίχες της «σκούπας» εισέρχονται στην ενδοτραχηλική<br />
κοιλότητα και οι κοντές τρίχες εφάπτονται πλήρως στην εξωτραχηλική επιφάνεια. Κατά την<br />
περιστροφή της συλλέγονται ταυτόχρονα κύτταρα κυλινδρικού και πλακώδους επιθηλίου<br />
ή βλάβες ελκωτικής μορφής που μπορεί να υποδεικνύουν διηθητικό καρκίνο<br />
του τραχήλου. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να ληφθεί δείγμα από την<br />
αλλοίωση και να γίνει κυτταρολογική αξιολόγηση χωριστά από το τεστ Παπ.<br />
Ο τρόπος λήψης του δείγματος για τεστ Παπ εξαρτάται από την συσκευή που<br />
χρησιμοποιείται. Αναλυτικά:<br />
Σε περίπτωση που χρησιμοποιείται η συσκευή Cervex brush<br />
ενδοτραχηλικά και εξωτραχηλικά κύτταρα λαμβάνονται συγχρόνως<br />
καθώς οι μακριές κεντρικές τρίχες της σκούπας εισέρχονται στην<br />
ενδοτραχηλική κοιλότητα τόσο ώστε οι κοντές τρίχες να εφάπτονται<br />
πλήρως στην εξωτραχηλική επιφάνεια. Οι κοντές τρίχες στις άκρες<br />
τους είναι σχηματισμένες με τέτοιο τρόπο ώστε να συλλέγουν υλικό<br />
μόνο κατά την δεξιόστροφη περιστροφή της συσκευής. Η σκούπα<br />
περιστρέφεται πέντε φορές κατά 360 ο συλλέγοντας συγχρόνως<br />
κύτταρα από τον ενδοτράχηλο (μονόστιβο κυλινδρικό επιθήλιο) και<br />
από τον εξωτράχηλο (πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο) εκεί που<br />
βρίσκεται η ζώνη μετάπτωσης η οποία έχει ιδιαίτερη σημασία διότι<br />
από αυτήν κατά κανόνα εξορμώνται οι αλλοιώσεις της κακοήθους<br />
εξαλλαγής του τραχηλικού επιθηλίου.<br />
Όταν χρησιμοποιείται ο συνδυασμός σπάτουλας και ενδοτραχηλικής<br />
βούρτσας το πρώτο βήμα είναι να τοποθετηθεί η σπάτουλα σταθερά<br />
στον εξωτράχηλο με την μακριά προεξοχή να εισέρχεται ελάχιστα στην<br />
ενδοτραχηλική κοιλότητα. Στην συνέχεια η σπάτουλα περιστρέφεται<br />
κατά 360 ο με δεξιόστροφη φορά και αφαιρείται. Κατά την λήψη ο<br />
γυναικολόγος πρέπει να είναι πολύ προσεκτικός καθώς ενώ<br />
περιστρέφεται η σπάτουλα είναι εύκολο να χαθεί η επαφή της με την<br />
επιφάνεια του τραχήλου ανά τμήματα, αυτό μπορεί να αποφευχθεί<br />
παρατηρώντας συνέχεια τον τράχηλο κατά την λήψη. Ύστερα<br />
10
λαμβάνεται δείγμα από την ενδοτραχηλική κοιλότητα<br />
χρησιμοποιώντας την ειδική κωνική βούρτσα η οποία εισάγεται στην<br />
ενδοτραχηλική κοιλότητα κατά τα 2/3 και περιστρέφεται δεξιόστροφα<br />
κατά 90-180 ο . Με αυτή την περιστροφή λαμβάνεται επαρκές δείγμα και<br />
γενικά δεν προκαλεί αιμορραγία.<br />
Από τις πολυάριθμες έρευνες που συγκρίνουν τα συμβατικά<br />
παρασκευάσματα με τα παρασκευάσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης και<br />
από την σχετική βιβλιογραφία είναι φανερό ότι οι συσκευές δειγματοληψίας<br />
αποτελούν ένα σημαντικό κομμάτι της διαδικασία παρασκευής επιχρισμάτων.<br />
Μια μετανάλυση των Martin-Hirsch and colleagues 15 κατέληξε στο<br />
συμπέρασμα ότι η ευρέως μέχρι τότε χρησιμοποιημένη Ayre σπάτουλα είναι<br />
η λιγότερο αποτελεσματική συσκευή δειγματοληψίας τραχηλικού δείγματος<br />
και πρέπει να αντικατασταθεί από την Aylesby σπάτουλα (με επεκταμένο<br />
άκρο). Από την μετανάλυση προέκυψε ότι η Aylesby σπάτουλα σε σύγκριση<br />
με την Ayre σπάτουλα είχε καλύτερη επίδοση όσον αφορά την συλλογή<br />
ενδοτραχηλικού δείγματος, σχετίστηκε με υψηλότερα ποσοστά ανίχνευσης<br />
δυσκαρύωσης και λιγότερο αριθμό μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων. Στα<br />
περισσότερα μέρη του Ηνωμένου Βασιλείου η σπάτουλα Ayre έχει<br />
αντικατασταθεί με την Aylesby. Το μεγαλύτερο ποσοστό των πρόσφατων<br />
ερευνών που έχουν διεξαχθεί χρησιμοποίησαν για συσκευή δειγματοληψίας<br />
την Cervex brush, ελάχιστες ήταν αυτές που χρησιμοποίησαν την σπάτουλα<br />
Ayre.<br />
Από ‘δω και πέρα η επεξεργασία του δείγματος διαφέρει ριζικά από<br />
αυτήν της συμβατικής μεθόδου. Στην συμβατική κυτταρολογία το δείγμα<br />
επιστρώνεται σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα και στην συνέχεια μονιμοποιείται<br />
με ειδικό σπρέι, στην κυτταρολογία υγρής φάσης η συσκευή δειγματοληψίας<br />
μεταφέρεται σε ένα φιαλίδιο με υγρό μέσο συντήρησης και μεταφοράς το<br />
οποίο στην συνέχεια αποστέλλεται στο εργαστήριο για την παρασκευή<br />
επιχρισμάτων.<br />
2.1.3 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς<br />
Εικόνα 2.3 Φιαλίδιο<br />
με διάλυμα<br />
PreservCyt®<br />
Στο σύστημα ThinPrep το διάλυμα συντήρησης<br />
που χρησιμοποιείται είναι το PreservCyt® (Hologic Inc,<br />
πρώην Cytyc). Το PreservCyt (εικόνα 2.3) είναι ένα<br />
ρυθμιστικό διάλυμα με βάση την μεθανόλη σχεδιασμένο να<br />
συντηρεί τα κύτταρα κατά την μεταφορά και την<br />
προετοιμασία των παρασκευασμάτων και έχει αιμολυτικές<br />
και βλεννολυτικές ιδιότητες. Τα φιαλίδια περιέχουν 20ml<br />
συντηρητικού υγρού του οποίου η σύσταση είναι<br />
κατοχυρωμένη άρα και άγνωστη. Τα φιαλίδια<br />
αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30 ο C μέχρι την<br />
ημερομηνία λήξεως που αναγράφεται πάνω στο φιαλίδιο.<br />
11
Όταν το υγρό περιέχει κυτταρολογικό υλικό που προορίζεται για ThinPrep<br />
Pap τεστ, τα φιαλίδια αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30 ο C για έξι<br />
εβδομάδες. Αν το κυτταρολογικό υλικό πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την<br />
ανίχνευση των Chlamydia trachomatis και Neisseria gonorrhea με την<br />
μέθοδο Roche Diagnostics COBAS AMPLICOR CT/NG, τότε τα φιαλίδια<br />
αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 4-25 ο C για έξι εβδομάδες 17 .<br />
Στο σύστημα SurePath χρησιμοποιείται το SurePath® Preservative<br />
Fluid (TriPath, BD Diagnostics) (εικόνα 2.4). Το διάλυμα αυτό είναι επίσης<br />
ένα ρυθμιστικό διάλυμα με βάση την αιθανόλη που<br />
χρησιμεύει ως αντιβακτηριδιακό μέσο μεταφοράς και<br />
συντήρησης γυναικολογικών δειγμάτων. Τα φιαλίδια<br />
αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30 ο C μέχρι την<br />
ημερομηνία λήξεως που αναγράφεται πάνω στην<br />
συσκευασία. Όταν το υγρό περιέχει κυτταρολογικό υλικό<br />
τότε τα φιαλίδια διατηρούνται για έξι μήνες σε<br />
θερμοκρασίες 2-10 ο C ή για τέσσερις εβδομάδες σε<br />
θερμοκρασίες 15-30 ο C. Αν το κυτταρολογικό υλικό<br />
πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των<br />
Εικόνα 2.4 Φιαλίδιο<br />
με συντηρητικό<br />
διάλυμα SurePath®<br />
2.1.4 Προετοιμασία δειγμάτων<br />
Chlamydia trachomatis με την μέθοδο BD ProbeTex CT<br />
Q x και Neisseria gonorrhea με την μέθοδο GC Q x Amplified<br />
DNA Assays, τότε τα δείγματα αποθηκεύονται σε<br />
θερμοκρασίες 2-30 ο C για περίπου 30 ημέρες 18 .<br />
Εικόνα 2.5 Α) Η σκούπα ξεπλένεται καλά μέσα στο φιαλίδιο ThinPrep<br />
ώστε να αποχωριστεί όλο το κυτταρολογικό υλικό. Β) Η αποσπώμενη<br />
κεφαλή τοποθετείται στο φιαλίδιο SurePath<br />
12
Η περαιτέρω επεξεργασία του δείγματος είναι ανάλογη με το<br />
σύστημα κυτταρολογίας υγρής φάσης που χρησιμοποιεί το κάθε εργαστήριο.<br />
Για το σύστημα ThinPrep, αμέσως μετά την λήψη η σκούπα (ή η<br />
σπάτουλα/βουρτσάκι) μεταφέρεται γρήγορα στο φιαλίδιο με το διάλυμα<br />
PreservCyt όπου πιέζεται δυνατά στον πάτο τόσο ώστε οι τρίχες της να<br />
λυγίσουν και να απελευθερωθεί όλη η ποσότητα του υλικού στο υγρό (εικόνα<br />
2.5 Α), αυτό γίνεται 15-20 φορές. Στην συνέχεια η σκούπα στροβιλίζεται<br />
απότομα μέσα στο φιαλίδιο για να απελευθερωθεί το υπόλοιπο υλικό. Πριν<br />
απορριφθεί η συσκευή δειγματοληψίας ελέγχεται πάντα για τυχόν<br />
υπολείμματα υλικού, εάν αυτά τα υπολείμματα υπάρχουν τότε<br />
επαναλαμβάνονται τα βήματα από την αρχή.<br />
Για το σύστημα SurePath, η αποσπώμενη κεφαλή της σκούπας<br />
ελευθερώνεται μέσα στο φιαλίδιο με το διάλυμα συντήρησης SurePath®<br />
Preservative Fluid (εικόνα 2.5 Β). Η κεφαλή της συσκευής δειγματοληψίας<br />
δεν αφαιρείται ποτέ από το φιαλίδιο, ούτε κατά την διάρκεια επεξεργασίας<br />
του δείγματος.<br />
Στην συνέχεια το φιαλίδιο, που πλέον περιέχει το δείγμα,<br />
σφραγίζεται καλά και αφού αναγραφούν τα στοιχεία του ασθενή<br />
αποστέλλεται στο εργαστήριο μαζί με το παραπεμπτικό μέσα σε ειδική<br />
πλαστική σακούλα 16 .<br />
2.1.5 Επεξεργασία δειγμάτων και παρασκευή επιχρισμάτων<br />
Μέχρι σήμερα έχουν εγκριθεί από τον Οργανισμό Διαχείρισης<br />
Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA) των<br />
Ηνωμένων Πολιτειών τρία συστήματα κατάλληλα για την προετοιμασία<br />
κολποτραχηλικού υλικού με την μέθοδο της ΚΥΦ: το ημιαυτόματο σύστημα<br />
ThinPrep 2000 Processor, το πιο ολοκληρωμένο αυτοματοποιημένο<br />
σύστημα ThinPrep 3000 Processor, κατασκευασμένα από την εταιρεία<br />
Hologic (MA, ΗΠΑ), και επιπλέον το σύστημα BD PrepStain Slide<br />
Processor κατασκευασμένο από την TriPath Imaging Inc. (NJ, USA).<br />
13
2.1.5.1 ThinPrep 2000 Processor (Hologic)<br />
Εικόνα 2.6 a) ThinPrep 2000 Processor.<br />
b) 1.δοχείο με υγρό μονιμοποίησης, 2.βάση τοποθέτησης πλακιδίου,<br />
3.εξάρτημα που περιστρέφει το φίλτρο, 4.φίλτρο TransCyt, 5.βάση<br />
φιαλιδίου.<br />
Η εικόνα 2.8 παρουσιάζει τα αυτοματοποιημένα βήματα της μεθόδου<br />
ThinPrep που πραγματοποιούνται στο ThinPrep 2000 Processor (εικόνα<br />
2.6). Στο εργαστήριο, το φιαλίδιο με το δείγμα τοποθετείται στο ThinPrep (TP)<br />
Processor μαζί με μια αντικειμενοφόρο πλάκα και ένα κυλινδρικό φίλτρο<br />
(TransCyt filter). Το ΤΡ2000 Processor τίθεται σε λειτουργία, τότε το φίλτρο<br />
εισέρχεται μηχανικά στο φιαλίδιο με το δείγμα και αρχίζει να περιστρέφεται [ή<br />
περιστρέφεται το φιαλίδιο (TP3000)], με αυτόν τον τρόπο δημιουργούνται<br />
ρεύματα μέσα στο υγρό τα οποία είναι μεν αρκετά δυνατά ώστε το<br />
κυτταρολογικό υλικό να διασκορπιστεί τυχαία και να διαχωριστούν αίμα,<br />
μύκητες και βλέννη αλλά παράλληλα και τόσο ήπια που να μην αλλοιωθεί η<br />
μορφολογική εικόνα των κυττάρων. Μετά την τυχαία διασκόρπιση των<br />
κυττάρων ακολουθεί το φιλτράρισμα. Το κάτω άκρο του κυλίνδρου<br />
καλύπτεται από ένα φίλτρο με πολύ μικρούς πόρους και στο άνω άκρο του<br />
υπάρχει σύστημα αναρρόφησης. Καθώς το υγρό αναρροφάται οι πόροι του<br />
φίλτρου είναι αρκετά μεγάλοι ώστε να επιτρέψουν στα ουδετερόφιλα και στα<br />
ερυθροκύτταρα να διαπεράσουν την μεμβράνη αλλά αρκετά μικροί για να μην<br />
την διαπεράσουν τα επιθηλιακά κύτταρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα<br />
επιθηλιακά κύτταρα να φράσουν τους πόρους του φίλτρου και όταν ο<br />
επεξεργαστής εντοπίσει ότι όλοι οι πόροι έχουν φραχτεί τότε σταματάει την<br />
διαδικασία του φιλτραρίσματος. Το κυλινδρικό φίλτρο αποσύρεται από το<br />
φιαλίδιο, περιστρέφεται μερικώς και απορρίπτει το υλικό που έχει φιλτράρει<br />
στο μπουκάλι των αποβλήτων, και στην συνέχεια περιστρέφεται προς τα<br />
14
πάνω ώστε το κάτω άκρο του να κοιτάει προς την αντικειμενοφόρο πλάκα.<br />
Τότε ασκείται ελαφριά πίεση αέρα στο φίλτρο για να πραγματοποιηθεί η<br />
μεταφορά των κυττάρων από το φίλτρο στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Λόγω<br />
των φυσικών ιδιοτήτων των κυττάρων και των φυσικών ηλεκτροχημικών<br />
ιδιοτήτων των ThinPrep αντικειμενοφόρων πλακών τα κύτταρα<br />
παρουσιάζουν μία τάση προσκόλλησης προς την αντικειμενοφόρο πλάκα και<br />
έτσι μια μονοεπίπεδη, λεπτή στοιβάδα κυττάρων κυκλικού σχήματος και<br />
διαμέτρου 20mm (εικόνα 2.7) μεταφέρεται στην αντικειμενοφόρο πλάκα.<br />
Μόλις ολοκληρωθεί η διαδικασία μεταφοράς των κυττάρων το φίλτρο<br />
επιστρέφει στην αρχική του θέση και η αντικειμενοφόρος πλάκα μεταφέρεται<br />
αυτόματα στο φιαλίδιο με το υγρό μονιμοποίησης. Ύστερα το πλακίδιο<br />
αφαιρείται από τον επεξεργαστή και είναι έτοιμο να εφαρμοστεί χρώση<br />
Παπανικολάου.<br />
Η παρασκευαστική<br />
διαδικασία με τον ΤΡ2000 διαρκεί<br />
περίπου 70sec/επίχρισμα 1 και<br />
μπορεί να παρασκευάσει ένα<br />
επίχρισμα την φορά. Το σύστημα<br />
ΤΡ3000 είναι ικανό να προετοιμάσει<br />
μια σειρά από 80 δείγματα<br />
ταυτόχρονα. Η εταιρεία Hologic<br />
επίσης έχει βγάλει το σύστημα<br />
ΤΡ5000 το οποίο έχει την<br />
δυνατότητα να παρασκευάσει είτε<br />
20 δείγματα γυναικολογικής ή μη<br />
γυναικολογικής κυτταρολογίας<br />
ταυτόχρονα είτε να παρασκευάσει<br />
από το ίδιο δείγμα μέχρι 10<br />
διαφορετικά επιχρίσματα 19 ,<br />
ανάλογα με τις διαγνωστικές ανάγκες.<br />
Εικόνα 2.7 ThinPrep παρασκεύασμα. Η<br />
λεπτή στιβάδα κυττάρων έχει κυκλικό σχήμα<br />
διαμέτρου 20 mm.<br />
Μόνο μια μικρή ποσότητα χρησιμοποιείται κάθε φορά για την<br />
παρασκευή επιχρίσματος. Το υπόλοιπο υλικό που έχει απομείνει στο<br />
φιαλίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για επιπλέον επιχρίσματα, για παρασκευή<br />
κύβων παραφίνης είτε για μοριακές διαγνωστικές εξετάσεις (π.χ. HPV,<br />
χλαμύδια, γονόρροια) για το οποίο και έχει εγκριθεί από τον FDA.<br />
15
Εικόνα 2.8 Αυτοματοποιημένα βήματα του ThinPrep 2000 Processor κατά την τεχνική<br />
ThinPrep.<br />
2.1.5.2 BD PrepStain Slide Processor (Becton Dickinson)<br />
Το σύστημα SurePath χρησιμοποιεί μια<br />
τεχνολογία διαχωρισμού του υλικού σύμφωνα με την<br />
διαβάθμιση της πυκνότητας. Στην αρχή το δείγμα<br />
αναμειγνύεται στο Vortex ώστε το κυτταρολογικό υλικό<br />
να διασκορπιστεί και να μην υπάρχουν συστάδες<br />
κυττάρων. Στην συνέχεια τα φιαλίδια μεταφέρονται στο<br />
BD PrepMate System (εικόνα 2.9) το οποίο είναι<br />
ένα αυτοματοποιημένο εξάρτημα του BD PrepStain<br />
Slide Processor (εικόνα 2.11), η χρήση του οποίου<br />
είναι προαιρετική, όπου το κυτταρολογικό υλικό<br />
αναμιγνύεται μέσα στο φιαλίδιο και το σύστημα<br />
μεταφέρει αυτόματα μια ποσότητα 2ml σε σωληνάρια<br />
φυγοκέντρησης. Το BD PrepMate System μπορεί<br />
να επεξεργαστεί μέχρι 12 δείγματα σε λιγότερο από<br />
4min. Στην συνέχεια τα δείγματα μεταφέρονται στην<br />
Εικόνα 2.9 BD<br />
PrepMate System<br />
φυγόκεντρο όπου τα κύτταρα διαχωρίζονται σύμφωνα με το ειδικό τους<br />
βάρος. Τα κοκκιοκύτταρα, ερυθροκύτταρα και βλέννη, που έχουν χαμηλότερο<br />
16
ειδικό βάρος από τα επιθηλιακά κύτταρα, αποτελούν το υπερκείμενο το<br />
οποίο και απορρίπτεται. Το ίζημα που δημιουργήθηκε φυγοκεντρείται,<br />
αναδεύεται στο Vortex και στην συνέχεια τα σωληνάρια τοποθετούνται στο<br />
BD PrepStain Slide Processor για την παρασκευή και χρώση των<br />
επιχρισμάτων. Μέσω αυτοματοποιημένου συστήματος παρασκευής και<br />
χρώσης επιχρισμάτων το BD PrepStain Slide Processor μεταφέρει το ίζημα<br />
από το σωληνάριο στον θάλαμο καθίζησης το οποίο είναι τοποθετημένο<br />
πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα (εικόνα 2.12). Στην συνέχεια, τα<br />
κύτταρα καθιζάνουν σε λεπτή στοιβάδα, το υπόλοιπο του υγρού<br />
απορρίπτεται και ακολουθεί η χρώση χρησιμοποιώντας μια παραλλαγή της<br />
μεθόδου Παπανικολάου.<br />
Η τελική εικόνα του<br />
επιχρίσματος είναι ένα κυκλικό σχήμα<br />
διαμέτρου 13mm που περιέχει κύτταρα<br />
σε μονοεπίπεδη στοιβάδα (εικόνα 2.10).<br />
Το BD PrepStain Slide Processor<br />
μπορεί να επεξεργαστεί 92 επιχρίσματα<br />
σε 60min χωρίς την διαδικασία της<br />
χρώσης, ή 48 επιχρίσματα σε 60min<br />
εφαρμόζοντας την χρώση 20 .<br />
Εικόνα 2.10 Παρασκεύασμα<br />
SurePath. Η διάμετρος της κυκλικής<br />
επιφάνειας είναι 13 mm.<br />
Εικόνα 2.11 BD PrepStain Slide Processor. Δεξιά της εικόνας φαίνονται σε<br />
μεγέθυνση οι θάλαμοι καθίζησης τα οποία βρίσκονται τοποθετημένα πάνω σε<br />
αντικειμενοφόρες πλάκες όπου καθιζάνουν τα κύτταρα.<br />
Η χρώση αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της επεξεργασίας του<br />
επιχρίσματος SurePath στο BD PrepStain Slide Processor όπου<br />
χρησιμοποιείται μια παραλλαγή της μεθόδου χρώσης κατά Παπανικολάου.<br />
Κατά την χρώση των επιχρισμάτων με την τεχνική SurePath, τα<br />
κερατινοποιημένα κύτταρα, που αποτελούν έναν σημαντικό δείκτη αλλοίωσης<br />
17
που προκαλείται από την μόλυνση με HPV, δεν βάφονται καλά και αυτό<br />
οδήγησε σε μια χαμηλή βαθμολογία της τεχνικής χρώσης SurePath από ένα<br />
πρόγραμμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας της τεχνικής που διεξάχθηκε στην<br />
Μεγάλη Βρετανία (TEQA) (NHS CSP 2004).<br />
Αφού παρασκευαστεί το επίχρισμα, το υπολειπόμενο υλικό στο<br />
φιαλίδιο του SurePath Preservative Fluid μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την<br />
παρασκευή επιπλέον επιχρισμάτων ή για διάφορες συμπληρωματικές<br />
εξετάσεις όπως τυποποίηση HPV, εξετάσεις για χλαμύδια ή γονόρροια.<br />
Εικόνα 2.12 Τα βήματα που ακολουθούνται κατά το ημι-αυτοματοποιημένο σύστημα<br />
SurePath. Τα βήματα 2 και 3 μπορεί να γίνουν είτε δια χειρός, είτε στο BD PrepMate<br />
system. Τα βήματα 5, 6 πραγματοποιούνται στο BD PrepStain Slide Processor.<br />
18
# Διαδικασία Χρόνος Σχόλια<br />
1 Αφαίρεση μονιμοποίησης με<br />
οινόπνευμα 50%<br />
2min Εάν η αφαίρεση του μονιμοποιητικού<br />
αποτύχει αυτό θα επηρεάσει την εικόνα<br />
των κυττάρων τα οποία θα έχουν<br />
επισκιαστεί<br />
2 Εμβάπτιση σε νερό 1min Ενυδάτωση κυττάρων<br />
3 Χρώση αιματοξυλίνης Harris 5 min<br />
4 Εμβάπτιση σε νερό 2 min Απομάκρυνση περίσσειας αιματοξυλίνης<br />
5 Διαφοροποίηση σε 0.5%<br />
υδατικού διαλύματος<br />
υδροχλωρικού οξέος<br />
10-20<br />
sec<br />
6 Νερό βρύσης 2 min<br />
7 Υποκατάστατο νερό βρύσης<br />
Scott<br />
1 min Το καφέ χρώμα της αιματίνης σε όξινο<br />
περιβάλλον γίνεται μπλε/μαύρο υπό την<br />
επίδραση ασθενούς αλκαλικού διαλύματος<br />
8 Εμβάπτιση σε νερό 2 min Καλή έκπλυση για την αφαίρεση των<br />
αλκαλικών αλάτων<br />
9 Αφυδάτωση σε 70% οινόπνευμα 2 min Αφυδάτωση με αύξουσα διαβαθμισμένη<br />
αλκοόλη<br />
10 Αφυδάτωση σε 95% οινόπνευμα 2 min<br />
11 Αφυδάτωση σε 95% οινόπνευμα 2 min<br />
12 Χρώση Orange G6 (OG6) 2 min<br />
13 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα 2 min<br />
14 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα 2 min<br />
15 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα 2 min<br />
16 Χρώση με διάλυμα Gills EA30 3 min<br />
17 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα<br />
x3<br />
1 min<br />
18 Ξυλόλη x3 και επικάλυψη με 1 min Το δείγμα παραμένει στην ξυλόλη μέχρι να<br />
DPX<br />
επικαλυφτεί με DPX.<br />
Πίνακας 2.1 Χρώση κατά Παπανικολάου<br />
19
2.2 Λήψη και παρασκευή μη-γυναικολογικών δειγμάτων<br />
Ο προσυμπτωματικός έλεγχος στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία<br />
αφορά την μικροσκοπική εξέταση κυτταρικών δειγμάτων που έχουν<br />
συλλεχθεί από διάφορα μέρη του ανθρώπινου οργανισμού, αυτό<br />
συμπεριλαμβάνει τα πτύελα, τα βρογχικά εκπλύματα, αναρροφήσεις<br />
μαστικού ιστού, νωτιαίο υγρό, υγρά από κοιλότητες του σώματος,<br />
εξιδρώματα και αναρροφήσεις λεπτής βελόνης συγκεκριμένων οργάνων.<br />
Παρακάτω παρουσιάζεται η διαδικασία παρασκευής επιχρισμάτων<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης για μη-γυναικολογικά δείγματα.<br />
2.2.1 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς<br />
Τα διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς που χρησιμοποιούνται<br />
στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία είναι το PreserveCyt, που<br />
περιγράψαμε πιο πάνω στην γυναικολογική κυτταρολογία(σελ. ) το οποίο<br />
αποτελεί μέσο συντήρησης των κυττάρων κατά την μεταφορά και την<br />
παρασκευή επιχρισμάτων με το ThinPrep® 2000 Processor, και το διάλυμα<br />
CytoLyt® το οποίο έχει ως βάση την μεθανόλη και είναι ένα διάλυμα<br />
συντήρησης με αιμολυτικές και βλεννολυτικές ιδιότητες, εμποδίζει την<br />
καθίζηση των πρωτεϊνών και διαφυλάσσει την μορφολογία του<br />
κυτταρολογικού δείγματος, δεν έχει σχεδιαστεί όμως για την παντελή<br />
αδρανοποίηση των μικροβίων. Αποτελεί επίσης μέσο μεταφοράς και<br />
χρησιμοποιείται κατά την προετοιμασία του δείγματος και πριν την<br />
επεξεργασία του. Τα δοχεία με CytoLyt αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-<br />
30 ο C, σε περίπτωση που περιέχεται κυτταρολογικό υλικό τότε αυτά μπορούν<br />
να διατηρηθούν για 8 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου, για καλύτερες<br />
επιδόσεις όμως θα πρέπει το δείγμα να αποσταλεί αμέσως στο εργαστήριο<br />
για επεξεργασία. Οι 8 ημέρες αφορούν δείγματα τα οποία βρίσκονται μέσα σε<br />
ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα διαλύματος CytoLyt και αναλογία ένα μέρος<br />
διαλύματος CytoLyt προς τρία μέρη κυτταρολογικού υλικού 18 . Η χρήση του<br />
CytoLyt περιγράφεται πιο κάτω λεπτομερέστατα. Και τα δύο διαλύματα<br />
(PreserveCyt και CytoLyt) αφορούν επεξεργασία δειγμάτων με την μέθοδο<br />
ThinPrep.<br />
Στην μέθοδο SurePath τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι το<br />
BD CytoRich Red preservative και το BD CytoRich Blue<br />
preservative. Και τα δύο διαλύματα έχουν ως βάση την αλκοόλη και<br />
αποτελούν μέσο συντήρησης, μονιμοποίησης και μεταφοράς μηγυναικολογικών<br />
κυτταρολογικών δειγμάτων τα οποία είτε συλλέγονται<br />
απευθείας στα διαλύματα συντήρησης (BD CytoRich Blue preservative ή<br />
BD CytoRich Red preservative) είτε αφού τα δείγματα φτάσουν στο<br />
εργαστήριο (χωρίς μονιμοποίηση) μονιμοποιούνται σε ίσες ποσότητες<br />
κυτταρολογικού υλικού-διαλύματος συντήρησης (BD CytoRich Red<br />
20
preservative). Η διαφορά μεταξύ των δύο διαλυμάτων συναντάται στο ότι το<br />
BD CytoRich Red preservative έχει αιμολυτικές ιδιότητες και διαλυτοποιεί<br />
τις πρωτεΐνες (1mL διαλύματος CytoRich Red preservative μπορεί να λύσει<br />
και να σταθεροποιήσει 25-50μL ολικού αίματος), ενώ το BD CytoRich Blue<br />
preservative έχει σχεδιαστεί να διατηρεί τα ερυθρά αιμοσφαίρια τα οποία<br />
έχουν διαγνωστική αξία για ορισμένα μη-γυναικολογικά κυτταρολογικά<br />
δείγματα για αυτό και η προσθήκη του κυτταρολογικού υλικού στο διάλυμα<br />
αυτό πρέπει να γίνει το συντομότερο δυνατόν μετά την συλλογή του 21 . Το BD<br />
CytoRich Red preservative αποθηκεύεται σε θερμοκρασίες 15-30 ο C για<br />
δύο χρόνια, σύμφωνα με τους κατασκευαστές του, σε περίπτωση που<br />
περιλαμβάνει κυτταρολογικό υλικό τότε μπορεί αν αποθηκευτεί μέχρι 30<br />
ημέρες. Έχει αποδειχτεί όμως ότι η μορφολογική σταθερότητα των δειγμάτων<br />
μπορεί να διαφυλαχτεί έως και για 6 μήνες σε θερμοκρασία δωματίου 22 .<br />
Επίσης και το BD CytoRich Blue preservative αποθηκεύεται στους 15-<br />
30 ο C, ενώ αν περιέχει κυτταρολογικό υλικό το δείγμα είναι σταθερό για<br />
δεκατέσσερις ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου.<br />
2.2.2 Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων<br />
Τα παρακάτω βήματα 17 αφορούν δείγματα που πρόκειται να<br />
επεξεργαστούν με την μέθοδο ThinPrep * .<br />
1. Συλλογή: Γενικά τα δείγματα φτάνουν στο εργαστήριο είτε νωπά, είτε<br />
μέσα σε διάλυμα CytoLyt.<br />
Δείγματα από αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης (Fine Needle<br />
Aspiration, FNA)<br />
Η βέλτιστη τεχνική συλλογής δειγμάτων που έχουν ληφθεί με FNA<br />
είναι η τοποθέτηση του δείγματος σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης που<br />
περιέχει 30mL διαλύματος CytoLyt.<br />
Βλεννώδη δείγματα<br />
Τα βλεννώδη δείγματα, όπως πτύελα ή δείγματα που έχουν ληφθεί<br />
με βουρτσάκι, συλλέγονται αμέσως σε διάλυμα CytoLyt, εάν αυτό δεν είναι<br />
δυνατό τότε τα δείγματα συλλέγονται νωπά και το CytoLyt προστίθεται το<br />
* Δείγματα ΕΝΥ ή άλλου τύπου που προέρχονται από άτομα με Μεταδοτικές Σπογγώδεις<br />
Εγκεφαλοπάθειες, όπως η νόσος Creutzfeldt-Jakob, για τα οποία υπάρχει υποψία ότι<br />
περιέχουν μολυσματικούς παράγοντες prions ΔΕΝ επεξεργάζονται με το ThinPrep 2000. Ο<br />
Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization, WHO) έχει καθορίσει ότι<br />
«επιφάνειες εργαστηριακών οργάνων που έχουν επιμολυνθεί με prions ΔΕΝ μπορούν να<br />
απολυμανθούν αποτελεσματικά χρησιμοποιώντας τις πρότυπες μεθόδους απολύμανσης.»<br />
Για αυτόν τον λόγο τα όργανα που έχουν επιμολυνθεί με prions δεν πρέπει να<br />
ξαναχρησιμοποιηθούν από τα εργαστήρια.<br />
21
συντομότερο δυνατό. Όσο πιο σύντομα προστεθεί το CytoLyt τόσο καλύτερα<br />
διατηρείται η κυτταρολογική μορφολογία και αρχίζει η διαδικασία<br />
βλεννόλυσης. Σε περίπτωση που τα βλεννώδη δείγματα είναι 20mL και άνω<br />
τότε πριν την προσθήκη του CytoLyt προηγείται φυγοκέντρηση.<br />
Δείγματα υγρής μορφής<br />
Ο καλύτερος τρόπος συλλογής δειγμάτων υγρής μορφής (δείγματα<br />
από ουροποιητικό σύστημα, υγρά κοιλοτήτων σώματος, αρθρικό υγρό και<br />
υγρά κύστεων) είναι η συγκέντρωσή τους σε ειδικά δοχείο χωρίς την<br />
προσθήκη του CytoLyt. Ο τρόπος αυτός είναι ο προτιμότερος διότι το<br />
διάλυμα CytoLyt προκαλεί, σε κάποιο βαθμό, κατακρήμνιση πρωτεϊνών σε<br />
υγρά που έχουν υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης. Εάν η προσθήκη του CytoLyt<br />
είναι απαραίτητη ώστε το δείγμα να μονιμοποιηθεί για την μεταφορά του στο<br />
εργαστήριο τότε η συλλογή μπορεί να γίνει απευθείας στο διάλυμα CytoLyt.<br />
Δείγματα επιφανειών σώματος<br />
Τα δείγματα επιφανειών σώματος που λαμβάνονται με βουρτσάκι ή<br />
με απόξεσμα είναι τα μόνα μη-γυναικολογικά δείγματα που συλλέγονται<br />
απευθείας στο διάλυμα PreservCyt.<br />
2. Φυγοκέντρηση<br />
Ο σκοπός εδώ είναι να ξεχωρίσει το κυτταρικό υλικό από το<br />
υπερκείμενο με αποτέλεσμα να προκύψει μια πιο συμπυκνωμένη μορφή των<br />
κυττάρων. Η φυγοκέντρηση μπορεί να γίνει είτε με νωπά δείγματα είτε μετά<br />
την προσθήκη του CytoLyt και ρυθμίζεται στα 600 g για 10 min.<br />
3. Απόρριψη του υπερκείμενου και Vortex:<br />
Το υπερκείμενο απορρίπτεται ώστε να παραμείνει μόνο το ίζημα<br />
κυττάρων που έχουν διαγνωστική αξία. Αν δεν απορριφθεί όλο το<br />
υπερκείμενο αυτό έχει ως συνέπεια την δημιουργία ενός αραιού δείγματος<br />
που συνεπάγει την παρασκευή ενός μη ικανοποιητικού επιχρίσματος. Το<br />
επόμενο βήμα είναι η ανάδευση του ιζήματος στο Vortex για 3 sec, που έχει<br />
σκοπό την τυχαιοποίηση των κυττάρων πριν την μεταφορά στο PreservCyt.<br />
4. Αξιολόγηση του κυτταρικού ιζήματος<br />
Αν τα κυτταρικό ίζημα έχει χρώμα λευκό, απαλό ροζ, ανοιχτό καφέ ή<br />
είναι διαφανές τότε προστίθεται στο φιαλίδιο με το διάλυμα PreserveCyt.<br />
Αν το κυτταρικό ίζημα είναι κόκκινο ή καφέ υποδεικνύοντας την<br />
παρουσία αίματος τότε γίνεται έκπλυση με διάλυμα CytoLyt ώστε να γίνει<br />
η απαραίτητη αιμόλυση προσθέτοντας 30mL διαλύματος CytoLyt, στην<br />
συνέχεια γίνεται φυγοκέντρηση για να μαζευτεί όλο το κυτταρικό υλικό, το<br />
υπερκείμενο απορρίπτεται και το δείγμα αναδεύεται στο Vortex ώστε να<br />
κατασταθεί ομογενές. Στην συνέχεια το δείγμα μεταφέρεται στο διάλυμα<br />
PreservCyt.<br />
Εάν το δείγμα είναι βλεννώδες τότε γίνεται έκπλυση με 30 mL<br />
διαλύματος CytoLyt όπως παραπάνω όμως πριν την φυγοκέντρηση το<br />
δείγμα αναδεύεται στο Vortex για 5min ώστε να λυθεί η βλέννη. Ακολουθεί η<br />
22
φυγοκέντρηση και αφού απορριφθεί το υπερκείμενο το ίζημα αναδεύεται στο<br />
Vortexκαι μεταφέρεται στο PreservCyt.<br />
Αφού το δείγμα παραμείνει για 15 min στο διάλυμα PreservCyt, για<br />
να απελευθερωθεί από τους λοιμογόνους παράγοντες εξαιτίας της<br />
αντιμικροβιακής δράσης του PreservCyt 17 , στην συνέχεια επεξεργάζεται στο<br />
ThinPrep 2000 Processor, επιλέγοντας το κατάλληλο κάθε φορά πρόγραμμα<br />
για την παρασκευή επιχρισμάτων μη γυναικολογικής κυτταρολογίας 17 .<br />
Στην μέθοδο SurePath, όπως και στο σύστημα ThinPrep, τα<br />
δείγματα φτάνουν στο εργαστήριο είτε νωπά είτε έχουν συλλεχθεί κατευθείαν<br />
στα διαλύματα μονιμοποίησης. Για τα δείγματα που επεξεργάζονται με την<br />
μέθοδο SurePath χρησιμοποιούνται τα διαλύματα BD CytoRich Red<br />
preservative και BD CytoRich Blue preservative * .<br />
Τα βήματα που ακολουθούνται είναι 21 :<br />
1. Συλλογή:<br />
Εκπλύσεις<br />
Τα δείγματα φτάνουν στο εργαστήριο νωπά ή μονιμοποιημένα στο<br />
διάλυμα BD CytoRich Red preservative.<br />
Δείγματα επιφανειών σώματος<br />
Τα οποία λαμβάνονται με ειδικό βουρτσάκι και, αν είναι απαραίτητο,<br />
πρώτα παρασκευάζονται άμεσα παρασκευάσματα και στην συνέχεια το<br />
βουρτσάκι τοποθετείται μέσα σε 10 mL διαλύματος BD CytoRich Red<br />
preservative και αποστέλλεται στο εργαστήριο.<br />
Υγρά κοιλοτήτων σώματος<br />
Σε περίπτωση που ο όγκος του διαλύματος ξεπερνά τα 100 mL τα<br />
δείγματα μεταφέρονται νωπά στο εργαστήριο ή αν είναι απαραίτητο<br />
ψύχονται. Σε περίπτωση που ο όγκος του διαλύματος δεν ξεπερνά τα 100mL<br />
τότε τα δείγματα είτε μεταφέρονται νωπά στο εργαστήριο είτε συλλέγονται<br />
κατευθείαν σε διάλυμα BD CytoRich Red preservative.<br />
Πτύελα<br />
Αν τα δείγματα λαμβάνονται νωπά τότε μονιμοποιούνται σε ίσα μέρη<br />
διαλύματος BD CytoRich Blue preservative/δείγματος ή διαφορετικά<br />
συλλέγονται κατευθείαν σε 30 mL BD CytoRich Blue preservative.<br />
Ούρα-Εκπλύσεις ουροδόχου κύστεως<br />
Αν το δείγμα λαμβάνεται νωπό τότε μονιμοποιείται σε ίσα μέρη<br />
διαλύματος BD CytoRich Blue preservative/δείγματος ή διαφορετικά το<br />
δείγμα συλλέγεται κατευθείαν σε 30 mL BD CytoRich Blue preservative.<br />
* Το BD CytoRich Blue preservative χρησιμοποιείται για την συλλογή δειγμάτων πτυέλων,<br />
ούρων και εκπλύσεις ουροδόχου κύστεως καθώς έχει την ιδιότητα να διατηρεί τα ερυθρά<br />
αιμοσφαίρια, η παρουσία των οποίων έχει διαγνωστική αξία για αυτά τα δείγματα.<br />
23
Δείγματα από αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης<br />
Αν είναι απαραίτητο πρώτα παρασκευάζονται άμεσα<br />
παρασκευάσματα και στην συνέχεια η βελόνη τοποθετείται σε 10 mL<br />
διαλύματος BD CytoRich Red preservative ή διαφορετικά όλο το<br />
περιεχόμενο της βελόνης εμβαπτίζεται σε 10 mL διαλύματος BD CytoRich<br />
Red preservative.<br />
2. Συγκέντρωση κυτταρικού υλικού<br />
Το δείγμα αναδεύεται στο Vortex για να ομογενοποιηθεί και στην<br />
συνέχεια ελέγχεται για την παρουσία πηγμάτων, σωματιδίων και βλέννης. Σε<br />
αυτή την περίπτωση το δείγμα φιλτράρεται χρησιμοποιώντας π.χ. μια γάζα<br />
για την απομάκρυνση πηγμάτων και σωματιδίων.<br />
Ύστερα ακολουθεί η φυγοκέντρηση του δείγματος μεταφέροντας μια<br />
ποσότητα 50 mL σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης, η φυγόκεντρος<br />
ρυθμίζεται στα 600g για 10 min και στην συνέχεια το υπερκείμενο<br />
απορρίπτεται.<br />
3. Μονιμοποίηση<br />
Το στάδιο αυτό δεν εφαρμόζεται σε δείγματα που έχουν συλλεχθεί<br />
κατευθείαν σε διάλυμα BD CytoRich Red ή Blue preservative.<br />
Ανάλογα με την προέλευση του δείγματος προστίθεται σε αυτό 5-10<br />
mL διαλύματος BD CytoRich Red ή Blue preservative, αναδεύεται στο<br />
Vortex για 15 ± 5 sec και το δείγμα αφήνεται να ηρεμήσει για περίπου 30<br />
min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 600 g για 10 min, το υπερκείμενο<br />
απορρίπτεται και το ίζημα αναδεύεται στο Vortex για να ομογενοποιηθεί.<br />
4. Έκπλυση<br />
- Αν η ποσότητα του ιζήματος είναι μικρή έως αόρατη τότε<br />
προστίθενται 6 mL DI H2O (απιονισμένο νερό) στα σωληνάρια<br />
φυγοκέντρησης που περιέχουν 50 mL δείγματος (βλ. σελ. ), στην συνέχεια<br />
το μείγμα αναδεύεται στο Vortex για 15 ± 5 sec και μεταφέρεται σε<br />
σωληνάρια των 12 mL.<br />
- Αν η ποσότητα του ιζήματος είναι μέτρια προς μεγάλη τότε<br />
μεταφέρονται 1-5 σταγόνες δείγματος σε σωληνάρια των 12 mL και<br />
προστίθενται σε αυτό 10 mL DI H2O.<br />
- Στην συνέχεια ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 600 g για 5 min και<br />
αφού απορριφθεί το υπερκείμενο το δείγμα αναδεύεται στο Vortex για 15 ± 5<br />
sec για να ομογενοποιηθεί. Το δείγμα στην συνέχεια είναι έτοιμο να<br />
επεξεργαστεί στο BD PrepStain Slide Processor για την παρασκευή μη<br />
γυναικολογικών επιχρισμάτων.<br />
24
2.3 Αξιολόγηση επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης<br />
στο μικροσκόπιο<br />
Βάση πολυάριθμων ερευνών έχουν σημειωθεί ορισμένες αλλαγές από<br />
τον Γεώργιο Παπανικολάου έως σήμερα, όσον αφορά τα μορφολογικά κριτήρια<br />
των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Οι διαφορές οφείλονται κυρίως στο υγρό<br />
μέσο συντήρησης και μεταφοράς που χρησιμοποιείται στην κυτταρολογία υγρής<br />
φάσης (ΚΥΦ). Εδώ πέρα πρέπει να σημειωθεί ότι τα χαρακτηριστικά των<br />
κυττάρων δεν αλλάζουν κατά την επεξεργασία των δειγμάτων και έτσι η ερμηνεία<br />
τους γίνεται με βάση την κλασική μορφολογία. Οι μορφολογικές ομοιότητες της<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης με την συμβατική κυτταρολογία είναι πολλές και<br />
Εικόνα 2.13 Οι γκρίζες περιοχές αναπαριστούν τις περιοχές επικάλυψης<br />
οπτικών πεδίων κατά την μικροσκόπηση παρασκευασμάτων ΚΥΦ. Οι<br />
περιοχές αυτές αποτελούν το 50% του οπτικού πεδίου.<br />
Εικόνα 2.14 Ανάμεσα στα τόσα<br />
φυσιολογικά κύτταρα βρίσκονται 2<br />
κύτταρα μολυσμένα με HPV.<br />
υπερβαίνουν κατά πολύ τις διαφορές<br />
τους. Παρακάτω επεξηγείται ο τρόπος<br />
που γίνεται η μικροσκόπηση των<br />
δειγμάτων σε επιχρίσματα<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης και επίσης<br />
παρουσιάζονται κάποια χαρακτηριστικά<br />
αυτών των επιχρισμάτων.<br />
Όπως και στα συμβατικά<br />
παρασκευάσματα, η εξέταση των<br />
παρασκευασμάτων υγρής φάσης γίνεται<br />
αργά και ακολουθώντας συγκεκριμένη<br />
διαδρομή. Επειδή όμως το πεδίο<br />
ελέγχου έχει στρογγυλό σχήμα η<br />
μικροσκόπηση γίνεται επικαλύπτοντας<br />
τα οπτικά πεδία (εικόνα 2.13), πράγμα<br />
που δεν συμβαίνει κατά την<br />
μικροσκόπηση συμβατικών<br />
παρασκευασμάτων. Πριν την<br />
25
καθιερωμένη αξιολόγηση του επιχρίσματος, που γίνεται με αντικειμενικό φακό<br />
10Χ, συνήθως είναι πολύ αποτελεσματικό να γίνεται ένας γρήγορος έλεγχος<br />
χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό 4Χ, ώστε να αξιολογηθεί, εν συντομία, η<br />
κυτταροβρίθεια (κύτταρα φυσιολογικά και μη), η παρουσία ενδοτραχηλικών<br />
κυττάρων και τα τεχνικά χαρακτηριστικά του παρασκευάσματος. Στην<br />
κυτταρολογία υγρής φάσης η ποσοτική αξιολόγηση των μη φυσιολογικών<br />
κυττάρων δεν είναι τόσο σημαντική όσο είναι καθοριστική η παρουσία ή η<br />
απουσία τους. Οι έμπειροι<br />
κυτταροτεχνολόγοι και<br />
παθολόγοι μπορούν πολύ<br />
εύκολα να αναγνωρίσουν του<br />
διάφορους τύπους κυττάρων και<br />
στα επιχρίσματα κυτταρολογίας<br />
υγρής φάσης.<br />
Η εξέταση<br />
παρασκευασμάτων<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης<br />
είναι μια μέθοδος που απαιτεί<br />
μεγάλη και συνεχή<br />
συγκέντρωση του τεχνολόγου<br />
σε σχέση με την εξέταση<br />
συμβατικών παρασκευασμάτων<br />
επειδή τα άτυπα κύτταρα, που<br />
είναι καθοριστικής σημασίας,<br />
μπορεί να «κρυφτούν» ανάμεσα<br />
στα φυσιολογικά κύτταρα<br />
(εικόνα 2.14) λόγω της<br />
διασποράς των κυττάρων μέσα<br />
στο υγρό συντήρησης, έτσι<br />
μπορεί ένα μη φυσιολογικό<br />
κύτταρο να βρεθεί οπουδήποτε<br />
στην εξεταζόμενη επιφάνεια του<br />
επιχρίσματος. Επιπλέον, για να<br />
είναι δυνατή η αξιολόγηση<br />
μεμονωμένων κυττάρων που<br />
δεν μπορεί να γίνει κατά την<br />
μικροσκόπηση με αντικειμενικό<br />
Εικόνα 2.15 Α) χαρακτηριστική εικόνα συμβατικού<br />
παρασκευάσματος όπου η άνιση κατανομή του<br />
κυτταρικού υλικού είναι εμφανέστατη<br />
Β) παρασκεύασμα ΚΥΦ, τα κύτταρα είναι<br />
ομοιόμορφα κατανεμημένα.<br />
φακό x10, είναι αναγκαία η χρήση φακού μεγαλύτερης μεγέθυνσης (x40, x60).<br />
Αυτό γίνεται καθ’ όλη την διάρκεια μικροσκόπησης παρασκευασμάτων ΚΥΦ.<br />
Γενικά η διαδικασία εξέτασης παρασκευάσματος κυτταρολογίας υγρής φάσης<br />
απαιτεί μια μεγαλύτερη συγκέντρωση του τεχνολόγου.<br />
Τα χαρακτηριστικά των παρασκευασμάτων ΚΥΦ, που τα καθιστούν<br />
μοναδικά, είναι: η κυτταρική ομοιογένεια των παρασκευασμάτων, το υγρό<br />
μέσο μονιμοποίησης, το μέγεθος των κυττάρων, η εικόνα του<br />
επιχρίσματος και το υπόστρωμα.<br />
Κυτταρική ομοιογένεια: Επειδή το κυτταρικό υλικό συγκεντρώνεται σε<br />
υγρό μέσο συντήρησης και στην συνέχεια φιλτράρεται (ΤhinPrep) ή<br />
φυγοκεντρείται (SurePath) για να διαχωριστούν τα κύτταρα από το υπόλοιπο<br />
26
υλικό, η παρουσίαση των δειγμάτων στα παρασκευάσματα υγρής φάσης<br />
διαφέρει από τα συμβατικά. Στα συμβατικά επιχρίσματα παρουσιάζονται παχιές<br />
και λεπτές περιοχές, ξήρανση και πολλές φορές παραμόρφωση των κυττάρων<br />
(εικόνα 2.15 Α). Αντιθέτως στα επιχρίσματα ΚΥΦ το κυτταρικό υλικό είναι<br />
συγκεντρωμένο και ομοιόμορφα κατανεμημένο εντός μιας κυκλικής περιοχής. Η<br />
επικάλυψη κυττάρων παρατηρείται και στα επιχρίσματα ΚΥΦ αλλά σε πολύ<br />
μικρότερο βαθμό.<br />
Υγρό μέσο μονιμοποίησης: Το υγρό μέσο συγκέντρωσης και<br />
μονιμοποίησης κυττάρων είναι αυτό που καθιστά την ΚΥΦ μια μοναδική τεχνική.<br />
Η μορφολογία των κυττάρων στα κολποτραχηλικά επιχρίσματα είναι παρόμοια<br />
και στα μη-γυναικολογικά δείγματα, όπου τα κύτταρα έχουν την τάση να<br />
στρογγυλοποιούνται μέσα στο υγρό, παρόλα αυτά οι διάφοροι τύποι κυττάρων<br />
μπορούν να διακριθούν πολύ εύκολα στα επιχρίσματα κυτταρολογίας υγρής<br />
φάσης. Τα ενδοτραχηλικά κύτταρα μπορεί να εμφανίζονται τρισδιάστατα και να<br />
συγχέονται με κύτταρα του ενδομητρίου. Επίσης πολλές φορές κατά την εξέταση<br />
του επιχρίσματος σε μεγάλη μεγέθυνση παρατηρούνται περιφερειακά των<br />
κυτταρικών συστάδων ενδοτραχηλικά κύτταρα με πασσαλοειδής διάταξη.<br />
Εικόνα 2.16 a)υποχρωμία μη φυσιολογικών κυττάρων σε ThinPrep παρασκεύασμα.<br />
Ένα φαινόμενο που αποτελεί αιτία ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων, σε αυτή την<br />
περίπτωση η διάγνωση στηρίζεται στις ακανόνιστες ομάδες κυττάρων και στην<br />
μορφολογία της πυρηνικής μεμβράνης. b,c)υπερχρωματικοί πυρήνες σε<br />
παρασκευάσματα b)ThinPrep και c) SurePath.<br />
Το υγρό διάλυμα συντήρησης και μονιμοποίησης περιέχει αλκοόλη η<br />
οποία συντηρεί την μορφολογία του πυρήνα και όλου του κυττάρου. Ως<br />
αποτέλεσμα αυτής της ενισχυμένης συντήρησης των λεπτομερειών του<br />
κυττάρου είναι ο γρήγορος και εύκολος προσδιορισμός της προέλευσης του<br />
κυττάρου και του βαθμού ωρίμανσής του. Η καλή συντήρηση της μορφολογίας<br />
του πυρήνα αποτελεί μια από τις σημαντικότερες ιδιότητες της υγρής<br />
μονιμοποίησης. Η εικόνα του πυρήνα μπορεί να παρερμηνευτεί από τους<br />
τεχνολόγους και τους παθολόγους καθώς είναι κάπως διαφορετική σε σχέση με<br />
27
τα συμβατικά παρασκευάσματα. Ο πυρήνας στα επιχρίσματα ΚΥΦ παίρνει μια<br />
φυσαλιδώδη, λεπτή εμφάνιση 23 . Η υπερχρωμία που συναντάται στα συμβατικά<br />
παρασκευάσματα σχετίζεται με πλακώδεις αλλοιώσεις, στην ΚΥΦ όμως μπορεί<br />
να μην είναι τόσο έντονη, για αυτό και δεν πρέπει να ληφθεί ως αξιόπιστος<br />
δείκτης για την παρουσία αλλοιώσεων του πλακώδους επιθηλίου κατά την<br />
εξέταση των επιχρισμάτων (εικόνα 2.16).<br />
Εάν παρουσιάζεται υπερχρωμία του πυρήνα τότε λαμβάνεται υπόψη και<br />
το επίχρισμα εξετάζεται περαιτέρω για την παρουσία αλλοιώσεων, σε<br />
περίπτωση όμως που δεν παρουσιάζεται αυτό δεν σημαίνει ότι ο πυρήνας δεν<br />
εμφανίζει αλλοιώσεις. Όταν σε ένα δείγμα δεν παρουσιάζεται υπερχρωμία του<br />
πυρήνα τότε ο εξεταστής θα πρέπει να στηριχτεί σε άλλα χαρακτηριστικά, όπως<br />
διακυμάνσεις στο μέγεθος και το σχήμα του πυρήνα, για την ερμηνεία υψηλού<br />
βαθμού αλλοιώσεων, λεπτομέρειες που παραβλέπονται ή δεν αξιολογούνται<br />
κατά την εξέταση συμβατικών επιχρισμάτων 24 .<br />
Μέγεθος κυττάρου: Λόγω του υγρού μέσου μονιμοποίησης τα κύτταρα<br />
εμφανίζονται ελαφρώς μικρότερα από ότι στα συμβατικά παρασκευάσματα και<br />
συνήθως μεμονωμένα, ειδικά τα ενδοτραχηλικά και τα ανώριμα μεταπλαστικά<br />
κύτταρα. Αυτή η στρογγυλοποίηση των κυττάρων μεταβάλλει την αναλογία<br />
«πυρήνα προς κυτταρόπλασμα» υπέρ του πυρήνα. Η καλή μονιμοποίηση των<br />
ενδιάμεσων κυττάρων είναι πολύ χρήσιμη διότι βάση αυτών μπορεί να<br />
υπολογιστεί το μέγεθος του κυττάρου και του πυρήνα. Τα ενδιάμεσα κύτταρα<br />
αποτελούν την βάση για την ερμηνεία και αξιολόγηση των μικρών, ανώριμων,<br />
μεταπλαστικών κυττάρων. Η εξέταση αυτών των κυττάρων γίνεται σε μεγάλη<br />
μεγέθυνση ώστε να αξιολογηθεί προσεκτικά ο πυρήνας για εμφάνιση ατυπίας<br />
ειδικά σε περιπτώσεις έλλειψης υπερχρωμίας του πυρήνα. Πολλές φορές<br />
συναντούνται τρισδιάστατες δομές των κυττάρων, ένα φαινόμενο που είναι πολύ<br />
πιο έντονο στην ΚΥΦ από ότι στα συμβατικά παρασκευάσματα, και το οποίο<br />
απαιτεί από του τεχνολόγους να επανεστιάζουν συνεχώς (εικόνα 2.17) κατά την<br />
μικροσκόπηση. Για αυτόν τον λόγο πολύ ερευνητές πιστεύουν ότι ο όρος που<br />
χρησιμοποιείται: «κυτταρολογία μονοεπίπεδης στοιβάδας» πρέπει να<br />
αντικατασταθεί με τον όρο «κυτταρολογία λεπτής επίστρωσης» ή αλλιώς, όπως<br />
το ξέρουμε, Κυτταρολογία Υγρής Φάσης. Τέλος, δεδομένου ότι το αίμα έχει<br />
υποστεί λύση στα δείγματα ΚΥΦ, υπάρχουν μόνο ερυθρά αιμοσφαίρια<br />
«φαντάσματα» (ghost red cells) στα εμμηνορροϊκά δείγματα.<br />
Εικόνα 2.17 Τρισδιάστατη δομή μη φυσιολογικών κυττάρων σε παρασκεύασμα<br />
ThinPrep. Ίδια εικόνα με τρεις διαφορετικές εστιάσεις. Η συνεχής επανεστίαση είναι<br />
απαραίτητη για να αξιολογηθούν όλα τα κύτταρα όταν σχηματίζουν τέτοιες ομάδες.<br />
28
Εικόνα του επιχρίσματος και υπόστρωμα: Γενικά η εικόνα του<br />
επιχρίσματος ΚΥΦ διαφέρει από το συμβατικό. Το κυτταρικό υλικό είναι ενιαία<br />
και ομοιόμορφα κατανεμημένο, όμως οι σχέσεις μεταξύ των κυττάρων χάνονται<br />
και τα κύτταρα είναι τυχαία διασκορπισμένα (διασπορά). Όσον αφορά το<br />
υπόστρωμα, σε σχέση με τα συμβατικά επιχρίσματα, τα επιχρίσματα ΚΥΦ<br />
χαρακτηρίζονται γενικά από ένα καθαρό υπόστρωμα θέτοντας την διάγνωση<br />
πολύ πιο γρήγορη και εύκολη. Η συνεχής εκπαίδευση είναι πολύ σημαντική<br />
ώστε οι κυτταρολόγοι να μάθουν και να συνηθίσουν την μορφολογική εικόνα των<br />
επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης.<br />
Τα φλεγμονώδη στοιχεία είναι και αυτά ομοιόμορφα κατανεμημένα στα<br />
ΚΥΦ παρασκευάσματα και πολλές φορές βρίσκονται προσκολλημένα στα<br />
επιθηλιακά κύτταρα ενώ το υπόστρωμα εμφανίζεται «ατημέλητο» και<br />
«βρώμικο». Τα στοιχεία αυτά αποτελούν ένδειξη παρουσίας λοιμογόνου<br />
παράγοντα, κυτταρόλυσης ή/και κακοήθους νόσου.<br />
Παρακάτω παρουσιάζεται η μορφολογική εικόνα, διαφόρων τύπων,<br />
φυσιολογικών κυττάρων και κυττάρων που έχουν υποστεί αλλοίωση εξαιτίας<br />
κάποιων νοσημάτων.<br />
Εικόνα 2.18 Μορφολογία κυττάρων στα παρασκευάσματα ThinPrep. A) Δείγμα από υγρά περιτόναιου:<br />
θηλωματώδες ορώδες καρκίνωμα του ενδομητρίου (20x). Β) Βρογχικό απόξεσμα: αδιαφοροποίητο<br />
μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα 60x. C) FNA θυρεοειδή. Θηλωματώδες καρκίνωμα θυρεοειδούς: το<br />
σημαντικότερο κριτήριο για μια καθοριστική διάγνωση θηλωματώδους καρκινώματος είναι η<br />
κυτταροβρίθεια παρουσία φύλλων κυττάρων σε συνοχή μεταξύ τους και συστάδες θυλακιωδών<br />
κυττάρων σε χαμηλή μεγέθυνση 10x όπως παρουσιάζεται εδώ. D) FNA μαστού. Κύστη μαστού: τα<br />
καλοήθη πορογενή κύτταρα κυστικού υγρού μπορεί να παρουσιάσουν εκφυλιστική κενοτοποίηση του<br />
κυτταροπλάσματος όπως φαίνεται εδώ (60x). Ε) FNA ήπατος. Κίρρωση: καλοήθη χαλαρή συστάδα<br />
ηπατοκυττάρων με διπυρήνωση και μικρή αναλογία πυρήνα προς κυτταρόπλασμα. (40x). F) FNA<br />
παγκρέατος. Καλοήθη πορογενή κύτταρα: τα κύτταρα εδώ εμφανίζονται ενωμένα σε κυψελοειδή<br />
διάταξη με στρογγυλούς πυρήνες και καλά καθορισμένα όρια μεταξύ τους.<br />
29
2.4 Αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου<br />
2.4.1 Ιστορική Αναδρομή<br />
Το πρώτο αυτοματοποιημένο σύστημα προληπτικού ελέγχου στην<br />
τραχηλική κυτταρολογία έκανε την εμφάνισή του την δεκαετία του ’50.<br />
Επρόκειτο για έναν στατικό ανιχνευτή κυττάρων (cell scanner) που<br />
ονομαζόταν Cytoanalyzer το οποίο αναπτύχθηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες<br />
από την Airborne Instruments Inc. Το σύστημα όμως απέτυχε να βρει μια<br />
θέση στην κλινική πρακτική, λόγω έλλειψης ικανοποιητικής υπολογιστικής<br />
δυνατότητας να αναλύσει τις σύνθετες εικόνες των επιχρισμάτων, αν και<br />
χρειάστηκαν παραπάνω από 5.000.000$ (πολλά χρήματα για την τότε<br />
εποχή) για την ανάπτυξή του. Παρόλο τις αποτυχίες, οι προσπάθειες<br />
συνεχίστηκαν τις δεκαετίες του ’70 και ’80, ειδικά στην Ευρώπη και Ιαπωνία<br />
με την ανάπτυξη διαφόρων υπολογιστών ανίχνευσης κυττάρων όπως το<br />
Quantimet, το BIOPEPR, το CERVIFIP, το CYBEST, το DIASCANNER, το<br />
FAZYTAN και το LEYTAS 1 . Μερικά από αυτά τα όργανα βρίσκονται στα<br />
μουσεία, άλλα αποτέλεσαν πρότυπο για την κατασκευή συστημάτων που<br />
χρησιμοποιούνται σήμερα.<br />
Οι πρώτες αυτές αυτοματοποιημένες συσκευές στηριχτήκαν εξ<br />
ολοκλήρου στην ανάλυση εικόνας, εξετάζοντας ένα-ένα τα κύτταρα στο<br />
επίχρισμα χρησιμοποιώντας έναν αλγοριθμικό λογισμικό πρόγραμμα<br />
υπολογιστών. Με την ανάπτυξη της τεχνολογίας των υπολογιστών εισήχθη η<br />
τεχνητή νοημοσύνη στα συστήματα επεξεργασίας εικόνας που αποτελείται<br />
από νευρωνικά δίκτυα μέσω των οποίων είναι δυνατή η αναγνώριση των<br />
σχημάτων στις φυσικές εικόνες.<br />
Τα τρέχοντα εμπορικά αυτοματοποιημένα συστήματα<br />
χρησιμοποιούν και τα δύο προγράμματα, δηλαδή και τα αλγοριθμικά<br />
προγράμματα και τα προγράμματα τεχνητής νοημοσύνης για την ανάλυση<br />
των επιχρισμάτων.<br />
Τον Μάιο του 1998 ο FDA ενέκρινε το σύστημα AutoPap (Neopath<br />
Inc. Redmond Washington USA) για την χρήση του στην πρωτοβάθμια<br />
εξέταση των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, στα πλαίσια του προληπτικού<br />
ελέγχου του τραχήλου της μήτρας. Το AutoPap έλεγχε ένα-ένα τα<br />
κολποτραχηλικά επιχρίσματα και στην συνέχεια τα ταξινομούσε σύμφωνα με<br />
τον βαθμό της ατυπίας τους. Το σύστημα απέκλειε αυτόματα το 25% των<br />
επιχρισμάτων με το χαμηλότερο κίνδυνο από εκείνα που έχριζαν<br />
μικροσκοπική επανεξέταση, μειώνοντας έτσι τον φόρτο εργασίας του<br />
κυτταροτεχνολόγου κατά 25%.<br />
Ένα άλλο σύστημα, το Papnet (Neuromedical System Inc.<br />
Amsterdam BV) αναπτύχθηκε, σχεδόν την ίδια περίοδο, ως μέθοδος για την<br />
πρωτοβάθμια εξέταση των συμβατικών τεστ Παπανικολάου. Το Papnet<br />
ανέλυε τις εικόνες των επιχρισμάτων και επέλεγε εκείνες που παρουσίαζαν<br />
30
ενδιαφέρον. Οι εικόνες αυτές αποθηκευόντουσαν και εξεταζόντουσαν στην<br />
συνέχεια σε οθόνη υπολογιστή από έναν κυτταροτεχνολόγο, ο οποίος,<br />
εξετάζοντας αυτές τις εικόνες αποφάσιζε αν ένα επίχρισμα ήταν αρνητικό ή<br />
έπρεπε να επανεξεταστεί στο μικροσκόπιο.<br />
Και τα δύο συστήματα μελετήθηκαν εκτενώς και οι διάφορες δοκιμές<br />
έδειξαν ότι η ευαισθησία αυτών των αυτοματοποιημένων συστημάτων ήταν<br />
τουλάχιστον ίδια με την μικροσκοπική εξέταση 25-28 . Τα συστήματα όμως δεν<br />
ήταν εμπορικά βιώσιμα καθώς δεν βρέθηκε να συμφέρουν οικονομικά τα<br />
περισσότερα εργαστήρια.<br />
Οι δύο τεχνολογίες των Papnet και AutoPap δεν είναι πλέον<br />
διαθέσιμες, αγοράστηκαν από μια άλλη εταιρεία η οποία πλέον έχει βγάλει<br />
στην αγορά το FocalPoint Slide Profiler (BD TriPath Imaging, Burlington,<br />
NC) που εγκρίθηκε από τον FDA το 1998 για την ανάλυση συμβατικών<br />
παρασκευασμάτων και το 2001 για την ανάλυση SurePath επιχρισμάτων<br />
Παπανικολάου. Το 2003 το FDA ενέκρινε το ThinPrep Imaging System<br />
(Hologic Inc.) ως μέθοδο βοηθητικού ελέγχου στην πρωτοβάθμια εξέταση<br />
των επιχρισμάτων Παπανικολάου με την μέθοδο ThinPrep. Το τελευταίο<br />
σύστημα που έχει λάβει την έγκριση από το FDA είναι το BD<br />
FocalPoint ® GS Imaging System, το οποίο εγκρίθηκε τον Δεκέμβρη του<br />
2008 ως σύστημα βοηθητικού ελέγχου στην πρωτοβάθμια εξέταση<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.<br />
Κανένα από τα τρία συστήματα δεν έχει εγκριθεί για την ανάλυση<br />
επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας 1 .<br />
2.4.2 FocalPoint Slide Profiler<br />
Το FocalPoint<br />
Slide Profiler (εικόνα 2.19)<br />
είναι μια αυτοματοποιημένη<br />
συσκευή η οποία ταξινομεί τα<br />
κολποτραχηλικά επιχρίσματα<br />
χωρίς την ανθρώπινη<br />
παρέμβαση. Το σύστημα<br />
χρησιμοποιεί αλγοριθμικό<br />
λογισμικό για να μετρήσει και<br />
να αναγνωρίσει τα<br />
χαρακτηριστικά του κυττάρου<br />
όπως το μέγεθος του<br />
πυρήνα,<br />
πυκνότητα,<br />
την<br />
την<br />
οπτική<br />
αναλογία<br />
Εικόνα 2.19 FocalPoint Slide Profiler.<br />
πυρήνα/κυτταροπλάσματος<br />
και το πυρηνικό περίγραμμα. Το σύστημα αφού σκανάρει τα επιχρίσματα, τα<br />
βαθμολογεί από το 0 έως το 1,0 ως προς την πιθανότητα παρουσίας<br />
31
σημαντικών επιθηλιακών αλλοιώσεων και τα ταξινομεί σε τρεις μεγάλες<br />
κατηγορίες. Το 25% * των επιτυχώς επεξεργασμένων επιχρισμάτων για τα<br />
οποία καθορίστηκε ότι έχουν τις λιγότερες πιθανότητες να περιέχουν μη<br />
φυσιολογικά κύτταρα, δεν επανεξετάζονται και καταχωρούνται ως αρνητικά.<br />
Από το υπολειπόμενο 75% των επιχρισμάτων, για τα οποία απαιτείται<br />
μικροσκοπική εξέταση καθώς έχουν ταξινομηθεί από το σύστημα ως πιθανά<br />
να περιέχουν αλλοιώσεις, το σύστημα αναγνωρίζει 15% ως επιχρίσματα με<br />
την μεγαλύτερη πιθανότητα εύρεσης αλλοιώσεων και τα προωθεί για δεύτερη<br />
μικροσκοπική εξέταση (εικόνα 2.20). Το FocalPoint Slide Profiler έχει την<br />
ικανότητα να επεξεργαστεί συμβατικά και SurePath κολποτραχηλικά<br />
επιχρίσματα. Το σύστημα διαθέτει 8 δίσκους που το καθένα δέχεται 36<br />
επιχρίσματα και είναι ικανό να επεξεργαστεί 288 επιχρίσματα σε 24 ώρες.<br />
Το FocalPoint Slide Profiler δεν έχει εγκριθεί για την επεξεργασία<br />
επιχρισμάτων ασθενών που ανήκουν στην ομάδα υψηλού κινδύνου για<br />
καρκίνο του τραχήλου 1 , ο έλεγχος αυτών των επιχρισμάτων πρέπει να γίνει<br />
με δια χειρός μικροσκόπηση από το προσωπικό του εργαστηρίου.<br />
†<br />
Εικόνα 2.20 Ταξινόμηση των επιχρισμάτων ύστερα από την βαθμολόγησή τους με βάση<br />
την πιθανότητα παρουσίας αλλοίωσης (0=αρνητικό, 1=αλλοίωση). Α-επιχρίσματα που<br />
βαθμολογούνται κάτω από συγκεκριμένο όριο δεν υφίστανται μικροσκοπικό έλεγχο. Βεπιχρίσματα<br />
που βαθμολογούνται πάνω από συγκεκριμένο όριο ελέγχονται από τους<br />
κυτταροτεχνολόγους. C-επιχρίσματα που απαιτούν δεύτερη επανεξέταση από τους<br />
κυτταροτεχνολόγους (έχουν την μεγαλύτερη πιθανότητα εύρεσης αλλοιώσεων).<br />
* Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι αυτό το ποσοστό στην πραγματικότητα φτάνει το 17%.<br />
† http://www.bd.com/tripath/labs/focalpoint_model_pop.asp<br />
32
2.4.3 Διαδραστικά συστήματα ελέγχου<br />
Αυτό το πρότυπο σχέδιο ελέγχου βασίζεται στην «συνεργασία» του<br />
κυτταροτεχνολόγου με το σύστημα ελέγχου για την ερμηνεία των<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τα κύρια διαδραστικά συστήματα ελέγχου<br />
σήμερα είναι το ThinPrep Imaging System ® (Cytyc, a Hologic Company) και<br />
το BD FocalPoint ® GS Imaging System (BD Diagnostics - TriPath). Το<br />
καθένα από αυτά περιέχει ένα σύστημα σάρωσης των επιχρισμάτων,<br />
χρησιμοποιεί ένα αλγοριθμικό σύστημα για να επεξεργαστεί τα δεδομένα των<br />
κυττάρων, και με την βοήθεια ενός αυτόματου μικροσκοπίου και<br />
χρησιμοποιώντας άξονες Χ-Υ αναγνωρίζει αυτόματα κάθε φορά πεδία<br />
κυττάρων πάνω στο επίχρισμα τα οποία έχουν κριθεί ως σημαντικά για<br />
Εικόνα 2.21 ThinPrep Imaging System®. Στην εικόνα φαίνεται ο ηλεκτρονικός<br />
τρόπος επισήμανσης αντικειμένων ενδιαφέροντος σε επίχρισμα ThinPrep.<br />
33
αξιολόγηση. Ουσιαστικά πρόκειται για μια μέθοδο βοηθητικού ελέγχου στην<br />
πρωτοβάθμια εξέταση των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων η οποία αφού<br />
αναγνωρίζει πεδία πάνω στα επιχρίσματα τα οποία «κρίνει» ότι είναι<br />
σημαντικά για επανεξέταση, τα μαρκάρει ώστε ο κυτταροτεχνολόγος να<br />
ανατρέξει σε αυτά εύκολα και γρήγορα κάθε φορά που απαιτείται.<br />
Τα διαδραστικά συστήματα ελέγχου έχουν μια θετική επίδραση στην<br />
καθημερινή πρακτική του εργαστηρίου καθώς βελτιώνεται ο τρόπος<br />
εργασίας 29-30 , μειώνεται η κόπωση, και αυξάνεται η απόδοση. Σε μερικές<br />
έρευνες έχει σημειωθεί περίπου 70% μείωση της εξεταζόμενης επιφάνειας<br />
ανά αρνητικό επίχρισμα 31-32 . Αυτό συνεπάγει μια γενική αύξηση της<br />
παραγωγικότητας του εργαστηρίου και επίσης δεν χάνεται πολύτιμος χρόνος<br />
ελέγχοντας φυσιολογικά επιχρίσματα αλλά αντιθέτως ο χρόνος αυτός<br />
αφιερώνεται στα επιχρίσματα μεγαλύτερης σημασίας και σε σημεία εκείνων<br />
που έχουν αναγνωριστεί ως δυνητικά μη φυσιολογικά.<br />
Το ThinPrep Imaging System αποτελείται από δύο κύρια<br />
εξαρτήματα τον επεξεργαστή εικόνας και το μικροσκόπιο εξέτασης των<br />
επιχρισμάτων. Το σύστημα μπορεί να επεξεργαστεί μόνο ThinPrep<br />
παρασκευάσματα τα οποία τοποθετούνται στις «κασέτες» του επεξεργαστή<br />
(1 κασέτα δέχεται 25 πλακίδια, κάθε επεξεργαστής δέχεται 10 κασέτες). Ο<br />
επεξεργαστής μπορεί να «διαβάσει» πάνω από 300 επιχρίσματα την ημέρα<br />
αναγνωρίζοντας σε κάθε επίχρισμα 22 οπτικά πεδία (ΟΠ) με βάση διάφορα<br />
χαρακτηριστικά. Κατά την πλοήγηση του επεξεργαστή στα 22 ΟΠ εάν δεν<br />
αναγνωριστούν μη φυσιολογικά στοιχεία τότε το επίχρισμα δεν<br />
επανεξετάζεται. Εάν όμως υπάρχουν μη φυσιολογικά στοιχεία σε ένα<br />
τουλάχιστον ΟΠ τότε το επίχρισμα επανεξετάζεται από τους τεχνολόγους<br />
μέσω του συστήματος μικροσκόπηση το οποίο συνδέεται ηλεκτρονικά με τον<br />
επεξεργαστή. Τα αντικείμενα ενδιαφέροντος εντοπίζονται και επισημάνονται<br />
ηλεκτρονικά από το σύστημα (εικόνα 2.21), είτε μπορεί να γίνει με φυσικό<br />
τρόπο από τους τεχνολόγους.<br />
Το BD FocalPoint GS * Imaging System έχει την ίδια λειτουργική<br />
φιλοσοφία με το ThinPrep Imaging System. Το σύστημα επεξεργάζεται μόνο<br />
κολποτραχηλικά επιχρίσματα SurePath τα οποία καθώς τα σκανάρει (έναένα)<br />
αναγνωρίζει 10 ΟΠ στο επίχρισμα που έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να<br />
περιέχουν αλλοιώσεις. Στην συνέχεια τα πεδία αυτά ελέγχονται μικροσκοπικά<br />
από τους τεχνολόγους και αν βρεθεί οποιαδήποτε ανωμαλία τότε<br />
επανεξετάζεται ολόκληρο το επίχρισμα. Σύμφωνα με τον κατασκευαστή το<br />
FocalPoint GS Imaging System μπορεί αν επεξεργαστεί 170 επιχρίσματα σε<br />
8 ώρες. Καθώς έχει εγκριθεί πρόσφατα σχετικά από το FDA, δεν υπάρχουν<br />
αρκετές μελέτες σχετικές με την απόδοσή του, όμως μέχρι τώρα έχει βρεθεί<br />
ότι τα ποσοστά εξέτασης επιχρισμάτων έχουν αυξηθεί κατά 31%, έχει<br />
σημειωθεί αύξηση της ευαισθησίας και μείωση της ειδικότητας για την<br />
ανίχνευση LSIL+ και HSIL+, και επίσης η αναλογία ASCUS:SIL έχει μειωθεί<br />
σημαντικά 33 . Βέβαια μια πιο πρόσφατη έρευνα 34 έδειξε υψηλότερα ποσοστά<br />
εύρεσης LSIL και ASCUS καθώς και καντιτίασης και βακτηριακής κολπίτιδας.<br />
Στην έρευνα αυτή η αναλογία ASCUS:SIL αυξήθηκε με την χρήση του<br />
FocalPoint GS Imaging System (από 1,4 σε 1,9) σε αντίθεση με την<br />
* GS = guided screening.<br />
34
προηγούμενη έρευνα. Ένα σημαντικό εύρημα αυτής της έρευνας ήταν η<br />
μείωση στα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα σε σχέση με τα αναμενόμενα<br />
ποσοστά. Χρειάζονται και άλλες μελέτες για να προσδιοριστεί η απόδοση του<br />
συστήματος, το οποίο μέχρι τώρα φαίνεται να είναι ένα πολλά υποσχόμενο<br />
εργαλείο για την αξιολόγηση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων σε πληθυσμό<br />
χαμηλού κινδύνου.<br />
Με την χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων στην<br />
πρωτοβάθμια εξέταση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων δεν<br />
εξαλείφονται τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα, τα οποία συνεχίζουν να<br />
απαντούν στην καθημερινή πρακτική αλλά σε μικρότερο βαθμό 30 .<br />
35
33 ΠΠΛΛΕΕΟΟΝΝΕΕΚΚΤΤΗΗΜΜΑΑΤΤΑΑ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ<br />
ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ<br />
Η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης (ΚΥΦ) έχει σημειώσει παγκόσμια<br />
επιτυχία. Ολοένα και περισσότερα εργαστήρια έχουν αλλάξει τον τρόπο<br />
παρασκευής και επεξεργασίας επιχρισμάτων από την συμβατική μέθοδο<br />
στην μέθοδο ΚΥΦ. Περισσότερο από το 90% των επιχρισμάτων στις<br />
Ηνωμένες Πολιτείες έχουν συλλεχθεί και επεξεργαστεί με την μέθοδο ΚΥΦ,<br />
ενώ χώρες όπως η Γαλλία, το Ηνωμένο Βασίλειο, ο Καναδάς (Οντάριο),<br />
έχουν υιοθετήσει πλήρως την τεχνολογία της κυτταρολογίας υγρής φάσης.<br />
Αυτή η μεταβολή από την συμβατική κυτταρολογία στην ΚΥΦ σημειώθηκε<br />
βάση μιας σειράς βελτιώσεων που έφερε η μέθοδος ΚΥΦ όπως η βελτίωση<br />
στην ποιότητα δείγματος, στην επαναληψιμότητα ή αναπαραγωγιμότητα,<br />
στην ευαισθησία και στην ειδικότητα καθώς και την ικανότητά του να<br />
εκτελούνται, μοριακές εξετάσεις.<br />
Η ανταπόκριση που είχε η μέθοδος αυτή οφειλόταν στα<br />
πλεονεκτήματά της τα οποία είναι:<br />
Η άμεση μονιμοποίηση, με την οποία επιτυγχάνεται η διατήρηση των<br />
λεπτομερειών του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος στην καλύτερη<br />
δυνατή κατάσταση.<br />
Όλο το υλικό που συλλέγεται είναι διαθέσιμο για μικροσκοπική<br />
αξιολόγηση<br />
Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα προετοιμάζεται για την κυτταρολογική<br />
αξιολόγηση, αλλά ανάλογα με τις ανάγκες, πολλαπλάσια δείγματα<br />
μπορούν να προετοιμαστούν από το ίδιο φιαλίδιο.<br />
Το καθαρό υπόστρωμα, με αυτό τον τρόπο τα επιθηλιακά κύτταρα<br />
που έχουν ενδιαφέρον είναι λιγότερο πιθανό να «κρυφτούν».<br />
Τα τυχαιοποιημένα κύτταρα επιστρώνονται σε ένα λεπτό στρώμα<br />
πάνω σε μια σταθερή περιοχή του πλακιδίου. Η περιοχή που<br />
καλύπτεται είναι μικρή και ο χρόνος που απαιτείται για την εξέταση του<br />
είναι μικρότερος από αυτόν που απαιτείται για την εξέταση<br />
συμβατικών παρασκευασμάτων.<br />
Μείωση στα ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων.<br />
36
Η δυνατότητα εφαρμογής μοριακών εξετάσεων όπως HPV τεστ,<br />
έλεγχο για γονόρροια και χλαμύδια.<br />
Δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης των δειγμάτων.<br />
Η μεταβολή στην ΚΥΦ έγινε βάση εκατοντάδων ερευνών που έχουν<br />
διενεργηθεί και έχουν μελετήσει την αποτελεσματικότητα της κυτταρολογίας<br />
υγρής φάσης εξετάζοντας παράγοντες όπως η ευαισθησία και η ειδικότητα,<br />
την δυνατότητα εφαρμογής πολλαπλών εξετάσεων από το ίδιο δείγμα, τα<br />
ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων, τη δυνατότητα αυτοματοποιημένης<br />
ανάλυσης και η εφαρμογή μοριακών εξετάσεων.<br />
3.1 Απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης<br />
3.1.1 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων<br />
Σκοπός της κυτταρολογίας υγρής φάσης είναι να αντικαταστήσει την<br />
συμβατική κυτταρολογία και να αποτελεί την μοναδική μέθοδο ανίχνευσης<br />
άτυπων κυττάρων, του καρκίνου του τραχήλου ή τον προκαρκινικών<br />
αλλοιώσεων (LSIL και HSIL) συν άλλων κατηγοριών.<br />
3.1.1.1 Δημοσιευμένες έρευνες και στοιχεία που υποστηρίζουν την<br />
χρήση της κυτταρολογίας υγρής φάσης στην κλινική πράξη<br />
Από τότε που το FDA ενέκρινε το ThinPrep Pap Test ακολούθησε<br />
μια πληθώρα ανεξάρτητων μεταναλύσεων οι οποίες σύγκριναν την κλινική<br />
απόδοση της μεθόδου ΚΥΦ με την συμβατική μέθοδο. Οι μελέτες<br />
αξιολόγησαν ίδιους συντελεστές απόδοσης για την σύγκριση των δυο<br />
τεχνολογιών, όπως τα ποσοστά μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων και τα<br />
ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS, LSIL και HSIL.<br />
Επειδή οι διάφορες τεχνολογίες της κυτταρολογίας υγρής φάσης<br />
χρησιμοποιούν και διαφορετικές μεθοδολογίες, η ανάλυση μιας<br />
συγκεκριμένης τεχνολογίας ΚΥΦ σε σύγκριση με την συμβατική μέθοδο ήταν<br />
αποτελεσματικότερη περισσότερο αντιπροσωπευτική. Έτσι οι έρευνες που<br />
37
διενεργήθηκαν από τους Abulafia και συνεργάτες 35 , και Bernstein και<br />
συνάδελφοι 36 αξιολόγησαν την απόδοση του ThinPrep Pap test μόνο και<br />
ανέδειξαν σημαντική βελτίωση ως προς τα ποσοστά ανίχνευσης των LSIL και<br />
HSIL σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία. Οι Klinkhamer και<br />
συνάδεολφοι 37 δήλωσαν ότι χρειάζονται περισσότερες έρευνες για να<br />
αναλυθεί και να ερμηνευτεί η απόδοση της τεχνολογίας SurePath, το<br />
ThinPrep Pap test έδειξε μια συνεχή βελτίωση σε σύγκριση με την συμβατική<br />
κυτταρολογία ως προς την ανίχνευση των LSIL και HSIL.<br />
Επιπλέον μεταναλύσεις 8,38 αξιολόγησαν την απόδοση διάφορων<br />
τεχνολογιών της ΚΥΦ σε σχέση με την συμβατική κυτταρολογία. Οι έρευνες<br />
αυτές, που συμπεριέλαβαν τις τεχνολογίες ΚΥΦ στο σύνολο τους,<br />
αποφάνθηκαν ότι η απόδοση της ΚΥΦ δεν είναι βέλτιστη της συμβατικής<br />
κυτταρολογίας. Οι λεπτομέρειες από αυτές τις έρευνες φαίνονται στον πίνακα<br />
3.1.<br />
Μελέτη Τεχνολογία ΚΥΦ Αποτελέσματα μελέτης<br />
(ΚΥΦ έναντι ΣΚ)<br />
Nanda και<br />
συν. 6<br />
ThinPrep Υψηλότερη ευαισθησία για την ΚΥΦ όμως<br />
μελετήθηκαν μόνο 3 έρευνες<br />
Payne και<br />
συν. 3<br />
ThinPrep/SurePath Μερικά αποτελέσματα έδειξαν βελτίωση της<br />
ευαισθησίας της μεθόδου ΚΥΦ<br />
Bernstein<br />
και συν. 36<br />
ThinPrep Η ΤΡ ίδια με την ΣΚ ως προς την διάγνωση<br />
ASCUS (95% CI, 0.99-1.06) και καλύτερη από<br />
την ΣΚ για την διάγνωση LSIL (95% CI, 2.05-<br />
2.26) και HSIL (95% CI, 2.06-2.47)<br />
Hartmann<br />
και συν. 39<br />
ThinPrep/SurePath Προς το παρόν τα στοιχεία είναι ανεπαρκή για<br />
να εκτιμηθεί εάν η ΚΥΦ είναι καλύτερη της ΣΚ<br />
Sulik και<br />
συν. 40<br />
ThinPrep/SurePath Η ΚΥΦ έδειξε υψηλότερη ευαισθησία (90%;<br />
95% CI 77–96%) από ότι η ΣΚ (79%; 95%<br />
CI:59–91%) για την ανίχνευση CIN2 και CIN+<br />
Abulafia και<br />
συν. 35<br />
ThinPrep Η ευαισθησία του TP ήταν 76% ενάντια της ΣΚ<br />
που ήταν 68%<br />
Η ειδικότητα του TP ήταν 86% ενάντια της ΣΚ<br />
που ήταν 79%<br />
Klinkhamer<br />
και συν. 37<br />
ThinPrep/SurePath Η ευαισθησία ως προς την ανίχνευση ASCUS ή<br />
ASCUS+ ήταν χαμηλότερη σε σχέση με την ΣΚ<br />
για το σύστημα SP.<br />
Λόγω αντικρουόμενων αποτελεσμάτων δεν<br />
υπήρχε κατάληξη ως προς την ανίχνευση LSIL,<br />
HSIL ή σοβαρότερου βαθμού με την SP.<br />
Καλύτερη ευαισθησία για το TP για την<br />
ανίχνευση ASC ή ASC+ και LSIL ή LSIL+ σε<br />
σύγκριση με την ΣΚ<br />
Πιθανόν η ΤΡ έχει υψηλότερα ποσοστά θετικών<br />
αποτελεσμάτων και μεγαλύτερη απόλυτη<br />
ευαισθησία για την ανίχνευση HSIL<br />
38
συνέχεια<br />
Arbyn και<br />
συν. 41<br />
Davey και<br />
συν. 8<br />
Arbyn και<br />
συν 38<br />
ThinPrep/SurePath Ανευρέθηκαν περισσότερα LSIL σε<br />
παρασκευάσματα ΚΥΦ παρά ΣΚ<br />
Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά ως προς τα<br />
ποσοστά θετικότητας για ASCUS και HSIL<br />
Ανιχνεύτηκαν περισσότερα LSIL σε ΚΥΦ<br />
παρασκευάσματα: 80% (95% CI 52–112%) ΤΡ<br />
και 54% (95% CI 25–90%) SP<br />
Ανιχνεύτηκαν περισσότερα HSIL σε ΚΥΦ<br />
παρασκευάσματα: 72% (95% CI 42–108%) ΤΡ<br />
και 47% (95% CI 14–89%) SP<br />
Δεν σημειώθηκε μείωση στην θετική<br />
προγνωστική αξία της ΚΥΦ έναντι της ΣΚ<br />
ThinPrep/SurePath Δεν σημειώθηκαν διαφορές στα μη ικανοποιητικά<br />
παρασκευάσματα μεταξύ των δύο μεθόδων<br />
Η ΚΥΦ ανίχνευσε περισσότερα HSIL δείγματα<br />
από ότι η ΣΚ<br />
ThinPrep/SurePath Η ευαισθησία για την ανίχνευση ASCUS, LSIL<br />
και HSIL δεν είχε σημαντική διαφορά με την ΣΚ<br />
Η ειδικότητα για την ανίχνευση LSIL και HSIL<br />
βρέθηκε να είναι στα ίδια ποσοστά μεταξύ ΚΥΦ<br />
και ΣΚ<br />
Ενώ η ειδικότητα για ASCUS ήταν χαμηλότερη<br />
στην ΚΥΦ από ότι στην ΣΚ<br />
Πίνακας 3.1 Μεταναλύσεις οι οποίες συγκρίνουν την ΚΥΦ με την συμβατική κυτταρολογία<br />
για την ανίχνευση τραχηλικών αλλοιώσεων.<br />
Διευκρινίσεις:<br />
ΣΚ=συμβατική κυτταρολογία, ΤΡ=ThinPrep, SP=SurePath, + =αλλοίωση σοβαρότερου<br />
βαθμού<br />
HSIL (high grade squamous intraepithelial lesion) = Πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές βλάβες<br />
υψηλού βαθμού.<br />
LSIL (low grade squamous intraepithelial lesion) = Πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές βλάβες<br />
χαμηλού βαθμού.<br />
SIL (squamous intraepithelial lesion) = Πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές βλάβες.<br />
ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) = Άτυπα πλακώδη κύτταρα<br />
απροσδιορίστου σημασίας.<br />
CIN (cervical intraepithelial neoplasia) = Τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία.<br />
Από μια άλλη έρευνα 42 η οποία αξιολόγησε την απόδοση της ΚΥΦ,<br />
βασισμένη στην μέχρι τότε βιβλιογραφία, παρουσιάστηκαν τα εξής ευρήματα:<br />
η ΚΥΦ ανίχνευσε περισσότερα LSIL δείγματα από ότι η συμβατική<br />
κυτταρολογία σε 17 από τις 21 έρευνες που αξιολόγησαν την ThinPrep<br />
μέθοδο και σε 9 από τις 12 έρευνες που αξιολόγησαν την SurePath μέθοδο.<br />
Περισσότερα δείγματα HSIL ανιχνεύτηκαν σε 4 από 6 ThinPrep έρευνες και<br />
σε 1 από 2 SurePath έρευνες σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία.<br />
Όλες αυτές οι έρευνες χρησιμοποιούσαν την μεθοδολογία «διαχωρισμού<br />
39
δείγματος» * (split sample). Ενώ, σε όλες τις 15 έρευνες που<br />
χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία «απευθείας στο φιαλίδιο» † (direct to vial)<br />
ανιχνεύτηκαν περισσότερα LSIL+ δείγματα με την ΚΥΦ παρά με την<br />
συμβατική κυτταρολογία και σε όλες τις 8 έρευνες που αξιολόγησαν τα<br />
ποσοστά αναφοράς για HSIL+, η ΚΥΦ έδειξε αυξημένα ποσοστά ερμηνείας<br />
τέτοιων δειγμάτων.<br />
Η έρευνα αξιολόγησε επίσης την ευαισθησία και ειδικότητα της<br />
μεθόδου ΚΥΦ. Από τα ευρήματα φάνηκε ότι η συνολική ευαισθησία της<br />
συμβατικής μεθόδου ήταν 71,5% ενώ της ΚΥΦ 80,1%. Έμμεση σύγκριση<br />
μεταξύ των δύο μεθόδων (ΚΥΦ και συμβατική κυτταρολογία) δεν ανίχνευσε<br />
διαφορές στην ευαισθησία, επίσης και μια μετανάλυση που συμπεριλάμβανε<br />
6 έρευνες, οι οποίες μελετούσαν την ειδικότητα των δύο μεθόδων, δεν<br />
ανέδειξε διαφορά ως προς την ακρίβεια της μεθόδου.<br />
ΚΥΦ / Συμβατική κυτταρολογία<br />
HSIL+<br />
LSIL+<br />
ASCUS+<br />
Ευαισθησία 57,1/55,2 79,1/75,6 90,4/88,2<br />
Ειδικότητα 97/96,7 78,8/81,2 64,6/71,3<br />
Πίνακας 3.2 Αποτελέσματα από τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες μελέτες που συγκρίνουν την<br />
ευαισθησία και την ειδικότητα της ΚΥΦ με την συμβατική κυτταρολογία 38 . Η<br />
ανίχνευση των HSIL δεν φαίνεται να βελτιώνεται με την ΚΥΦ.<br />
3.1.1.2 Έρευνες του Κολλεγίου των Αμερικανών Παθολόγων<br />
Το Κολλέγιο των Αμερικανών Παθολόγων, ΚΑΠ (College of<br />
American Pathologists) είναι ένας οργανισμός ο οποίος συνεργάζεται με<br />
εκατοντάδες εργαστήρια ανά τον κόσμο, κυρίως στις ΗΠΑ, με σκοπό να<br />
παρέχει προγράμματα διασφάλισης ποιότητας στα κλινικά εργαστήρια. Τα<br />
προγράμματα αυτά βασίζονται στην συγκέντρωση δεδομένα από όλα τα<br />
εργαστήρια με απώτερο σκοπό την θέσπιση σημείων αναφοράς των<br />
* Στις έρευνες «διαχωρισμού δείγματος» το δείγμα αφού συλλεχθεί από την ασθενή πρώτα<br />
επιστρώνεται σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα ώστε να παρασκευαστεί επίχρισμα συμβατικής<br />
κυτταρολογίας και ύστερα το υπολειπόμενο δείγμα χρησιμοποιείται για την παρασκευή<br />
επιχρίσματος ΚΥΦ. Με αυτόν τον τρόπο όμως θεωρείται ότι μειώνεται η απόδοση της ΚΥΦ.<br />
† Στις έρευνες «απευθείας στο φιαλίδιο» το δείγμα αφού συλλεχθεί από την ασθενή<br />
μεταφέρεται αμέσως στο φιαλίδιο με συντηρητικό υγρό για την παρασκευή επιχρισμάτων<br />
ΚΥΦ. Οι έρευνες που χρησιμοποιούν αυτή την μεθοδολογία είναι πιο αντιπροσωπευτικές<br />
των επιδόσεων της ΚΥΦ.<br />
40
πρακτικών ποιότητας με στόχο την συνεχή βελτίωση της ποιότητας στα<br />
κλινικά εργαστήρια.<br />
Πρόσφατα το ΚΑΠ διενήργησε μια έρευνα 43 για την αξιολόγηση των<br />
πρότυπων πρακτικών στα προγράμματα τραχηλικής κυτταρολογίας. Αυτές οι<br />
έρευνες αποτέλεσαν την βάση για την θέσπιση σημείων αναφοράς στο<br />
πρόγραμμα του ΚΑΠ για την διαπίστευση των εργαστηρίων. Το αντικείμενο<br />
της έρευνας ήταν η αξιολόγηση στις αλλαγές των πρακτικών των<br />
εργαστηρίων κυτταρολογίας, η ανάλυση και η υιοθέτηση νέων τεχνολογιών<br />
και ο καθορισμός των ποσοστών αναφοράς που συμπεριλαμβάνουν την<br />
κυτταρολογία υγρής φάσης. Στην έρευνα συμμετείχαν 679 εργαστήρια τα<br />
περισσότερα εκ των οποίων χρησιμοποιούσαν είτε την ThinPrep μέθοδο είτε<br />
την SurePath μέθοδο. Στα εργαστήρια ζητήθηκε να υποβάλουν τα δεδομένα<br />
του έτους 2006, σύμφωνα με το σύστημα Bethesda 2001, για την συμβατική<br />
κυτταρολογία και την ΚΥΦ, και στην συνέχεια τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν<br />
με αυτά του έτους 2003. Συνολικά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε μια<br />
τα εργαστήρια τα οποία χρησιμοποιούσαν μόνο την συμβατική μέθοδο για<br />
την παρασκευή κολποτραχηλικών επιχρισμάτων μειώθηκαν (24.4% έναντι<br />
13.7%) και ανάλογα σημειώθηκε αύξηση στα ποσοστά των εργαστηρίων που<br />
χρησιμοποιούσαν την μέθοδο ΚΥΦ (9.3% έναντι 25.5%). Από τα εργαστήρια<br />
τα οποία ανέφεραν ότι χρησιμοποιούν την ΚΥΦ (n = 587), περίπου το 70%<br />
(411/587) χρησιμοποιούσαν την μέθοδο ThinPrep ενώ το υπόλοιπο 30%<br />
(176/587) χρησιμοποιούσαν την μέθοδο SurePath.<br />
Στον πίνακα 3.3 παρουσιάζεται η συνολική επίδοση των<br />
εργαστηρίων χρησιμοποιώντας τον μέσο (50 ο εκατοστημόριο) των ποσοστών<br />
των εργαστηριακών αναφορών για κάθε κυτταρολογικό εύρημα ASCUS, LSIL<br />
και HSIL ανά κυτταρολογική μέθοδο. O μέσος των ποσοστών ανίχνευσης<br />
LSIL για το SurePath Pap test (2,5%) και για το ThinPrep Pap test (3,0%)<br />
ήταν σημαντικά υψηλότερα από τον μέσο των ποσοστών ανίχνευσης LSIL με<br />
την συμβατική κυτταρολογία (1,3% , Ρ
Συμβατικά SurePath<br />
ThinPrep<br />
Κατηγορία παρασκευάσματα παρασκευάσματα παρασκευάσματα<br />
ASCUS 2,4 4,1 4,9<br />
LSIL 1,3 2,5 3,0<br />
HSIL 0,3 0,3 0,6<br />
Μη ικανοποιητικά 1,0 0,3 1,1<br />
Πίνακας 3.3 Μέσος ποσοστών των εργαστηριακών αναφορών (50 ο εκατοστημόριο)<br />
για τις τέσσερις μεγάλες κυτταρολογικές κατηγορίες κολποτραχηλικών<br />
επιχρισμάτων συμβατικής κυτταρολογίας, SurePath και ThinPrep.<br />
3.1.1.3 Βασικές μελέτες (pivotal studies) σύγκρισης των τεχνολογιών<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης με την συμβατική κυτταρολογία<br />
ThinPrep Pap test<br />
Μια βασική μελέτη 44 που αξιολογούσε την μέθοδο ThinPrep έδειξε<br />
ότι το τεστ αυτό προσέφερε 65% αύξηση (Ρ
στα ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS 75,1% , LSIL 107,2% και HSIL 64,4%<br />
(Ρ
διάγνωση αναφοράς: 92% για συμβατικά παρασκευάσματα, 94,6% για<br />
SurePath και 96,5% για ThinPrep).<br />
Μια μεγάλη έρευνα 60 (n=1118) που διενεργήθηκε ειδικά για<br />
κυτταρολογικά δείγματα χοληδόχου πόρου και παγκρέατος, τα οποία<br />
συλλέχθηκαν με βουρτσάκι, ανέδειξε την στατιστικά σημαντική διαφορά στην<br />
ευαισθησία και την ακρίβεια των δειγμάτων ThinPrep σε σχέση με άλλου<br />
τύπου παρασκευάσματα (ευαισθησία: 59,7% έναντι 28,1% αντίστοιχα,<br />
ακρίβεια: 78,8% έναντι 68,2% αντίστοιχα). Άλλες αντίστοιχες αλλά μικρότερες<br />
έρευνες 61-62 απέτυχαν να αποδείξουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά<br />
μεταξύ της ΚΥΦ και συμβατικών παρασκευασμάτων αλλά όμως<br />
διευκρινίσθηκε ότι η προτιμότερη μέθοδος εξέτασης των δειγμάτων ήταν η<br />
ΚΥΦ λόγω της ενισχυμένης εμφάνισης των μορφολογικών χαρακτηριστικών<br />
των κυττάρων. Επίσης σε μια έρευνα που συμπεριλάμβανε 98 κυτταρολογικά<br />
δείγματα χολής, οι Minamiguchi και συνάδελφοι 63 βρήκαν χαμηλότερα<br />
ποσοστά ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων σε ThinPrep παρασκευάσματα<br />
χολής από ότι σε συμβατικά παρασκευάσματα.<br />
Πρόσφατες έρευνες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι η<br />
διαγνωστική ακρίβεια της ΚΥΦ και της συμβατικής κυτταρολογίας είναι<br />
παρόμοια όσον αφορά την αξιολόγηση δειγμάτων μαστού από FNAΒ. Οι Dey<br />
P και συνεργάτες 64 έδειξαν ότι τα παρασκευάσματα μαστού ΚΥΦ<br />
παρουσιάζουν καλά μονιμοποιημένα κύτταρα, καθαρό υπόστρωμα,<br />
διατηρώντας όμως παράλληλα όλα τα χαρακτηριστικά του που κάνουν την<br />
διάγνωση του καρκίνου ή του ινοαδενώματος δυνατή. Όμως οι Bédard YC<br />
και συνεργάτες 65 μελετώντας 7464 δείγματα μαστού από FNAB για να<br />
συγκρίνουν τις δύο μεθόδους κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι δύο μέθοδοι<br />
δεν παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές ως προς την ακρίβεια.<br />
Μια άλλη μεγάλη έρευνα 66 που μελετούσε κυτταρολογικά δείγματα<br />
αναπνευστικού συστήματος επίσης συμπέρανε ότι δεν υπάρχει στατιστικά<br />
σημαντική διαφορά ως προς την ακρίβεια μεταξύ των δύο μεθόδων, όμως η<br />
ΚΥΦ βρέθηκε να ευνοείται λόγω τεχνικών χαρακτηριστικών όπως το καθαρό<br />
υπόστρωμα, η καλή μονιμοποίηση των κυττάρων και η ομοιόμορφη<br />
κατανομή τους στο επίχρισμα, στοιχεία που έκαναν την διάγνωση πιο<br />
εύκολη. Η έρευνα των Cochand-Priollet και συνεργατών 67 έδειξε ότι η<br />
ακρίβεια της συμβατικής μεθόδου ήταν ανώτερη της ΚΥΦ σε δείγματα<br />
θυρεοειδούς από FNA καθώς οι τεχνολόγοι δυσκολεύτηκαν να ερμηνεύσουν<br />
διάφορα ευρήματα στα επιχρίσματα ΚΥΦ.<br />
3.1.3 Συμπέρασμα<br />
Γενικά από τις διάφορες μεταναλύσεις η κυτταρολογία υγρής φάσης<br />
έχει δείξει να έχει καλύτερη απόδοση από την συμβατική κυτταρολογία.<br />
Συνολικά η ακρίβεια της μεθόδου φαίνεται να είναι καλύτερη από της<br />
συμβατικής μεθόδου σημειώνοντας αύξηση στην ευαισθησία, ενώ η<br />
44
ειδικότητα είτε παραμένει στα ίδια επίπεδα είτε έχει αυξηθεί. Τα ποσοστά<br />
ανίχνευσης των χαμηλού βαθμού αλλοιώσεων του πλακώδους επιθηλίου<br />
έχουν αυξηθεί σημαντικά με την χρήση της ΚΥΦ, όπως επίσης και τα<br />
ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS. Όμως όσον αφορά την ανίχνευση των<br />
HSIL τα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων σε αυτή την<br />
κατηγορία φαίνεται να είναι υψηλότερα σε σχέση με τις άλλες κατηγορίες,<br />
πράγμα που υποδηλώνει μια δυσκολία στην αναγνώριση αυτών των<br />
κυττάρων. Αυτό ίσως να οφείλεται στην διαφορετική εμφάνιση και στην<br />
παρουσία άλλων ιδιαίτερων χαρακτηριστικών των HSIL σε παρασκευάσματα<br />
ΚΥΦ σε σχέση με τα συμβατικά παρασκευάσματα 68 . Ωστόσο όμως, η<br />
μέθοδος έχει παρουσιάσει συνολική μείωση στα ποσοστά των ψευδοαρνητικών<br />
αποτελεσμάτων 68-69 . Γενικά η ΚΥΦ έχει δείξει υψηλότερη θετική<br />
προγνωστική αξία (ppv) από ότι η συμβατική κυτταρολογία.<br />
Επίσης και στα δείγματα μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας η<br />
ακρίβεια της ΚΥΦ φάνηκε να είναι, τις περισσότερες φορές, ανώτερη της<br />
συμβατικής κυτταρολογίας, σημειώνοντας υψηλότερα ποσοστά ακριβής<br />
διάγνωσης και συμφωνίας με τα αποτελέσματα αναφοράς σε διάφορες<br />
έρευνες, αυξάνοντας έτσι την ευαισθησία και την ειδικότητα της μεθόδου,<br />
μόνο όμως σε εκείνες τις περιπτώσεις που ο κυτταροπαθολόγος έχει επαρκή<br />
εκπαίδευση και εμπειρία με την ΚΥΦ 70 .<br />
3.2 Επάρκεια δειγμάτων<br />
Η αξιολόγηση της επάρκειας των δειγμάτων θεωρείται από πολλούς<br />
ως το σημαντικότερο στοιχείο του προγράμματος διασφάλισης ποιότητας του<br />
συστήματος Bethesda.<br />
Για να ερμηνευτεί σωστά ένα κολποτραχηλικό επίχρισμα θα πρέπει<br />
να περιλαμβάνει επαρκή αριθμό κυττάρων του πλακώδους επιθηλίου.<br />
Σύμφωνα με το σύστημα Bethesda λοιπόν τα συμβατά επιχρίσματα πρέπει<br />
να περιέχουν 8000-12000 ορατά και καλά διατηρημένα πλακώδη επιθηλιακά<br />
κύτταρα ενώ, ένα κολποτραχηλικό επίχρισμα ΚΥΦ πρέπει να περιέχει<br />
τουλάχιστον 5000 ορατά και καλά διατηρημένα πλακώδη επιθηλιακά<br />
κύτταρα για να θεωρηθεί επαρκές. Ο αριθμός αυτός έχει προκύψει βάση<br />
μελετών οι οποίες έδειξαν ότι σε επιχρίσματα με λιγότερο αριθμό κυττάρων<br />
είναι λιγότερο πιθανό να ανευρεθούν μη φυσιολογικά κύτταρα 71-73 . Παρόλα<br />
αυτά, μια προκαταρτική μελέτη, η οποία περιλαμβάνεται στις κατευθυντήριες<br />
γραμμές του συστήματος Bethesda, έδειξε ότι είναι λιγότερο πιθανό να<br />
ανευρεθούν μη φυσιολογικά κύτταρα σε επίχρισμα ΚΥΦ του οποίου ο<br />
συνολικός αριθμός κυττάρων του δεν υπερβαίνει τα 20 000 74 . Έχοντας<br />
υπόψη αυτή την έρευνα, το σύστημα Bethesda επιτρέπει, για τα επιχρίσματα<br />
που ο αριθμός κυττάρων κυμαίνεται από 5 000 έως 20 000, ένα «σχόλιο ως<br />
δείκτη ποιότητας» στις εκθέσεις αναφοράς όπου οι κλινικοί γιατροί είναι αυτοί<br />
που αποφασίζουν εάν είναι απαραίτητη η επανάληψη της εξέτασης 71 .<br />
45
Επίσης, οι McQueen και Duval 75 κατά την έρευνά τους έδειξαν ότι σε ένα<br />
επίχρισμα ΚΥΦ πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 87 άτυπα κύτταρα ώστε η<br />
ανίχνευσή τους να γίνει με βεβαιότητα. Όμως σύμφωνα με μαθηματικές<br />
πράξεις αυτό είναι δυνατό μόνο σε επιχρίσματα με αριθμό κυττάρων<br />
τουλάχιστον 10 000. Παρόλα αυτά η πλειοψηφία των εργαστηρίων που<br />
χρησιμοποιούν την μέθοδο κυτταρολογίας υγρής φάσης έχουν υιοθετήσει το<br />
σύστημα Bethesda για την αναφορά των αποτελεσμάτων τους.<br />
Άλλοι παράγοντες που μπορεί να καθιστούν ένα δείγμα ανεπαρκές<br />
(ή μη ικανοποιητικό) είναι η παρουσία υπερβολικού αριθμού<br />
ερυθροκυττάρων ή φλεγμονωδών στοιχείων τα οποία προκαλούν συσκότιση<br />
αποκρύπτοντας πολλές φορές τα μη φυσιολογικά κύτταρα. Επίσης η<br />
απουσία κυττάρων της ζώνης μετάπτωσης καθιστά το δείγμα κατά Bethesda<br />
«ικανοποιητικό αλλά περιορισμένο» κατά το οποίο το δείγμα ελέγχεται αλλά<br />
σημειώνεται ότι δεν υπάρχουν ενδοτραχηλικά κύτταρα.<br />
3.2.1 Ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων και οι αιτίες που τα<br />
προκαλούν<br />
Ενώ πολλές έρευνες, συγκρίνοντας την Κυτταρολογίας Υγρής<br />
Φάσης με την συμβατική κυτταρολογία, υποστηρίζουν ότι η ακρίβεια μεταξύ<br />
των δύο μεθόδων είναι ίδια, η μείωση στα ποσοστά των μη ικανοποιητικών<br />
δειγμάτων με την χρήση της ΚΥΦ αποτελεί ένα αδιάσειστο πλεονέκτημα της<br />
μεθόδου σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία.<br />
Σε περίπτωση μη ικανοποιητικών δειγμάτων ο έλεγχος των<br />
επιχρισμάτων δεν μπορεί να ολοκληρωθεί με αποτέλεσμα να προκαλείται<br />
άγχος και δυσφορία στις γυναίκες ασθενείς και επίσης να σπαταλούνται<br />
αναλώσιμα υλικά πράγμα που έχει οικονομικό αντίκτυπο στο εργαστήριο και<br />
στους ασθενείς. Η ΚΥΦ μειώνει τα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων<br />
μειώνοντας τον αριθμό των περιπτώσεων που είναι ανεπαρκή λόγω<br />
φλεγμονωδών στοιχείων και αίματος που επισκιάζουν το επίχρισμα, και λόγω<br />
ανομοιογενούς κατανομής των κυττάρων ή κακής μονιμοποίησής τους.<br />
Ο κύριος λόγος μη ικανοποιητικών δειγμάτων φαίνεται να είναι ο<br />
ανεπαρκής αριθμός κυττάρων, πράγμα που αποδεικνύεται από πολλές<br />
έρευνες. Οι Siebers και συνεργάτες 76 βρήκαν ότι με την χρήση της ΚΥΦ<br />
σημειώθηκε σημαντική βελτίωση στην επάρκεια των δειγμάτων, με την ΚΥΦ<br />
να σημειώνει μείωση του ποσοστού των μη ικανοποιητικών δειγμάτων από<br />
1,1% (συμβατικά παρασκευάσματα) σε 0,3%, ενώ όσον αφορά τα δείγματα<br />
τα οποία δεν έφεραν ενδοτραχηλικά κύτταρα βρέθηκε να σημειώθηκε αύξηση<br />
κατά 22% συγκρίνοντας με την συμβατική μέθοδο. Επίσης η έρευνα απέδειξε<br />
ότι ο κύριος λόγος μη ικανοποιητικών δειγμάτων αποτελεί η εύρεση<br />
ανεπαρκούς αριθμού κυττάρων στο επίχρισμα, και με την χρήση της ΚΥΦ<br />
46
Κατάταξη δείγματος<br />
Μη ικανοποιητικό<br />
Αίμα<br />
Φλεγμονώδη στοιχεία<br />
Ανεπαρκής αρ. κυττάρων<br />
Ανεπαρκής μονιμοποίηση<br />
Μηχανική βλάβη<br />
Κυτταρόλυση<br />
Λεπτές περιοχές<br />
Λιγοστά πλακώδη κύτταρα, υπερισχύουν τα<br />
ενδοεπιθηλιακά<br />
Σύνολο μη ικανοποιητικών δειγμάτων<br />
Ικανοποιητικό αλλά περιορισμένο (ΙΑΠ)<br />
Απουσία ενδοεπιθηλιακών κυττάρων<br />
Αίμα<br />
Φλεγμονώδη στοιχεία<br />
Ανεπαρκής αρ. κυττάρων<br />
Ανεπαρκής μονιμοποίηση<br />
Μηχανική βλάβη<br />
Κυτταρόλυση<br />
Λεπτές περιοχές<br />
Λιγοστά πλακώδη κύτταρα, υπερισχύουν τα<br />
ενδοεπιθηλιακά<br />
Σύνολο ΙΑΠ δειγμάτων<br />
Ικανοποιητικό<br />
Συνολικός αριθμός δειγμάτων<br />
Κ. Υγρής<br />
Φάσης Αρ. (%)<br />
0 (0.00)<br />
12 (0.03)<br />
136 (0.30)<br />
0 (0.00)<br />
1 (0.00)<br />
0 (0.00)<br />
0 (0.00)<br />
4 (0.01)<br />
153 (0.33)<br />
7001 (15.20)<br />
25 (0.05)<br />
109 (0.24)<br />
423 (0.92)<br />
0 (0.00)<br />
1 (0.00)<br />
3 (0.01)<br />
5 (0.01)<br />
20 (0.04)<br />
7587 (16.47)<br />
38 326 (83.20)<br />
46 066<br />
Συμβατική Κ.<br />
Αρ. (%)<br />
111 (0.28)<br />
84 (0.22)<br />
183 (0.47)<br />
15 (0.04)<br />
11 (0.03)<br />
4 (0.01)<br />
4 (0.01)<br />
22 (0.06)<br />
434 (1.11)<br />
4864 (12.47)<br />
514 (1.32)<br />
815 (2.09)<br />
321 (0.82)<br />
56 (0.14)<br />
10 (0.03)<br />
55 (0.14)<br />
63 (0.16)<br />
47 (0.12)<br />
6745 (17.29)<br />
31 831 (81.60)<br />
39 010<br />
Πίνακας 3.4 Αιτίες κατάταξης δειγμάτων στις κατηγορίες «μη ικανοποιητικό» και<br />
«ικανοποιητικό αλλά περιορισμένο».<br />
σχεδόν μηδενίζονται οι άλλες αιτίες που είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση μη<br />
ικανοποιητικών επιχρισμάτων όταν αυτά επεξεργάζονται με την συμβατική<br />
μέθοδο (πίνακας 3.4). Οι Lee και συνεργάτες 44 όμως βρήκαν μια αύξηση<br />
19% στα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων ΚΥΦ, που οφειλόταν<br />
κυρίως στον ανεπαρκή αριθμό κυττάρων. Το εύρημα αποδόθηκε στον<br />
σχεδιασμό της έρευνας (split-sample) όπου πρώτα παρασκευάζονται<br />
συμβατικά επιχρίσματα και στην συνέχεια τα επιχρίσματα ΚΥΦ, οπότε το<br />
κυτταρικό υλικό είναι λιγότερο. Επίσης βρέθηκε 68% αύξηση των δειγμάτων<br />
που δεν περιείχαν ενδοτραχηλικά κύτταρα σε σχέση με τα αντίστοιχα<br />
ευρήματα στην συμβατική κυτταρολογία. Η «direct to vial» έρευνα των Corkill<br />
και συνεργατών 77 έδειξε ότι τα ποσοστά εύρεσης δειγμάτων που δεν<br />
περιέχουν ενδοτραχηλικά κύτταρα ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο μεθόδων,<br />
δηλώνοντας ότι «είναι αναμενόμενο τα ποσοστά αυτά να παραμείνουν ίδια<br />
ενώ η ΚΥΦ αντικαθιστά την συμβατική μέθοδο, καθώς ο τρόπος συλλογής<br />
47
του δείγματος (σπάτουλα/βουρτσάκι ή cervex Brush) παραμένει ίδιος». Οι<br />
Duggan και συνεργάτες 78 βρήκαν ότι τα δείγματα που δεν περιείχαν<br />
ενδοτραχηλικά κύτταρα σημείωσαν αύξηση 47% με την χρήση της ΚΥΦ και<br />
επίσης βρήκαν ότι ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων αποτελούσε την<br />
συχνότερη αιτία μη ικανοποιητικών δειγμάτων και για την ΚΥΦ και για την<br />
συμβατική κυτταρολογία. Τα ευρήματα αυτά αποδόθηκαν στην απειρία των<br />
δειγματοληπτών στην χρήση της καινούργια συσκευής δειγματοληψίας που<br />
χρησιμοποιείται στην μέθοδο ΚΥΦ. Οι Moriarty και συνεργάτες 79<br />
πραγματοποίησαν μια έρευνα η οποία συμπεριλάμβανε 674 εργαστήρια στις<br />
ΗΠΑ, το κύριο εύρημα της οποίας ήταν ότι ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων,<br />
είτε τα δείγματα επεξεργάστηκαν με την συμβατική μέθοδο είτε με την μέθοδο<br />
ΚΥΦ, αποτελεί τον κυριότερο λόγο μη ικανοποιητικών δειγμάτων. Πιο<br />
πρόσφατα οι Alsharif και συνεργάτες 80 ερευνώντας τις αιτίες και την σημασία<br />
των μη ικανοποιητικών αποτελεσμάτων με την μέθοδο SurePath βρήκαν τα<br />
ίδια αποτελέσματα με τις προηγούμενες έρευνες.<br />
Ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων που παρουσιάζεται σε ορισμένα<br />
δείγματα έχει συσχετιστεί επίσης και με την λήψη του δείγματος και την<br />
μεταφορά του από την συσκευή δειγματοληψίας στην αντικειμενοφόρο<br />
πλάκα. Αυτές οι «αδυναμίες» μπορεί να λάβουν χώρα και κατά την<br />
επεξεργασία του δείγματος με την μέθοδο ΚΥΦ. Ένας άλλος λόγος κατά τον<br />
οποίον επηρεάζονται τα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων θεωρείται η<br />
μη σωστή αξιολόγηση της κυτταροβρίθειας ή η ανακριβής χρήση των<br />
κριτηρίων κυτταροβρίθειας από τους κυτταροτεχνολόγους 76 . Επίσης το<br />
κατώτερο όριο κυτταροβρίθειας που υιοθετεί το κάθε εργαστήριο επηρεάζει<br />
τα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων λόγω ανεπαρκούς αριθμού<br />
κυττάρων στο επίχρισμα, δηλαδή αν το κατώτερο όριο είναι πολύ χαμηλό,<br />
τότε αυτό αποτελεί αιτία ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων. Σε περίπτωση<br />
που το κατώτερο όριο είναι πολύ υψηλό, αυτό οδηγεί σε πολύ αυξημένα<br />
ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων, αυξάνοντας το άγχος των ασθενών<br />
και οδηγώντας σε περιττά έξοδα τόσο για τις ασθενείς όσο και για το<br />
εργαστήριο, επίσης αυξάνεται και το φόρτο εργασίας των εργαστηρίων αφού<br />
θα πρέπει να επαναλάβουν την εξέταση.<br />
Η κατοχύρωση έγκυρων κριτηρίων κυτταροβρίθειας σε παγκόσμια<br />
κλίμακα είτε πρόκειται για την μέθοδο ΚΥΦ είτε για την συμβατική μέθοδο,<br />
είναι μείζονος σημασίας και σε αυτό έχει παίξει σπουδαίο ρόλο το σύστημα<br />
Bethesda θεσπίζοντας κριτήρια για την αξιολόγηση κολποτραχηλικών<br />
επιχρισμάτων. Έτσι έχουν λυθεί πολλά προβλήματα επικοινωνίας μεταξύ των<br />
ιατρών κυτταρολόγων, των εργαστηρίων και των κλινικών ιατρών και επίσης<br />
η δουλειά των επιδημιολόγων που συγκρίνουν την αποτελεσματικότητα των<br />
διαφόρων προγραμμάτων προληπτικού ελέγχου του καρκίνου του τραχήλου<br />
της μήτρας, έχει γίνει πολύ πιο εύκολη. Η ποικιλία στην ορολογία εμπόδιζε<br />
την ουσιαστική συζήτηση μεταξύ των εργαστηρίων, επηρέαζε την<br />
αντιμετώπιση του ασθενούς και την χρησιμοποίηση των βέλτιστων μεθόδων<br />
για την περίθαλψή του.<br />
Όσον αφορά τα δείγματα τα οποία χαρακτηρίζονται «ικανοποιητικά<br />
αλλά περιορισμένα» λόγω έλλειψης ενδοτραχηλικών κυττάρων τα<br />
αποτελέσματα των διαφόρων ερευνών είναι αντικρουόμενα. Οι παράγοντες<br />
που μπορεί να οδηγήσουν σε αυξημένα ποσοστά τέτοιων δειγμάτων είναι<br />
48
ίδια όπως και για τα μη ικανοποιητικά δείγματα 76 . Ένας λόγος μπορεί να είναι<br />
η ανεπαρκής μεταφορά όλων των ενδοτραχηλικών κυττάρων από την<br />
συσκευή δειγματοληψίας (cervex Brush) στο φιαλίδιο με το συντηρητικό υγρό<br />
λόγω του ότι τα ενδοτραχηλικά κύτταρα μπορεί να παγιδευτούν στην<br />
ενδοτραχηλική βλέννα η οποία παραμένει στις τρίχες της βούρτσας και δεν<br />
ξεπλένεται στο υγρό. Σύμφωνα με το σύστημα Bethesda σε ένα<br />
κολποτραχηλικό επίχρισμα ΚΥΦ ή συμβατικής κυτταρολογίας θα πρέπει να<br />
υπάρχουν τουλάχιστον 10 ενδοτραχηλικά κύτταρα ώστε το δείγμα να<br />
θεωρηθεί επαρκές ως προς την περιεκτικότητα σε κύτταρα που προέρχονται<br />
από την ζώνη μετάπτωσης. Το 1990 η απουσία ενδοτραχηλικών δειγμάτων<br />
αποτελούσε δείκτης για επανάληψη της εξέτασης, σήμερα η απουσία των εν<br />
λόγω κυττάρων δεν έχει σοβαρές συνέπειες 76 .<br />
Εικόνα 3.1 Εικόνες από δύο επιχρίσματα ΚΥΦ τα οποία χαρακτηρίζονται ως «μη<br />
ικανοποιητικά» λόγω ανεπαρκούς αριθμού κυττάρων. Α) ThinPrep,<br />
αντιπροσωπευτική εικόνα οπτικού πεδίου με 10x φακό, περιέχει 40<br />
ορατά και καλά διατηρημένα πλακώδη κύτταρα B) SurePath, το<br />
επίχρισμα αυτό περιέχει λιγότερα από 8 κύτταρα ανά οπτικό πεδίο 40x.<br />
Όσον αφορά τα δείγματα μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας, στις<br />
περισσότερες έρευνες συμπεραίνεται ότι με την χρήση της ΚΥΦ τα ποσοστά<br />
ανεπαρκών δειγμάτων έχουν σημειώσει αύξηση όταν συγκρίνεται με την<br />
συμβατική μεθοδο 67,81-84 . Αυτό κυρίως εξηγείται από το ότι τα διαγνωστικά<br />
μορφολογικά χαρακτηριστικά της μεθόδου ΚΥΦ παρουσιάζουν μεγάλες<br />
διαφορές με την συμβατική μέθοδο και οι κυτταρολόγοι δεν είναι ακόμα ικανοί<br />
να αξιολογήσουν απόλυτα σωστά αυτά τα επιχρίσματα. Παρόλα αυτά γενικά<br />
η μέθοδος ΚΥΦ προτιμάται σε σχέση με την συμβατική κυτταρολογία για την<br />
αξιολόγηση επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας λόγω των<br />
ιδιοτήτων της, όπως καλή διατήρηση των κυτταρικών λεπτομερειών και το<br />
καθαρό υπόστρωμα 65,81-83 . Η χρήση της ΚΥΦ ως συμπληρωματική της<br />
συμβατικής μεθόδου φάνηκε να είναι το ίδιο ή και περισσότερο<br />
αποτελεσματική από ότι η χρήση μόνο της συμβατικής μεθόδου για την<br />
αξιολόγηση αυτών των παρασκευασμάτων με θετικές συνέπειες στα<br />
49
ποσοστά μη ανεπαρκών επιχρισμάτων. Η καθιέρωση κριτηρίων για την<br />
αξιολόγηση επιχρισμάτων ΚΥΦ μη γυναικολογικής κυτταρολογίας θεωρείται<br />
απαραίτητη.<br />
3.3 Οι επιδόσεις των κυτταροπαθολόγων στην ερμηνεία<br />
επιχρισμάτων Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης<br />
Αποτελέσματα πολλών κλινικών μελετών έχουν δείξει ότι η ερμηνεία<br />
των παρασκευασμάτων ΚΥΦ είναι ακριβέστερη από την ερμηνεία<br />
παρασκευασμάτων συμβατικής κυτταρολογίας καθώς απαντάνε λιγότερα<br />
σφάλματα κατά την εξέτασή τους 36,44,85-86 . Συγκεκριμένα όσον αφορά τα<br />
κολποτραχηλικά επιχρίσματα η ακριβής ερμηνεία των επιχρισμάτων ΚΥΦ<br />
ήταν ίδια ή ανώτερη της συμβατικής μεθόδου. Τα ευρήματα όμως έχουν<br />
δείξει μια δυσκολία των κυτταροπαθολόγων να ερμηνεύσουν HSIL (πίνακας<br />
3.5) και το πλακώδες καρκίνωμα σε επιχρίσματα ΚΥΦ. Κάποιες πιθανές<br />
εξηγήσεις για αυτό μπορεί να είναι ότι ενώ η μορφολογία των LSIL στα<br />
παρασκευάσματα ΚΥΦ είναι σχεδόν παρόμοια με την μορφολογία τους σε<br />
συμβατικά παρασκευάσματα, η κυτταρομορφολογία των HSIL φέρει πιο<br />
ιδιαίτερα χαρακτηριστικά στα παρασκευάσματα ΚΥΦ 86 , π.χ. σε<br />
παρασκευάσματα ΚΥΦ τα κύτταρα που έχουν υποστεί αλλοίωση υψηλού<br />
βαθμού εμφανίζονται ως απομονωμένα μικρά κύτταρα με πυρήνα<br />
μικρότερου μεγέθους. Ενώ το πλακώδες καρκίνωμα μπορεί να αγνοηθεί σε<br />
παρασκευάσματα ΚΥΦ καθώς τα μη κερατινοποιημένα κύτταρά του μπορεί<br />
να μοιάζουν, σε μικρή μεγέθυνση, με καλοήθη πλακώδη μεταπλασία 86 .<br />
ΚΥΦ ΣΚ<br />
Μη<br />
πιστοποιημένοι<br />
Μη<br />
πιστοποιημένοι<br />
Διαγνωστική<br />
ομάδα<br />
Πιστοποιημένοι<br />
Πιστοποιημένοι<br />
n % n % n % n %<br />
Αρνητικό 1850 1,14 230 2,61 3321 1,66 1249 3,04<br />
LSIL 743 2,02 90 8,89 1011 2,57 384 7,29<br />
HSIL 1204 2,82 162 4,94 2975 1,41 1034 2,42<br />
Σύνολο 3797 1,84 482 4,56 7307 1,68 2667 3,41 *<br />
Πίνακας 3.5 Ποσοστά ασυμφωνίας των απαντήσεων των κυτταροπαθολόγων ανά<br />
διαγνωστική ομάδα και κατάσταση πιστοποίησης στην ΚΥΦ.<br />
* Renshaw et al. The Significance of Certification in Liquid-Based Cytology and Performance<br />
in the College of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in<br />
Cervicovaginal Cytopathology. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1269–1272.<br />
50
Σε μια έρευνα 87 που αξιολογούσε την σημασία της πιστοποίησης<br />
των εργαστηρίων στην κυτταρολογία υγρής φάσης βρέθηκε ότι η<br />
πιστοποίηση των κυτταρολόγων και κυτταροπαθολόγων σχετίζεται απόλυτα<br />
με μια σημαντική μείωση στα ποσοστά ασυμφωνίας κατά την ερμηνεία<br />
επιχρισμάτων ΚΥΦ. Μάλιστα η πιστοποίηση στην ΚΥΦ είχε αντίκτυπο ακόμα<br />
και στην ερμηνεία επιχρισμάτων συμβατικής κυτταρολογίας καθώς βρέθηκε<br />
ότι κυτταροπαθολόγοι, οι οποίοι είχαν εκπαιδευτεί για να ερμηνεύσουν ΚΥΦ<br />
επιχρίσματα, σημείωσαν μειωμένα ποσοστά σφαλμάτων και κατά την<br />
αξιολόγηση συμβατικών παρασκευασμάτων.<br />
Και στην μη- γυναικολογική κυτταρολογία τα ευρήματα είναι<br />
παρόμοια, η ΚΥΦ είναι ανώτερη της συμβατικής κυτταρολογίας σε όλες τις<br />
διαγνωστικές κατηγορίες εκτός από τις περιπτώσεις πλακώδους<br />
καρκινώματος 54 . Στα μη-γυναικολογικά δείγματα η ΚΥΦ είναι προτιμότερη<br />
διαγνωστική μέθοδος από την συμβατική κυτταρολογία λόγω των τεχνικών<br />
χαρακτηριστικών όπως είναι το καθαρό υπόστρωμα και η ομοιογενής<br />
διασπορά των κυττάρων στο επίχρισμα που κάνουν την διάγνωση πιο<br />
εύκολη για τους κυτταρολόγους. Γενικά η ακρίβεια της μεθόδου ΚΥΦ είναι<br />
ανώτερη της συμβατικής 88 , όμως υπάρχουν μερικά μειονεκτήματα της<br />
μεθόδου όπως είναι τα διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά όσον<br />
αφορά τα θραύσματα των κυττάρων (ρήξη των θηλωματωδών ομάδων και<br />
αυξημένος επιμερισμός των κυττάρων), μικρότερα κύτταρα με μικρότερους<br />
πυρήνες λόγω του ότι τα κύτταρα παίρνουν μια πιο στρογγυλοποιημένη<br />
μορφή μέσα στο υγρό διάλυμα συντήρησης, και η απώλεια διαγνωστικά<br />
σημαντικού υλικού του υποστρώματος (η κολλοειδής μορφή του<br />
υποστρώματος, η βλέννα, χονδορμυξοειδής στρωματική ουσία) 54 . Η απώλεια<br />
των χαρακτηριστικών του υποστρώματος έχει μεγάλη σημασία για την<br />
διάγνωση ορισμένων όγκων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας καθώς η<br />
διάγνωσή τους στηρίζεται πολλές φορές στα ευρήματα αυτά. Με την<br />
τεχνολογία της ΚΥΦ όμως οι κυτταρολόγοι πρέπει να βασιστούν<br />
εξολοκλήρου στα μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, για τα οποία<br />
θα πρέπει να θεσπιστούν διαγνωστικά κριτήρια.<br />
Τα τεχνικά χαρακτηριστικά της ΚΥΦ όπως η μονιμοποίηση, η<br />
μεταφορά και η συντήρηση του κυτταρολογικού υλικού σε υγρό μέσο<br />
αποφεύγοντας έτσι το στέγνωμα των επιχρισμάτων στον αέρα (artifacts), ο<br />
αυτοματοποιημένος τρόπος παρασκευής επιχρισμάτων, η μικρή περιοχή<br />
εξέτασης (20mm ThinPrep, 13 mm SurePath) που μειώνει τον χρόνο<br />
εξέτασης ανά επίχρισμα, και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της ΚΥΦ όπως<br />
το καθαρό υπόστρωμα, η ομοιογενής κατανομή των κυττάρων, η βελτιωμένη<br />
παρουσία των κυττάρων στο επίχρισμα και η ελάχιστη κυτταρική επικάλυψη<br />
που υφίστανται, κάνουν την διάγνωση πιο εύκολη και αποτελεσματική<br />
μειώνοντας το φόρτο εργασίας του εργαστηρίου.<br />
Λόγω όλων αυτών των διαφορών της ΚΥΦ με την συμβατική<br />
κυτταρολογία συνεπάγεται ότι η εκπαίδευση των κυτταροτεχνολόγων και<br />
κυτταροπαθολόγων είναι απαραίτητη πριν την εισαγωγή της μεθόδου στα<br />
εργαστήριά τους.<br />
51
3.4 Επικουρικές εξετάσεις σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής<br />
Φάσης<br />
Ένα άλλο μεγάλο πλεονέκτημα της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης<br />
(ΚΥΦ) είναι η δυνατότητα εφαρμογής επιπρόσθετων εξετάσεων στο<br />
υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό όπως, επιπλέον επιχρίσματα,<br />
ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις ή εφαρμογή μοριακών εξετάσεων 89-93 .<br />
Έρευνες έχουν δείξει ότι η παρασκευή επιπλέον κολποτραχηλικών<br />
επιχρισμάτων στο υπολειπόμενο υλικό ΚΥΦ οδηγεί σε μείωση των<br />
ποσοστών των μη ικανοποιητικών δειγμάτων και στην ανίχνευση<br />
περισσότερων περιπτώσεων ASCUS 94-95 . Αυτό δεν αναιρεί την ακρίβεια του<br />
πρώτου παρασκευάσματος παρόλα αυτά είναι ένα στοιχείο που θέλει<br />
επιπλέον διερεύνηση.<br />
Η ανίχνευση για χλαμύδια του τραχώματος (Chlamydia<br />
Trachomatis), γονόρροια (Neisseria Gonorrhoeae), και κυρίως για τον ιό<br />
των ανθρώπινων θηλωμάτων (Human papilloma virus, HPV) είναι οι<br />
συχνότερες εξετάσεις που εφαρμόζονται σε υπολειπόμενα κολποτραχηλικά<br />
δείγματα ΚΥΦ καθώς αποτελούν τα τρία πιο κοινά σεξουαλικώς<br />
μεταδιδόμενα νοσήματα.<br />
Οι καινούργιες διαγνωστικές εργαστηριακές μέθοδοι για την<br />
ανίχνευση αυτών των μολυσματικών παραγόντων βασίζονται στην ανίχνευση<br />
του νουκλεϊκού οξέως (DNA), δηλαδή βασίζονται στην ανίχνευση και<br />
ταυτοποίηση μιας ακολουθίας DNA ειδική για τον κάθε μολυσματικό<br />
παράγοντα με ή χωρίς τον πολλαπλασιασμό του DNA με την αλυσιδωτή<br />
αντίδραση της πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR). Οι μέθοδοι<br />
που χρησιμοποιούν την ενίσχυση του ιικού γονιδιώματος μέσω PCR, είναι<br />
εξαιρετικά ευαίσθητες και ικανές να ανιχνεύσουν ακόμα και ένα μόνο<br />
αντίγραφο του DNA στόχου. Οι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι η<br />
Hybrid Capture 2 (HC2) και η μέθοδος PCR.<br />
Το συντηρητικό διάλυμα με βάση την αλκοόλη που χρησιμοποιείται<br />
στην ΚΥΦ αποδεικνύεται από πολλές έρευνες ότι είναι ένα σταθερό μέσο για<br />
την ανίχνευση αυτών των λοιμώξεων 90-92,96 και ότι ένα δείγμα είναι αρκετό για<br />
την παρασκευή κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, για την ανίχνευση HPV, C.<br />
Trachomatis και Ν. Gonorrhoeae 91 με μοριακές μεθόδους.<br />
Οι κοινές κατευθυντήριες γραμμές του 2001 στις ΗΠΑ για την<br />
διαχείριση των γυναικών με μη φυσιολογικά κυτταρολογικά ευρήματα<br />
παρουσίασαν την εξέταση HPV DNA σε υπολειπόμενα δείγματα ΚΥΦ, ως<br />
την προτιμότερη μέθοδο διαχείρισης γυναικών με ASCUS με την αιτιολογία<br />
ότι οι γυναίκες ασθενείς δεν χρειάζεται να ξαναεπισκεφτούν τον γιατρό τους<br />
για συμπληρωματική εξέταση, και αυτό αποτελεί ένα τεράστιο πλεονέκτημα.<br />
Άλλες επιπλέον εξετάσεις που μπορεί να γίνουν από το<br />
υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό ΚΥΦ είναι η παραγωγή κύβων παραφίνης<br />
τόσο για γυναικολογικά όσο και για μη-γυναικολογικά δείγματα και η<br />
εφαρμογή σε αυτά ανοσοϊστοχημικών εξετάσεων.<br />
52
3.5 Αυτοματοποίηση στην ανάλυση επιχρισμάτων<br />
γυναικολογικής κυτταρολογίας<br />
Το Pap τεστ υπήρξε ένα εξαιρετικά επιτυχές εργαλείο ανίχνευσης<br />
του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ο δια χειρός έλεγχος των<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων μπορεί να επηρεαστεί αρνητικά από<br />
κάποιους παράγοντες όπως η έλλειψη εργαστηριακού προσωπικού,<br />
συγκεκριμένα κυτταροτεχνολόγων σε αυτή την περίπτωση, εργονομικά<br />
προβλήματα και από τις επιπτώσεις των ψευδο-αρνητικών περιπτώσεων.<br />
Σαν αποτέλεσμα, με την ανάπτυξη της τεχνολογίας αναπτύχθηκε και<br />
εφαρμόστηκε η αυτοματοποίηση στον πρωτοβάθμιο έλεγχο των<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τα αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έχουν αναπτυχθεί στο πλαίσιο δύο μεγάλων<br />
συστημάτων: i) εκείνα που εκτελούν τον πρωτοβάθμιο έλεγχο<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων χωρίς την παρέμβαση του<br />
κυτταροτεχνολόγου και ii) εκείνα τα οποία «απαιτούν» την παρέμβαση του<br />
κυτταρτεχνολόγου για την ερμηνεία των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τα<br />
συστήματα αυτά είναι το BD FocalPoint Slide Profiler, το ThinPrep Imaging<br />
System και το BD FocalPoint GS (ο τρόπος λειτουργίας τους αναλύθηκε σε<br />
προηγούμενο κεφάλαιο).<br />
Από την χρήση αυτών των συστημάτων οι κυτταροτεχνολόγοι έχουν<br />
επωφεληθεί από την βελτίωση της εργασίας γενικά, την μειωμένη κόπωση,<br />
και την αυξημένη απόδοση. Αυτά συνεπάγουν αύξηση τη παραγωγικότητας<br />
του εργαστηρίου, περισσότερο χρόνο αφιερωμένο σε επιχρίσματα που<br />
φέρουν δύσκολες διαγνωστικές περιπτώσεις και σε συγκεκριμένα σημεία<br />
πάνω στα επιχρίσματα όπου ανιχνεύονται τα μη-φυσιολογικά στοιχεία από τα<br />
αυτοματοποιημένα συστήματα. Ως αποτέλεσμα όλων αυτών έχει σημειωθεί<br />
αύξηση της ευαισθησίας για την ανίχνευση αλλοιώσεων. Καθώς όμως<br />
αυξάνεται ο αριθμός των επιχρισμάτων που ελέγχονται πρέπει να<br />
καθιερωθούν και όρια όσον αφορά τον φόρτο εργασίας (αριθμός<br />
επιχρισμάτων που ελέγχονται καθημερινά) 97 .<br />
Ενώ ο ψηφιακός τρόπος ανάλυσης των επιχρισμάτων εισάγεται σε<br />
ένα εργαστήριο, διάφορα προβλήματα μπορεί να λάβουν χώρα μέχρι το<br />
προσωπικό να εξοικειωθεί με την καινούργια μέθοδο και τις καινούργιες<br />
εργαστηριακές συσκευές, π.χ. στην αρχή οι κυτταροτεχνολόγοι μπορεί να<br />
δυσκολεύονται να χρησιμοποιήσουν τις συσκευές αλλά και να ανιχνεύσουν<br />
μη φυσιολογικά στοιχεία με την καινούργια τεχνική κ.α.<br />
Οι περιορισμοί των βοηθητικών αυτοματοποιημένων συστημάτων<br />
ελέγχου αποδίδονται στην καμπύλη μάθησης που συναντάται κατά την<br />
εφαρμογή μιας καινούργια τεχνολογίας στην κλινική πράξη, και καθώς αυτό<br />
αποτελεί, σε μεγάλο βαθμό, ένα ανθρώπινο φαινόμενο, έχει παρατηρηθεί<br />
κυρίως στα διαδραστικά συστήματα. Ένα παράδειγμα είναι τα αρνητικά<br />
ευρήματα όσον αφορά την διαγνωστική επίδοση των συστημάτων, όπως η<br />
αύξηση που παρατηρήθηκε αρχικά στα ποσοστά των επιχρισμάτων με<br />
ASCUS 29 ή όπως η μείωση που παρατηρήθηκε στα ποσοστά εύρεσης του<br />
ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων στα επιχρίσματα με ASCUS 98 για τα οποία<br />
όμως στην συνέχεια διαπιστώθηκε ότι οφείλονται στην καμπύλη μάθησης και<br />
53
στην εξοικείωση του εργαστηριακού προσωπικού με την καινούργια<br />
τεχνολογία.<br />
Ο πίνακας 3.6 99 συμπεριλαμβάνει μια λίστα από αντιπροσωπευτικές<br />
δημοσιεύσεις που έλαβαν χώρα το χρονικό διάστημα 1995-2008, οι οποίες<br />
εξέταζαν την αποτελεσματικότητα των αυτοματοποιημένων συστημάτων<br />
ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.<br />
Χρον/γία<br />
1995 100<br />
1999 28<br />
2001 101<br />
2002 102<br />
2004 103<br />
2005 104<br />
2006 98<br />
2007 105<br />
2007 106<br />
2007 30<br />
2007 32<br />
2007 29<br />
2007 31<br />
2008 107<br />
Συστήματα πρωτοβάθμιου Κύριο εύρημα<br />
ελέγχου/Διαδραστικά<br />
AutoPap® -Καλύτερη επίδοση όσον αφορά τα ψευδοαρνητικά<br />
αποτελέσματα κατά την<br />
επανεξέταση επιχρισμάτων<br />
AutoPap® -Ανιχνεύτηκαν περισσότερα HSIL<br />
AutoPap® -Αυξημένη ευαισθησία μεθόδου για την<br />
επαναξιολόγηση της ταξινόμησης των LSIL+<br />
AutoPap® -Ανίχνευση όλων των επιχρισμάτων που<br />
φέρουν HSIL+<br />
BD FocalPoint Slide -Υψηλά ποσοστά ανίχνευσης HSIL<br />
Profiler®<br />
επιχρισμάτων<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση SIL<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης SIL,<br />
αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης HSIL με<br />
σημείο αναφοράς την βιοψία<br />
BD FocalPoint GS® -Υψηλή ευαισθησία για την ανίχνευση SIL<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση SIL<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης SIL, με<br />
ελάττωση ποσοστού ψευδο-αρνητικών<br />
αποτελεσμάτων, αυξημένο ποσοστό<br />
κυτταροτεχνολόγων που δηλώνουν<br />
ικανοποιημένοι από την εργασία<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη παραγωγικότητα<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση SIL<br />
ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη παραγωγικότητα<br />
ThinPrep® Imaging System -Αμετάβλητα ποσοστά εύρεσης ASCUS και<br />
θετικών HPV DNA αποτελεσμάτων<br />
Πίνακας 3.6 Συμπεράσματα δημοσιεύσεων από την αξιολόγησή τους για τα<br />
αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.<br />
Οι επιδόσεις αυτών των σύγχρονων συστημάτων ήταν, μέχρι τώρα,<br />
πολύ θετικές επιδιώκοντας μια συνεχή ανάπτυξη και τελειοποίηση των<br />
συστημάτων με απώτερο σκοπό να χρησιμοποιηθούν από τα<br />
παθολογοανατομικά εργαστήρια σε παγκόσμια κλίμακα. Όπως προκύπτει<br />
54
από τις έρευνες αυτές (πίνακας 3.6) το κύριο πλεονέκτημα από την χρήση<br />
των αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου είναι η αυξημένη ευαισθησία<br />
όσον αφορά την ανίχνευση της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης του πλακώδους<br />
επιθηλίου λόγω της ακριβής και ευαίσθητης μεθόδου κατάταξης, που<br />
περιέχουν τα συστήματα πρωτοβάθμιου ελέγχου και διαδραστικού ελέγχου.<br />
Με την χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων επιτυγχάνεται:<br />
- μείωση του αριθμού ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων<br />
- και/ή αύξηση στην παραγωγικότητα.<br />
Τα πλεονεκτήματα των ψηφιακών εικόνων συμπεριλαμβάνουν την<br />
δυνατότητα εξέτασης των επιχρισμάτων χωρίς την παρουσία της<br />
αντικειμενοφόρου πλάκας, επιτρέποντας τον σχολιασμό πάνω στην εικόνα<br />
και την ικανότητα ταχείας μετάδοσής της ηλεκτρονικά για διάφορους λόγους<br />
(εκπαιδευτικούς, ελέγχου ποιότητας, σε συνέδρια κ.ά.). Στον τομέα της<br />
κυτταρολογίας οι ψηφιακές εικόνες χρησιμοποιούνται κυρίως στον<br />
αυτοματοποιημένο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, για<br />
εκπαιδευτικούς λόγους και για εξάσκηση των κυτταροτεχνολόγων και<br />
κυτταροπαθολόγων (π.χ. online ψηφιακοί άτλαντες). Επιπλέον, υπάρχουν<br />
σημαντικές δυνατότητες χρήσης των ψηφιακών εικόνων στον έλεγχο<br />
επάρκειας στην γυναικολογική κυτταρολογία. Στο άμεσο μέλλον οι ψηφιακές<br />
εικόνες στην κυτταρολογία πιθανόν να χρησιμοποιηθούν για την ταχεία<br />
ανάκτηση και εξέταση αρχειοθετημένων κλινικών περιπτώσεων που έχουν<br />
ελεγχθεί με την ψηφιακή μέθοδο (π.χ. ψηφιακές βιβλιοθήκες), για τον έλεγχο<br />
δειγμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας που έχουν επεξεργαστεί με την<br />
μέθοδο κυτταρολογίας υγρής φάσης (π.χ. δείγματα ούρων και δείγματα<br />
κοιλοτήτων σώματος) και στην επικοινωνία (π.χ. τηλεδιασκέψεις) και<br />
παράλληλα θα συνεχίζουν να παίζουν σπουδαίο ρόλο στην εξάσκηση των<br />
κυτταροτεχνολόγων, στην εκπαίδευση (κυρίως σε διεθνή επίπεδο), στην<br />
πιστοποίηση των πρωτοβάθμιων εξετάσεων και στην συνεχή εκπαίδευση και<br />
συντήρηση της επάρκειας και πιστοποίησης. Γενικά ο έλεγχος και η τελική<br />
διάγνωση κυτταρολογικών δειγμάτων στο μέλλον ενδέχεται να<br />
πραγματοποιηθούν εξολοκλήρου μέσω οθόνης υπολογιστή και όχι στο<br />
οπτικό μικροσκόπιο 99 .<br />
Η αυτοματοποίηση στα εργαστήρια κυτταρολογίας στοχεύει στην<br />
ανταπόκριση σημερινών και μελλοντικών προκλήσεων, τέτοιες είναι ο<br />
αυξημένος φόρτος εργασίας και η έλλειψη έμπειρων κυτταροτεχνολόγων.<br />
Ενώ αυτά είναι προβλήματα που παρουσιάζονται ανά τον κόσμο, πρόσφατα<br />
έχουν εκφραστεί αντίθετοι προβληματισμοί 108-109 . Με την προοπτική ότι η<br />
ανάλυση HPV DNA θα αποτελέσει εξέταση πρωτοβάθμιου ελέγχου<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, με την ανάπτυξη του εμβολίου για HPV, και<br />
την συνιστώμενη επέκταση του διαστήματος ελέγχου σε συγκεκριμένες<br />
υποομάδες ασθενών, ο αριθμός των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων που θα<br />
ελέγχονται θα μειωθεί σημαντικά στο μέλλον με αποτέλεσμα να μειωθεί και ο<br />
αριθμός του απαιτούμενου προσωπικού στα εργαστήρια. Σε αυτή την<br />
περίπτωση η χρήση ψηφιακών εικόνων που θα παράγονται από<br />
συγκεκριμένα αυτοματοποιημένα συστήματα και θα μεταδίδονται μέσω του<br />
Internet παρέχει την δυνατότητα αποτελεσματικού και ταχέως ελέγχου<br />
ατόμων που θα ανήκουν σε αυτές τις υποομάδες 99 . Η πολυφασματική<br />
55
ανάλυση εικόνας αποτελεί ένα αναδυόμενο εργαλείο που χρησιμοποιεί<br />
πληροφορίες που αντλεί από τις εικόνες σχετικές με το χώρο και το φάσμα,<br />
ώστε να ταξινομεί τις εικόνες που μπορεί να χρησιμοποιηθούν στην<br />
διαφοροποίηση μεταξύ καλοηθών και κακοηθών κυττάρων. Μια τέτοια<br />
τεχνολογία ανάλυσης εικόνας προς το παρόν διερευνάται στην ανίχνευση<br />
κακοήθειας σε δείγματα από αναρρόφηση 99 .<br />
Η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης έχει προσφέρει σπουδαίο ρόλο στην<br />
ανάπτυξη της αυτοματοποίησης στον πρωτοβάθμιο έλεγχο<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων αφού η ύπαρξη της τεχνολογίας αυτής<br />
οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ανάγκη να καταστεί δυνατή η<br />
αυτοματοποίηση στην γυναικολογική κυτταρολογία. Οι κυτταρολόγοι και<br />
κυτταροπαθολόγοι στο μέλλον θα αντιμετωπίσουν μεγάλες διαφορές στην<br />
καθημερινή κλινική τους πράξη καθώς η αξιολόγηση, η επανεξέταση, η<br />
πρόσβαση σε επιχρίσματα θα γίνεται ψηφιακά οποτεδήποτε και οπουδήποτε<br />
και να βρίσκονται, απλά αρκεί να έχουν έναν υπολογιστή 97 .<br />
56
44 ΕΕΦΦΑΑΡΡΜΜΟΟΓΓΗΗ ΜΜΟΟΡΡΙΙΑΑΚΚΩΩΝΝ ΜΜΕΕΘΘΟΟΔΔΩΩΝΝ ΣΣΕΕ<br />
ΔΔΕΕΙΙΓΓΜΜΑΑΤΤΑΑ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ<br />
ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ΚΚΑΑΙΙ ΗΗ ΧΧΡΡΗΗΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥΣΣ ΣΣΤΤΗΗΝΝ<br />
ΔΔΙΙΑΑΓΓΝΝΩΩΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥ ΚΚΑΑΡΡΚΚΙΙΝΝΟΟΥΥ:: ΠΠΡΡΟΟΚΚΛΛΗΗΣΣΕΕΙΙΣΣ<br />
ΚΚΑΑΙΙ ΠΠΡΡΟΟΟΟΠΠΤΤΙΙΚΚΕΕΣΣ<br />
Η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης έχει εξελιχθεί τις δύο τελευταίες<br />
δεκαετίες ως η εναλλακτική μέθοδος της συμβατικής κολποτραχηλικής<br />
κυτταρολογίας και ως εναλλακτική ή συμπληρωματική μέθοδος διάγνωσης<br />
της μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας με αναφορές στην αύξηση της<br />
ευαισθησίας και την μείωση στα ποσοστά μη ικανοποιητικών<br />
επιχρισμάτων 3,6,35-36,40-41 . Η ικανότητα της μεθόδου να παρέχει και να<br />
διατηρεί υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό για αρκετές εβδομάδες σε<br />
θερμοκρασία δωματίου προσφέρει την δυνατότητα εφαρμογής<br />
ανοσοκυτταροχημικών και μοριακών εξετάσεων.<br />
4.1 Ο ρόλος της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στην<br />
ανίχνευση μοριακών δεικτών για την πρόληψη του<br />
καρκίνου του τραχήλου της μήτρας<br />
Υπάρχουν πάνω από 100 τύποι του ιού των ανθρώπινων<br />
θηλωμάτων (HPV) τα οποία διαφέρουν μεταξύ τους γενετικά και μολύνουν<br />
διαφορετικά σημεία του σώματος με αποτέλεσμα οι εκδηλώσεις της νόσου να<br />
ποικίλουν. Μια συγκεκριμένη ομάδα των HPV, που αναφέρονται ως<br />
ογκογόνοι τύποι υψηλοί κινδύνου, έχουν αναγνωριστεί, είτε μεμονωμένοι είτε<br />
σε συνδυασμούς, ως την αναγκαία αλλά όχι ικανή αιτία καρκίνου του<br />
τραχήλου της μήτρας (ΚΤΜ). Στο 95-100% των περιπτώσεων ΚΤΜ έχει<br />
57
ανιχνευτεί DNA του ιού (HPV-DNA), και μόνο ένα μικρό ποσοστό θεωρείται<br />
ότι προκαλείται από άλλους μηχανισμού που δεν σχετίζονται με τον ιό. Ο<br />
HPV προκαλεί προκαρκινικές αλλοιώσεις στον τράχηλο της μήτρας οι οποίες<br />
ταξινομούνται ως πλακώδη ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση χαμηλού βαθμού<br />
(Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion, LSIL) και πλακώδη<br />
ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση υψηλού βαθμού (High-grade Squamous<br />
Intraepithelial Lesion, HSIL). Στην Ευρώπη εμφανίζονται ετησίως 817.000<br />
περιπτώσεις LSIL και 187.000 περιπτώσεις HSIL 110 .<br />
Η λοίμωξη από τον HPV είναι ένα από τα πιο συχνά σεξουαλικώς<br />
μεταδιδόμενα νοσήματα παγκοσμίως. Το γενετικό υλικό του HPV αποτελείται<br />
από δίκλωνο DNA και κωδικοποιεί σειρά πρώιμων ρυθμιστικών<br />
πρωτεϊνών (Early region: E6, E7, E1, E2, E4 και E5) και δύο δομικές<br />
πρωτεΐνες του καψιδίου (Late region: L1 και L2). Επίσης, περιλαμβάνει και<br />
μία ρυθμιστική περιοχή (Long Control Region - LCR).<br />
4.1.1 Μοριακή διάγνωση του HPV<br />
Η επιβεβαίωση της ιογενούς προέλευσης του ΚΤΜ, η βελτίωση των<br />
διαγνωστικών κυτταρολογικών τεχνικών και η έλευση του υγρού μέσου<br />
συντήρησης κυτταρολογικών δειγμάτων (ΚΥΦ) άνοιξαν τον δρόμο στην<br />
ανάπτυξη νέων και ενδιαφερουσών επιλογών για την βελτίωση του<br />
προγράμματος προσυμπτωματικού ελέγχου για τον ΚΤΜ.<br />
Η ανίχνευση του HPV από διάφορες μοριακές μεθόδους έχει<br />
προταθεί ως συμπληρωματική ή ανεξάρτητη μέθοδος πρωτοβάθμιου<br />
ελέγχου με πολλά πιθανά πλεονεκτήματα. Η εξέταση ανίχνευσης του<br />
αιτιολογικού παράγοντα του ΚΤΜ προσφέρει την δυνατότητα να εντοπιστούν<br />
οι γυναίκες εκείνες με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης ΚΤΜ, ενώ βρίσκονται υπό<br />
λανθάνουσα ή υποκλινική μόλυνση, αρκετούς μήνες έως χρόνια, πριν ο ιός<br />
κάνει την εμφάνισή του στο τεστ Παπανικολάου. Τα τελευταία 25 χρόνια<br />
έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι ανίχνευσης του HPV-DNA σε<br />
κυτταρολογικά δείγματα. Οι αρχικές μέθοδοι στηρίχτηκαν στην τεχνολογία<br />
άμεσης ανίχνευσης υβριδισμού όπως το dot blot, Southern blot, in situ<br />
Hybridization οι οποίες όμως εκτός του ότι ήταν χρονοβόρες και αύξαναν τον<br />
φόρτο εργασίας, απαιτούσαν και μεγάλες ποσότητες DNA για την εκτέλεσή<br />
τους. Την θέση τους πήρε η τεχνολογία ενίσχυσης η οποία διακρίνεται σε: i)<br />
δοκιμασίες ενίσχυσης στόχου (π.χ. PCR) και ii) δοκιμασίες ενίσχυσης<br />
σήματος (Hybrid capture 2, HC2) που αποτελεί και την μόνη μέθοδο που έχει<br />
λάβει την έγκριση του FDA για την ανίχνευση του HPV.<br />
Hybrid capture 2<br />
Η HC2 αποτελεί δοκιμή ενίσχυσης σήματος με υβριδισμό του DNA<br />
για την ποιοτική ανίχνευση του γονιδιώματος υψηλού κινδύνου τύπων του<br />
ιού. Δεν μπορεί ωστόσο να αναγνωρίσει ποιος συγκεκριμένος τύπος του<br />
58
HPV είναι παρόν. Η μέθοδος αναγνωρίζει συγκριμένο γονιδίωμα 13ών<br />
τύπων HPV υψηλού κινδύνου χρησιμοποιώντας ανιχνευτή RNA του οποίου η<br />
αλληλουχία είναι συμπληρωματική του συγκεκριμένου στόχου. Τα υβρίδια<br />
DNA-RNA που σχηματίζονται αναγνωρίζονται από την φθορίζουσα ουσία<br />
που προστίθεται στην συνέχεια η οποία εκπέμπει φως. Η ένταση του φωτός<br />
είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA του HPV που είναι παρόν στο δείγμα<br />
που εξετάζεται.<br />
To 2003 αξιολογήθηκε η απόδοση του Hybrid Capture 3, που<br />
πιθανόν να αποτελέσει τη νέα γενιά του HC2, ως προς την ικανότητα<br />
ανίχνευσης τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας βαθμού 3 (cervical<br />
intraepithelial neoplasia, CIN3) και καρκίνου. Η HC3 σχεδιάστηκε για να<br />
ελαχιστοποιήσει την διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με μη-στοχευόμενους<br />
τύπους HPV. Η HC3 έδειξε υψηλότερη ευαισθησία από την HC2 αλλά ίδια<br />
ειδικότητα για την ανίχνευση CIN2+ 111 . Η μέθοδος αυτή δεν έχει βγει ακόμα<br />
στην αγορά 112 .<br />
Ένα άλλο τεστ που χρησιμοποιεί την ίδια τεχνολογία είναι το<br />
Cervista HR HPV (Hologic, Bedford, Massachusetts) το οποίο έχει εγκριθεί<br />
από τον FDA για την ποιοτική ανίχνευση του DNA 14ων υψηλού κινδύνου<br />
τύπων του HPV σε κολποτραχηλικά δείγματα.<br />
PCR<br />
Η PCR βασίζεται στην επαναλαμβανόμενη αντιγραφή μιας<br />
ακολουθίας στόχου του DNA στις δύο άκρες τις οποίας συγκεκριμένοι<br />
ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές αρχίζουν την διαδικασία αντιγραφής του DNA.<br />
Λόγω του πολλαπλασιασμού του DNA στόχου, ακόμα και πολύ μικρές<br />
ποσότητες μπορούν ν ανιχνευτούν, η ευαισθησία της μεθόδου είναι πολύ<br />
υψηλή. Με την μέθοδο PCR μπορεί να ανιχνευτούν ακολουθίες από<br />
διάφορους τύπους του HPV. Η μέθοδος της PCR μπορεί να ανιχνεύσει<br />
περισσότερα δείγματα τα οποία φέρουν μόλυνση HPV και έχουν φυσιολογική<br />
ή ASCUS κυτταρολογική εξέταση, από ότι η HC2, αλλά έχουν ίδια απόδοση<br />
όσον αφορά την ταυτοποίηση του ιού 113 .<br />
Πρόσφατα έχουν γίνει διαθέσιμα, το κατασκευασμένο για<br />
εμπορικούς λόγους τεστ που βασίζεται στην τεχνολογία του PCR, το<br />
Amplicor® HPV test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA)<br />
το ποίο αναγνωρίζει μια ομάδα από 13 υψηλού κινδύνου τύπους του HPV<br />
(high risk, hr HPV) ταυτόχρονα (η μέθοδος αυτή δεν έχει λάβει ακόμη την<br />
έγκριση από τον FDA), και το Linear Array HPV test, τα οποία<br />
χρησιμοποιούνται στην ανίχνευση και τον προσδιορισμό γονότυπων HPV. Οι<br />
μέθοδοι έχουν παρουσιάσει σε διάφορες δοκιμές υψηλότερη ευαισθησία<br />
αλλά χαμηλότερη ειδικότητα από ότι η HC2 για την ανίχνευση των hr HPV 112 .<br />
Μια άλλη μέθοδος που χρησιμοποιεί την τεχνολογία του PCR είναι<br />
το Cobas 4800 HPV (Roche Diagnostics) το οποίο έχει σχεδιαστεί για την in<br />
vitro ποιοτική ανίχνευση 14 τύπων υψηλού κινδύνου του HPV.<br />
Και οι δύο μοριακές μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν σε δείγματα<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης.<br />
59
4.1.2 Παραδείγματα εφαρμογής του HPV DNA test στον<br />
πρωτοβάθμιο έλεγχο<br />
Οι πρώτες σημαντικές εφαρμογές της ανίχνευσης του HPV DNA<br />
στην κλινική πράξη ήταν στην διαλογή και διαχείριση των γυναικών με μη<br />
φυσιολογικά ευρήματα στην κυτταρολογική τους εξέταση (ASCUS), στην<br />
διαλογή ασθενών που βρίσκονταν στην εμμηνόπαυση και το κολποτραχηλικό<br />
τους επίχρισμα έδειχνε LSIL, και ως μέθοδος παρακολούθησης γυναικών<br />
που έλαβαν θεραπεία για την αντιμετώπιση της CIN 114-116 . Σκοπός της<br />
ανάλυσης του DNA-HPV ως συμπληρωματική της κυτταρολογική εξέτασης,<br />
είναι η ανίχνευση μεταξύ των ασυμπτωματικών γυναικών με λανθάνουσα ή<br />
υποκλινική λοίμωξη. Πληθώρα ερευνών έχουν αποδείξει ότι η εξέταση<br />
ανίχνευσης του HPV είναι πιο ευαίσθητη από την κυτταρολογική εξέταση<br />
αλλά με αντίθετα αποτελέσματα όσον αφορά την ειδικότητα. Αυτό σημαίνει<br />
ότι αν και η χρήση της εξέτασης για HPV αυξάνει τα ποσοστά ανίχνευσης<br />
γυναικών που παρουσιάζουν μεγαλύτερο κίνδυνοι ανάπτυξης καρκίνου του<br />
τραχήλου της μήτρας, η εξέταση αυτή δεν μπορεί να αντικαταστήσει την<br />
κυτταρολογική εξέταση και να χρησιμοποιηθεί ως η μοναδική μέθοδος στον<br />
πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων για την ανίχνευση του<br />
ΚΤΜ.<br />
Έτσι οι έρευνες στράφηκαν σε μια εναλλακτική μεθοδολογία η οποία<br />
συμπεριλάμβανε την χρήση της ανάλυσης για HPV-DNA ως<br />
συμπληρωματική της ΚΥΦ σε γυναίκες άνω των 30 ετών. Η λογική αυτού του<br />
συνδυασμού στηρίχτηκε στο ότι ο HPV αποτελεί την κύρια αιτία εμφάνισης<br />
του ΚΤΜ και στην πολύ υψηλή αρνητική προγνωστική αξία (95-100%) του<br />
συνδυασμού HPV DNA με την ΚΥΦ. Έρευνες έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός<br />
μοριακής βιολογίας με την ΚΥΦ μπορεί να έχει θετικά αποτελέσματα στη<br />
αύξηση του χρονικού διαστήματος προσυμπτωματικού ελέγχου των<br />
γυναικών των οποίων τα αποτελέσματα και των δυο εξετάσεων είναι<br />
αρνητικά. Η παράταση του χρονικού διαστήματος ελέγχου σε συνδυασμό με<br />
πιο ευαίσθητες τεχνικές, όπως η ΚΥΦ έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας,<br />
θα αποτελέσει την στρατηγική που θα επιφέρει την πλέον συμφέρουσα<br />
ισορροπία μεταξύ οφέλους και κόστους 117 . Στις ΗΠΑ ο συνδυασμός<br />
εξετάσεων HPV-DNA και ΚΥΦ έχει ενταχθεί στον πρόγραμμα<br />
προσυμπτωματικού ελέγχου γυναικών άνω των 30 ετών από το 2001 και<br />
αποτελεί μέθοδος διαλογής των γυναικών, με κυτταρολογικά ευρήματα<br />
ASCUS, που θα παραπεμφθούν για κολποσκόπηση ξεχωρίζοντας εκείνες με<br />
HPV DNA εξέταση θετικές καθώς έχουν περισσότερες πιθανότητες<br />
ανάπτυξης ΚΤΜ.<br />
Καθώς ο HPV είναι υπεύθυνος για το 95% των περιπτώσεων<br />
καρκίνου της μήτρας, οι μελέτες έχουν ερευνήσει και μια άλλη προσέγγιση<br />
στον προσυμπτωματικό έλεγχο. Οι περισσότερες έρευνες (πίνακας 4.1) που<br />
έχουν αξιολογήσει την απόδοση της κυτταρολογίας (συμβατικής ή ΚΥΦ) και<br />
της εξέτασης για HPV (PCR ή HC2) για την ανίχνευση αλλοιώσεων CIN2+<br />
και καρκίνου της μήτρας έχουν καταλήξει σε τρία κοινά συμπεράσματα: για<br />
την ανίχνευση αλλοιώσεων CIN2+ ή ΚΤΜ, η χρήση της εξέτασης HPV DNA<br />
είναι πιο ευαίσθητη (88-98% έναντι 51-86%) και έχει υψηλότερη αρνητική<br />
60
προγνωστική αξία από ότι η κυτταρολογική εξέταση, η ειδικότητα της<br />
εξέτασης HPV DNA είναι χαμηλότερη από ότι της κυτταρολογικής εξέτασης<br />
(83-94% έναντι 92-99%), και ότι η ευαισθησία και η αρνητική προγνωστική<br />
αξία του συνδυασμού των δύο μεθόδων είναι 100% 112 . Οπότε, στόχος είναι ο<br />
προσυμπτωματικός έλεγχος να αρχίζει με την πιο ευαίσθητη και<br />
αυτοματοποιημένη μέθοδος όπως είναι το τεστ ανίχνευσης HPV DNA και<br />
στην συνέχεια να χρησιμοποιηθεί η εξέταση με μεγαλύτερη ειδικότητα, όπως<br />
είναι η κυτταρολογική, για την διάγνωση και την διαλογή των γυναικών 118 .<br />
Την βάση αυτής της μεθοδολογίας αποτελούν τα ευρήματα ότι στην Ευρώπη<br />
οι πλειοψηφία των γυναικών με LSIL φέρουν hrHPV τύπους, οπότε αυτή η<br />
καινούργια προσέγγιση θεωρείται ότι θα είναι αποτελεσματικότερη όσον<br />
αφορά των γυναικείο πληθυσμό της Ευρώπης.<br />
Χρησιμοποιώντας την εξέταση HPV-DNA ως τον μοναδικό τρόπο<br />
προσυμπτωματικού ελέγχου σημαίνει ότι το ποσοστό γυναικών που θα<br />
χρειαστούν περαιτέρω εξέταση θα μειωθεί με αποτέλεσμα να μειωθεί το<br />
κόστος μέσω: μείωσης του αριθμού των υπαλλήλων που απασχολούνται σε<br />
ένα εργαστήριο, θα μειωθεί ο απαραίτητος χρόνος διάγνωσης, θα μειωθούν<br />
τα περιστατικά που λαμβάνουν περιττή θεραπεία και επιπλέον τα χρονικά<br />
διαστήματα ελέγχου θα μπορούν να παραταθούν. Το πλεονέκτημα της ΚΥΦ<br />
να παρέχει υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό για πρόσθετες εξετάσεις δίνει ένα<br />
σημαντικό προβάδισμα στην μεθοδολογία συνδυασμού των εξετάσεων<br />
καθώς η ασθενής δεν είναι υποχρεωμένη να επιστρέψει στον γιατρό ώστε να<br />
συλλεχθεί επιπλέον δείγμα όταν αυτό χρειάζεται, γεγονός που έχει<br />
οικονομικό όφελος για την ασθενή και το εργαστήριο 112 .<br />
Οι τρέχουσες ευρωπαϊκές κατευθυντήριες γραμμές του ελέγχου<br />
ποιότητας στο πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων<br />
προτείνουν την εφαρμογή πειραματικού προγράμματος με την χρήση<br />
έγκυρων τεστ ανίχνευσης HPV DNA, και αν το πρόγραμμα αποδειχθεί<br />
αποτελεσματικό, τότε, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές, η<br />
μεθοδολογία θα πρέπει να υιοθετηθεί 119 .<br />
Αποδεικνύεται λοιπόν ότι, εάν ο συνδυασμός HPV DNA και ΚΥΦ<br />
εφαρμοστεί ευρέως, τότε τα αποτελέσματα θα είναι ευεργετικά. Τα ποσοστά<br />
ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων αναμένεται να μειωθούν δραματικά, οι<br />
ασθενείς των οποίων και οι δύο εξετάσεις είναι αρνητικές θα ελέγχονται ανά<br />
μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, και οι ασθενείς που θα προσδιορίζεται ότι<br />
ανήκουν στην ομάδα υψηλού κινδύνου θα παρακολουθούνται τακτικά. Αυτά<br />
τα αποτελέσματα θα ωφελήσουν τους ασθενείς, τους γιατρούς καθώς και το<br />
σύστημα υγείας.<br />
61
Ευαισθησία (95% CI) Ειδικότητα (95% CI)<br />
Έρευνα n HC2 Κυτταρ.: HC2 και HC2 Κυτταρ.: HC2 και<br />
ASCUS+ κυτταρ.<br />
ASCUS+ κυτταρ.<br />
Ανίχνευση CIN3+<br />
Petry et<br />
al 120<br />
7908 97.3 46.0 100 95.2 98.0 94.9<br />
(83.2–99.6) (30.8–61.9) (93.7–100) (93.4–96.5) (96.7–98.8) (93.1–96.2)<br />
Kulasingam<br />
et al 121<br />
774 86.0 49.7 49.7 83.0 86.4 94.7<br />
(59.7–96.9) (32.9–71.5) (32.9–71.5) (76.8–87.1) (84.8–88.1) (92.8–96.1)<br />
Ανίχνευση CIN2+<br />
Bigras and 13.842 97.0 58.7 ΔΑ 92.4 96.9 ΔΑ<br />
de<br />
(91.8–99.4) (48.6–68.2)<br />
(91.9–92.9) (96.6–97.2)<br />
Marval 121<br />
Cárdenas-<br />
Turanzas et<br />
al 122<br />
Coste et<br />
al 123<br />
Kulasingam<br />
et al 121<br />
Mayrand et<br />
al 124<br />
Petry et<br />
al 120<br />
1850 69<br />
(41–89)<br />
3080 96<br />
(88–100)<br />
774 62.7<br />
(31.4–93.2)<br />
9977 97.4<br />
(ΔΑ)<br />
7908 97.8<br />
(86.3–99.7)<br />
44<br />
(20–70)<br />
65<br />
(50–80)<br />
38.3<br />
(19.3–63.3)<br />
56.4<br />
(ΔΑ)<br />
43.5<br />
(30.0–58.0)<br />
ΔΑ 93<br />
(91–95)<br />
76<br />
(59–93)<br />
38.3<br />
(19.3–63.3)<br />
100<br />
(ΔΑ)<br />
100<br />
(93.7–100)<br />
85<br />
(83–87)<br />
83.0<br />
(76.6–87.2)<br />
94.3<br />
(ΔΑ)<br />
95.3<br />
(93.5–96.6)<br />
94<br />
(92–95)<br />
98<br />
(98–99)<br />
86.4<br />
(84.7–88.3)<br />
97.3<br />
(ΔΑ)<br />
98.0<br />
(96.7–98.8)<br />
Πίνακας 4.1 Η απόδοση των μεθόδων εξέτασης στον πρωτοβάθμιο έλεγχο με την χρήση της<br />
εξέτασης HPV και τον συνδυασμό ανίχνευσης HPV και κυτταρολογίας σε<br />
γυναίκες άνω των 30 ετών.<br />
Διευκρινήσεις:<br />
ΔΑ = δεν αξιολογήθηκαν, Κυτταρ. = κυτταρολογία, (+) = υψηλότερου βαθμού αλλοίωση,<br />
CI (Confidence Interval) = διάστημα εμπιστοσύνης<br />
* Whitlock E.P. et al., Liquid-Based Cytology and Human Papillomavirus Testing to Screen<br />
for Cervical Cancer: A Systematic Review for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann<br />
Intern Med. 2011;155:687-697<br />
62<br />
ΔΑ<br />
97<br />
(97–98)<br />
95.0<br />
(93.0–96.4)<br />
92.5<br />
(ΔΑ)<br />
93.8<br />
(91.8–95.3) *
4.1.3 Μοριακοί δείκτες<br />
Η ευαισθησία των μεθόδων ανίχνευσης HPV DNA είναι υψηλή όμως<br />
δεν μπορούν να διακρίνουν τις παροδικές λοιμώξεις από τις επίμονες<br />
λοιμώξεις, έτσι στερούνται ειδικότητας. Για αυτό τον λόγο, το ενδιαφέρον<br />
στράφηκε προς τη μελέτη και αξιολόγηση μοριακών δεικτών που είναι πιο<br />
ειδικοί και ικανοί να αναγνωρίσουν τις γυναίκες που είναι επιρρεπής στην<br />
εξέλιξη της νόσου. Οι δείκτες αυτοί θα πρέπει να αναγνωρίζουν τα<br />
διαφορετικά στάδια της κυτταρικής μεταβολής (απάλειψη του ιού, επίμονη<br />
λοίμωξη, εξέλιξη της νόσου) που σχετίζονται με την HPV λοίμωξη και πρέπει<br />
να δίνουν υψηλή θετική προγνωστική αξία όσον αφορά την πρόγνωση της<br />
εξέλιξης της νόσου από αλλοίωση σε ΚΤΜ. Τέτοιοι πιθανοί δείκτες είναι: το<br />
ιικό φορτίο του HPV, η μεθυλίωση του DNA, η ακολουθία του HPV-DNA που<br />
ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή, η τελομεράση και το mRNA των<br />
ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Μερικοί από αυτούς τους δείκτες έχουν εξεταστεί<br />
ελάχιστα στην βιβλιογραφία και έχει αποδειχτεί ότι η έκφραση τους δεν<br />
μπορεί να σχετιστεί με την καθοριστική διάγνωση και διαλογή των γυναικών<br />
με ASCUS λόγω χαμηλής ειδικότητας. Οι δείκτες οι οποίοι έχουν μελετηθεί<br />
εκτενώς στην βιβλιογραφία και έχουν δοκιμαστεί για την διαγνωστική τους<br />
αξία στις προκαρκινικές αλλοιώσεις, καθώς συμμετέχουν στον κυτταρικό<br />
κύκλο και στην απορρύθμισή του από τον HPV, είναι οι:<br />
p16 INK4a<br />
Οι κύκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin-dependent kinases, CDK)<br />
και οι αναστολείς των CDK αποτελούν τα βασικά μόρια που ελέγχουν τον<br />
κυτταρικό κύκλο και συντονίζουν την σύνθεση του DNA, τον διαχωρισμό των<br />
χρωμοσωμάτων και την κυτταρική διαίρεση. Ο αναστολέας p16 INK4a εμποδίζει<br />
την αλληλεπίδραση του CDK4/6 με την κυκλίνη D1, σταματώντας έτσι την<br />
εξέλιξη του κυτταρικού<br />
κύκλου από την φάση G1<br />
στην φάση S. Στα<br />
κύτταρα που έχουν<br />
υποστεί HPV λοίμωξη<br />
παρατηρείται αυξημένη<br />
έκφραση κυκλινών οι<br />
οποίες ανταγωνίζονται<br />
την p16. Προσπαθούν<br />
δηλαδή να συνδεθούν με<br />
τις CDK ώστε να ευνοηθεί<br />
η συνέχιση του<br />
κυτταρικού κύκλου. Στην<br />
συνέχεια η σύνδεση<br />
CDK4/6-κυκλίνηςD<br />
απενεργοποιεί με χημικό<br />
τρόπο (φωσφορυλίωση) το<br />
ρετινοβλάστωμα pRb. Έτσι<br />
Εικόνα 4.1 Θετική χρώση p16 INK4a υψηλού βαθμού<br />
αλλοίωσης σε δείγμα ΚΥΦ. (200x)<br />
63
απελευθερώνονται οι μεταγραφικοί παράγοντες, γεγονός που οδηγεί σε<br />
ανεξέλεγκτη κυτταρική ανάπτυξη δηλαδή σε καρκίνο.<br />
Η χρησιμότητα της ανίχνευσης της υπερέκφρασης του p16 με<br />
ανοσοκυτταροχημικές μεθόδους σε δείγματα ΚΥΦ έχει αναδειχθεί σε πολλές<br />
δοκιμές και έχει γίνει ευρέως αποδεκτή, ειδικά ως συμπληρωματική ανάλυση<br />
για την διαλογή γυναικών που η κυτταρολογική τους εξέταση δείχνει<br />
αμφίβολη ή ήπια αλλοίωση 125-136 . Στην διαλογή γυναικών με ASCUS ή LSIL<br />
έχει αποδειχθεί ότι η ανοσοκυτταροχημική χρώση του p16 σε δείγματα ΚΥΦ<br />
μπορεί να αποδώσει ίδια ποσοστά ευαισθησίας για την ανίχνευση των CIN2+<br />
όσο και η HPV ανάλυση, αλλά σημειώνοντας υψηλότερη ειδικότητα 125 .<br />
Έρευνες CIN1 CIN2 CIN3 Καρκίνος<br />
Sano, 1998 137<br />
Klaes, 2002 138<br />
Agoff, 2003 139<br />
Wang, 2004 140<br />
Hu, 2005 141<br />
Benevolo, 2006 142<br />
Focchi, 2007 143<br />
Σύνολο<br />
8/15 (53%)<br />
15/17 (88%)<br />
43/76 (57%)<br />
27/75 (36%)<br />
20/45 (44%)<br />
17/54 (31%)<br />
80/88 (91%)<br />
252/470 (54%)<br />
16/17 (94%)<br />
10/10 (100%)<br />
60/80 (75%)<br />
12/19 (63%)<br />
43/46 (93%)<br />
9/10 (90%)<br />
33/33 (100%)<br />
247/287 (86%)<br />
27/27 (100%)<br />
43/43 (100%)<br />
103/113 (91%)<br />
19/19 (100%)<br />
51/51 (100%)<br />
11/11 (100%)<br />
32/32 (100%)<br />
391/404 (96%)<br />
38/39 (97%)<br />
46/46 (100%)<br />
47/53 (89%)<br />
8/8 (100%)<br />
44/47 (94%)<br />
257/269 (96%)<br />
Πίνακας 4.2 Ποσοστά ανοσοϊστοχημικής χρώσης p16 σε δείγματα κυτταρολογίας υγρής<br />
φάσης από διάφορες έρευνες 151 .<br />
Το γεγονός όμως ότι και άλλα κύτταρα όπως τα ενδοτραχηλικά,<br />
ενδομητριακά, πλακώδη μεταπλαστικά ή ατροφικά κύτταρα μπορεί να<br />
εμφανίσουν p16 ανοσοαντίδραση, άρα χρώση αυτών των κυττάρων,<br />
οδήγησε στην ανάπτυξη συστήματος βαθμολόγησης με βάση την πυρηνική<br />
αλλοίωση σε κύτταρα που εμφανίζουν ανοσοκυτταροχημική χρώση p16: i)<br />
βαθμός 1: φυσιολογικός πυρήνας, ii)βαθμός 2: ελαφρώς αλλοίωση του<br />
πυρήνα, iii) βαθμός 3: καθαρά αλλοίωση του πυρήνα, iv) βαθμός 4: σοβαρή<br />
αλλοίωση του πυρήνα. Χρησιμοποιώντας αυτή την βαθμολόγηση έρευνες<br />
έχουν δείξει ότι η p16 INK4a ανοσοκυτταροχημική χρώση των hrHPV σε<br />
δείγματα ΚΥΦ έδιναν σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία από ότι τα αρνητικά<br />
δείγματα και τα δείγματα που περιείχαν χαμηλού κινδύνου τύπους του<br />
HPV 134 . Άλλες έρευνες έδειξαν αυξημένα ποσοστά ανίχνευσης CIN2/CIN3 με<br />
την χρήση ανοσοκυτταροχημικής χρώσης p16 INK4a σε παρασκευάσματα<br />
κύβων παραφίνης από δείγματα που έχουν επεξεργαστεί με την μέθοδο<br />
ThinPrep 126 (πίνακας 4.2). Η ανοσοκυτταροχημική χρώση p16 INK4a σε<br />
δείγματα ΚΥΦ, φαίνεται να είναι ένα χρήσιμο και αξιόπιστο προγνωστικό<br />
εργαλείο για την ανίχνευση κυττάρων που έχουν μολυνθεί με hrHPV τύπους<br />
σε συνδυασμό με την κυτταρολογική εξέταση.<br />
64
Ki-67<br />
Η Ki-67 πρωτεΐνη εκφράζεται σε φυσιολογικές συνθήκες στην βασική<br />
και παραβασική στιβάδα κυττάρων κατά την διαδικασία του<br />
πολλαπλασιασμού. Η έκφραση της Ki-67 χρησιμοποιείται στην διαφορική<br />
διάγνωση μεταξύ αρνητικών ατροφικών κυττάρων και θετικών νεοπλαστικών<br />
κυττάρων στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Η έκφραση της πρωτεΐνης<br />
αυτής πέρα από το εσωτερικό 1/3 του τραχηλικού επιθηλίου παρατηρείται σε<br />
περιπτώσεις CIN ή<br />
καρκίνου.<br />
Η<br />
ανοσκυτταροχημική<br />
χρώση Ki-67 φαίνεται<br />
μπορεί να εφαρμοστεί<br />
σε δείγματα<br />
κυτταρολογίας υγρής<br />
φάσης καθώς η<br />
ακρίβεια του τεστ<br />
φτάνει σε καλά<br />
επίπεδα όταν<br />
συγκρίνεται με άλλες<br />
τεχνικές. Επίσης η<br />
χρώση αυτή μπορεί<br />
να χρησιμοποιηθεί ως<br />
συμπληρωματική<br />
εξέταση, μαζί με<br />
άλλους δείκτες, στην<br />
ΚΥΦ για την<br />
διάγνωση HSIL 144 .<br />
Εικόνα 4.2 Ανοσοκυτταροχημική χρώση Ki-67. Ομάδα<br />
ανοσοθετικών κυττάρων υψηλού βαθμού αλλοίωσης.<br />
Δείκτες ενσωμάτωσης και ιικό φορτίο<br />
Το ιικό φορτίο των υψηλού κινδύνου τύπων του HPV έχει προταθεί<br />
ως ένας χρήσιμος δείκτης για να διακριθούν οι λοιμώξεις που έχουν κλινική<br />
σημασία. Μεταξύ των γυναικών που έχουν HPV-DNA θετικό, υψηλότερο ιικό<br />
φορτίο έχει βρεθεί σε εκείνες που φέρουν κυτταρολογικές αλλοιώσεις 145-146 .<br />
Έρευνες όμως που διεξάχθηκαν σε δείγματα ΚΥΦ έδειξαν ότι η σχέση αυτή<br />
ισχύει μόνο γιο τον υψηλού κινδύνου τύπο HPV-16, καθώς στους άλλους<br />
τύπους πολλές φορές δεν βρέθηκε σχέση ποσότητας ιικού φορτίου και<br />
βαθμού σοβαρότητας της λοίμωξης 147-149 .<br />
Η ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή<br />
γίνεται στο Ε2 γονίδιο του HPV. Αυτή η αποδιοργάνωση της φυσιολογικής<br />
του λειτουργίας προκαλεί εντονότερη μεταγραφή των ογκογονιδίων Ε6 και<br />
Ε7. Κατά την επισωμική μορφή το DNA των Ε2 και Ε6 ανευρίσκεται σε ίσες<br />
ποσότητες, ενώ, μετά την ενσωμάτωση το Ε2 βρίσκεται σε μικρότερη<br />
ποσότητα. Αυτό σημαίνει ότι η μείωση στην ποσότητα του DNA κατά την<br />
αναλογία Ε2/Ε6, η οποία αξιολογείται με την real-time PCR, θα μπορούσε να<br />
αποτελέσει έναν αξιόλογο δυναμικό δείκτη της εξέλιξης της νόσου. Τα<br />
δείγματα ΚΥΦ φαίνεται να παρέχουν άριστης ποιότητας κυτταρικό υλικό για<br />
65
τον προσδιορισμό αυτών των δεικτών ακόμα και μετά το πέρας 14ων<br />
ημερών 149-151 .<br />
Έρευνα CIN2/CIN3 Διηθητικός καρκίνος<br />
Rose, 1995<br />
Nakagawa, 1995<br />
Kraus, 2006<br />
Lie, 2005<br />
Molden, 2005<br />
Sotlar, 2004<br />
Σύνολο<br />
19/19 (100%)<br />
225/291 (77%)<br />
13/14 (93%)<br />
95/109 (87%)<br />
352/433 (81%)<br />
28/28 (100%)<br />
31/31 (100%)<br />
199/204 (98%)<br />
20/20 (100%)<br />
278/283 (98%)<br />
Πίνακας 4.3 Ποσοστά ανίχνευσης του mRNA των Ε6/Ε7 σε δείγματα κυτταρολογίας<br />
υγρής φάσης με διάγνωση CIN2/CIN3 και καρκίνωμα 151 .<br />
L1<br />
Ένας άλλος δείκτης αποτελεί ο L1. L1 ονομάζεται η κύρια πρωτεΐνη<br />
του καψιδίου των HPV αλλά είναι και το όνομα του αντισώματος που<br />
παράγεται ενάντια των πρωτεϊνών του καψιδίου του HPV-16 που<br />
εκφράζονται κατά την πρώιμη παραγωγική φάση του κύκλου ζωής του ιού και<br />
χάνεται σταδιακά κατά την καρκινογένεση. Επομένως η έκφραση του<br />
αντισώματος αυτού λειτουργεί με έναν αντίστροφο τρόπο, από ότι οι<br />
υπόλοιποι μοριακοί δείκτες, όσον αφορά την παρουσία της σε σχέση με την<br />
εξέλιξη της νόσου.<br />
Μια πρόσφατη έρευνα η οποία χρησιμοποιούσε δείγματα ΚΥΦ<br />
ανέφερε ότι υψηλότερα ποσοστά χρώσης L1 εμφανίζονται σε περιπτώσεις<br />
LSIL, που σημαίνει ενεργή HPV λοίμωξη 152 . Επιπλέον ο συνδυασμός των<br />
αντισωμάτων L1 και p16 INK4a σε δείγματα ΚΥΦ έχει προταθεί ως δείκτης<br />
πρόγνωσης για περιπτώσεις LSIL. Μάλιστα σε μια πρόσφατη προοπτική<br />
μελέτη αποδείχτηκε η γραμμική σχέση της έκφρασης του L1 με την εξέλιξη ή<br />
την υποχώρηση της LSIL σε λοίμωξη HPV 153 . Βέβαια αυτά αποτελούν<br />
καινούργια ευρήματα και χρήζουν περεταίρω μελέτης.<br />
4.1.4 Νέοι τρόποι προσέγγισης στην πρόληψη του καρκίνου του<br />
τραχήλου της μήτρας με σημαντική προγνωστική αξία<br />
4.1.4.1 Διπλή χρώση p16 INK4a / Ki-67<br />
Πολλές έρευνες έχουν μελετήσει περισσότερους από έναν μοριακό<br />
δείκτη από το ίδιο δείγμα. Οι έρευνες που αξιολόγησαν τον ρόλο των<br />
66
p16 INK4a και Ki-67 ως συμπληρωματικές εξετάσεις σε δείγματα ΚΥΦ,<br />
απέδειξαν ότι η ακρίβεια διάγνωσης των HSIL και πλακώδους καρκίνου<br />
βελτιώθηκε 142,151,154 , επιτρέποντας μια σαφέστερη και πιο αξιόπιστη<br />
διάγνωση. Μια άλλη έρευνα 155 ερεύνησε 500 δείγματα ΚΥΦ και βρήκε ότι η<br />
ανοσκυτταροχημική χρώση για Ki-67 ενίοτε βάφει και φυσιολογικά<br />
πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα τα οποία όμως ήταν αρνητικά με την χρώση<br />
p16 INK4a . Από την άλλη, οι περιπτώσεις πλακώδους μεταπλάσεως δίνουν<br />
ανοσοαντίδραση για p16 INK4a αλλά όχι και για Ki-67. Στην ίδια έρευνα, 199<br />
δείγματα ΚΥΦ με κυτταρολογική διάγνωση αρνητική ή ASCUS αλλά με θετικό<br />
HPV-DNA, βάφτηκαν με ανοσκυτταροχημική χρώση για p16 INK4a και Ki-67<br />
και οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι ο συνδυασμός τους έχει χρήσιμη<br />
προγνωστική αξία για τις γυναίκες με κυτταρολογικά ευρήματα ASCUS. Ως<br />
αποτέλεσμα αυτής της έρευνας ήταν η δημιουργία μιας καινούργιας<br />
ανοσοκυτταροχημικής διπλής χρώσης η οποία ανιχνεύει ταυτοχρόνως την<br />
έκφραση των p16 INK4a και Ki-67 σε δείγματα ΚΥΦ τραχήλου 156-157 . Η διπλή<br />
χρώση p16 INK4a / Ki-67 παρουσίασε ίδια ευαισθησία με την p16 INK4a , αλλά<br />
σαφώς καλύτερη ειδικότητα 156 . Η αύξηση της ειδικότητας οφείλεται στο<br />
γεγονός ότι υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν είναι δυνατή η έκφραση και των<br />
δύο μοριακών δεικτών στο ίδιο κύτταρο, καθώς η p16 INK4a είναι μια πρωτεΐνη<br />
με ογκοκατασταλτική λειτουργία, ενώ ο Ki-67 αποτελεί ένας δείκτης<br />
πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και η δράση τους είναι ανταγωνιστική. Ένα<br />
πιθανό πλεονέκτημα της διπλής χρώσης θα μπορούσε να είναι η<br />
ελαχιστοποίηση ή η εξάλειψη της ανάγκης για κυτταρολογική εξέταση, με<br />
αποτέλεσμα να εξαλειφτούν τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα λόγω<br />
σφαλμάτων κατά την μικροσκόπηση των επιχρισμάτων και να ανοίξει τον<br />
δρόμο στην περεταίρω ανάπτυξη των αυτοματοποιημένων συστημάτων<br />
ελέγχου στο μέλλον. Ως αποτέλεσμα οι έρευνες έχουν δείξει ότι η διπλή<br />
χρώση p16 INK4a / Ki-67 ως συμπληρωματική της ΚΥΦ στο πρόγραμμα<br />
προσυμπτωματικού ελέγχου θα μπορούσε να αποτελέσει έναν αξιόλογο<br />
δείκτης πρόγνωσης για τον ΚΤΜ, όμως απαιτούνται ακόμα περισσότερες<br />
έρευνες για να αποδειχθεί η πραγματική του αξία.<br />
4.1.4.2 Διάγνωση του ΚΤΜ ανιχνεύοντας το mRNA των E6/E7<br />
Όπως περιγράφτηκε και πιο πάνω η ενσωμάτωση του ιικού<br />
γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή έχει ως συνέπεια την συνεχή και<br />
απορυθμισμένη έκφραση των ιικών ογκογονιδίων Ε6/Ε7. Επίμονη έκφραση<br />
των Ε6/Ε7 συνεπάγει, κατά κανόνα, καρκινογένεση λόγω HPV λοίμωξης και<br />
τα τεστ που ανιχνεύουν το mRNA των E6/E7 φαίνεται να είναι πολλά<br />
υποσχόμενα για την αύξησης της ειδικότητας των εξετάσεων για HPV.<br />
Έρευνες έχουν δείξει ότι το υγρό συντήρησης και μονιμοποίησης που<br />
χρησιμοποιείται στην τεχνολογία ΚΥΦ αποτελεί αξιόπιστο υλικό για την<br />
ανίχνευση του mRNA χρησιμοποιώντας την τεχνολογία NASBA (Nucleic acid<br />
67
sequence based amplification) ή την τεχνική RT-PCR 158 . Σε μια άλλη<br />
έρευνα 159 η οποία μελετούσε την απόδοση της εξέτασης για την ανίχνευση<br />
του mRNA των Ε6/Ε7 του HPV σε σύγκριση με την απόδοση της εξέτασης<br />
για την ανίχνευση HPV-DNA (HC2), βρέθηκε ότι η εξέταση ανίχνευσης του<br />
mRNA των Ε6/Ε7 σε δείγματα ΚΥΦ εμφανίζει ίδια ευαισθησία αλλά<br />
υψηλότερη ειδικότητα και θετική προγνωστική αξία από ότι η HPV-DNA<br />
ανάλυση.<br />
Στην αγορά κυκλοφορούν διάφορες δοκιμές ανίχνευσης του mRNA<br />
των Ε6/Ε7 οι οποίες στηρίζονται στην αντίστροφη μεταγραφή με PCR (RT-<br />
PCR) και χρησιμοποιούνται για τους τύπους HPV-16 και HPV-18. Τώρα<br />
κυκλοφορούν στην αγορά τα Nuclisens EasyQ HPV (ή PreTect HPV-<br />
Proofer®, όπως είναι γνωστή σε μερικές χώρες) και το Aptima® HPV. Και οι<br />
δύο δοκιμές είναι συμβατές με δείγματα ΚΥΦ. Η πρώτη μέθοδος βασίζεται<br />
στην ενίσχυση συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεϊκού οξέος (NASBA) για την<br />
ανίχνευση του μRNA των Ε6/Ε7 πέντε τύπων του HPV (16, 18, 31, 33 και<br />
45). Η μέθοδος σε συνδυασμό με την ΚΥΦ έχει αποδειχθεί πολλά<br />
υποσχόμενη διατηρώντας στα ίδια επίπεδα την ευαισθησία αλλά αυξάνοντας<br />
την ειδικότητα από 50% στο 85% για την ανίχνευση CIN2+ αλλοιώσεων όταν<br />
συγκρίθηκε με την HPV-DNA ανάλυση 160-161 . Η δεύτερη μέθοδος στηρίζεται<br />
στην ενίσχυση στόχου νουκλεϊκού οξέος για την ποιοτική ανίχνευση του<br />
mRNA των Ε6/Ε7 14 ων τύπων HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,<br />
58, 59, 66, 68) σε δείγματα ΚΥΦ. Η μέθοδος δίνει πληροφορίες για την<br />
απουσία ή παρουσία του ιού αλλά δεν προσδιορίζει τον συγκεκριμένο τύπο<br />
HPV που είναι παρόν.<br />
Οι μέθοδοι ανίχνευσης του mRNA των Ε6/Ε7 θεωρούνται ως<br />
ιδανικές για την μελλοντική εφαρμογή τους στον πρωτοβάθμιο έλεγχο<br />
κολποτραχηλικών επιχρισμάτων καθώς αυξάνουν την ειδικότητα χωρίς να<br />
μειώνουν την ευαισθησία για την ανίχνευση αλλοιώσεων που πιθανόν να<br />
εξελιχθούν σε CIN2+ από HPV λοίμωξη, μειώνοντας έτσι το άγχος αλλά και<br />
το κόστος για τις γυναίκες που έχουν παροδικές λοιμώξεις.<br />
4.2 Μοριακοί δείκτες για την ανίχνευση του θυρεοειδούς<br />
καρκινώματος σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης<br />
Το θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (ΘΚΘ) αποτελεί τον<br />
συχνότερο τύπο κακοήθειας που εμφανίζεται στον θυρεοειδή αδένα. Η<br />
κυτταρολογική διάγνωση του ΘΚΘ θεωρείται ιδιαίτερα αξιόπιστη και<br />
επιτρέπει την οριστική διάγνωση και προγραμματισμένη θεραπεία καθώς<br />
αυτές στηρίζονται σε συγκεκριμένα κυτταρομορφολογικά χαρακτηριστικά.<br />
Όμως αυτά τα χαρακτηριστικά μπορεί να εμφανιστούν και σε άλλες<br />
αλλοιώσεις του θυρεοειδούς καλοήθεις και κακοήθεις. Σε αυτές τις<br />
περιπτώσεις η ανοσοκυτταροχημεία παίζει σπουδαίο ρόλο προκειμένου να<br />
68
διευκολύνει το αβέβαιο αποτέλεσμα και βοηθάει στην αποφυγή διαγνωστικών<br />
κρυφών κινδύνων (pitfalls).<br />
Αν και η κυτταρολογία αναρρόφησης μέσω λεπτής βελόνης (Fineneedle<br />
aspiration cytology, FNAC) είναι ευρέως αποδεκτή ως πρωταρχική<br />
διαγνωστική διαδικασία των όζων του θυρεοειδούς, μερικές δημοσιευμένες<br />
έρευνες αναφέρονται κυρίως στην εφαρμογή ανοσοκυτταροχημείας στην<br />
τεχνική υγρής φάσης 162 . Σύμφωνα με τελευταίες μελέτες έχει προταθεί ότι<br />
μερικοί διαγνωστικοί και προγνωστικοί δείκτες βελτιώνουν την διαγνωστική<br />
ακρίβεια του ΘΚΘ, αυτοί είναι οι: Cytokeratin-19 (CK-19), HBME-1, Galectin-<br />
3, CD44, CD56, E-cadherin, c-erbB-2, p21cip1, p27kip1, και p16ink4a 163-169 .<br />
Η προεγχειριτική ακριβής διάγνωση του ΘΚΘ είναι πολύ σημαντική<br />
καθώς βάση αυτής καθορίζεται ο τρόπος που θα αντιμετωπιστεί ο καρκίνος.<br />
Η διάγνωση από FNA δείγματα είναι σχετικά εύκολη αφού η νόσος<br />
παρουσιάζει καθορισμένα διαγνωστικά χαρακτηριστικά, όπως πυρηνικές<br />
αυλακώσεις, θυλοειδή φύλλα, μονοστρωματικά φύλλα κυττάρων,<br />
πολυπυρηνικά γιγαντοκύτταρα και ενδοπυρηνικά κυτταροπλασματικά<br />
έγκλειστα. Όμως δεν είναι πάντα δυνατή η παρατήρηση αυτών των<br />
χαρακτηριστικών. Επιπλέον, πολλές φορές η διάκριση μεταξύ καλοήθους και<br />
κακοήθους θηλώδους και θυλακιώδους νεοπλασίας είναι αμφισβητήσιμη.<br />
Αυτός είναι και ο λόγος της εμφάνισης κρυφών κινδύνων 170 . Η διάκριση του<br />
ΘΚΘ από τις άλλες αλλοιώσεις, που μοιράζονται μερικά χαρακτηριστικά, έχει<br />
κλινική σημασία και σπουδαίο ρόλο σε αυτό παίζει η<br />
ανοσοκυτταροχημεία 163,171 .<br />
Από την βιβλιογραφία έχει βρεθεί ότι σε περιπτώσεις ΘΚΘ, οι δείκτες<br />
CK-19, Galectin-3, CD-44, και HBME1 εκφράζονται έντονα 164,166,172-176 .<br />
Επιπλέον η έκφραση των CD-56 και E-cadherin έχει βρεθεί να χάνεται σε<br />
περιπτώσεις ΘΚΘ.<br />
Έχει αναφερθεί ότι η CK-19, μια πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού,<br />
αυξάνεται σημαντικά σε περιπτώσεις ΘΚΘ και βοηθάει στον διαχωρισμό του<br />
ΘΚΘ από καλοήθη ή άλλα κακοήθη καρκινώματα του θυρεοειδούς 163 . Μια<br />
ισχυρή χρώση η μια χρώση λόγω ανοσοέκφρασης της μεμβράνης θεωρείται<br />
δείκτης ΘΚΘ, όμως εστιακή χρώση CK-19 μπορεί να βρεθεί και σε<br />
περιπτώσεις καλοήθους αλλοίωσης. Η Galectin-3 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη<br />
που παίζει σπουδαίο ρόλο κατά στην οργανογένεση. Ανευρίσκεται κυρίως<br />
στο κυτταρόπλασμα και εμπλέκεται στην ρύθμιση μεταξύ των κυττάρων<br />
(κύτταρου-κυττάρου) και μεταξύ κυττάρου-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Η<br />
Galectin-3 χρώση θεωρείται θετική όταν χρωματίζονται είτε η<br />
κυτταροπλασματική μεμβράνη είτε ο πυρήνας. Πολλές έρευνες έχουν δείξει<br />
ότι η χρώση Galectin-3 αποτελεί έναν χρήσιμο δείκτη των κακοήθων όζων<br />
του θυρεοειδούς αν και πολλές έρευνες έχουν παρουσιάσει αντίθετα<br />
αποτελέσματα 177 . Το CD-44, ένα μόριο προσκόλλησης, έχει σχετιστεί με την<br />
προσκόλληση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και την παλιννόστηση<br />
λεμφοκυττάρων. Η CD-44 παρουσιάζει μεταβλητή έκφραση σε ΘΚΘ, στα<br />
οποία εμφανίζεται διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση ή έντονη χρώση της<br />
κυτταρικής μεμβράνης 172 . Ο HBME1 είναι ένας δείκτης των μεσοθηλιακών<br />
κυττάρων και εκφράζεται σε περιπτώσεις κακοήθους θυλακιωδών όγκων του<br />
θυρεοειδούς. Πρόσφατα έχει χρησιμοποιηθεί και ως ανοσοδείκτης σε<br />
περιπτώσεις ΘΚΘ με αυξημένη έκφραση. Ωστόσο αυτή η θετική<br />
69
ανοσοέκφραση δεν σημαίνει αποκλειστικά θηλώδης διαφοροποίηση 178 , όμως<br />
εκφράζεται σε υψηλό ποσοστό περιπτώσεων ΘΚΘ. Το CD-56, ένα<br />
νευρωνικό μόριο προσκόλλησης, παρουσιάζεται στα θυλακιώδη επιθηλιακά<br />
κύτταρα του φυσιολογικού θυρεοειδούς. Σε περιπτώσεις όμως ΘΚΘ αυτό<br />
απουσιάζει 164,172 . Η διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη E-cadherin παίζει<br />
κεντρικό ρόλο στην ακεραιότητα του επιθηλίου, στην προσκόλληση και<br />
διαφοροποίηση των κυττάρων και στην διατήρηση της κυτταρικής<br />
πολικότητας και της κυτταρικής δομής. Η δυσλειτουργία του σχετίζεται με την<br />
εμφάνιση και την μετάσταση όγκου 179 . Από τις έρευνες προκύπτει ότι η<br />
απώλεια της έκφρασης των CD-56 και E-cadherin μπορεί να αποτελεί ένα<br />
αντικειμενικό διαγνωστικό εργαλείο και μπορεί αν είναι εξαιρετικά χρήσιμες<br />
στην διάγνωση του ΘΚΘ, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις με αμφίβολη<br />
κυτταρολογική εμφάνιση 172 . Επίσης ο συνδυασμός των CK-19, CD-44,<br />
HBME1 και Galectin-3, θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν πιθανό δείκτη<br />
της παρουσίας της νόσου. Ιδιαίτερη σημασία έχει δοθεί στον συνδυασμό των<br />
μοριακών δεικτών HBME1 και Galectin-3 καθώς θωρείται ο καλύτερος<br />
συνδυασμός για τον διαχωρισμό καλοηθών από κακοηθών αλλοιώσεων<br />
(πίνακας 4.4). Η απόδοσή τους φαίνεται να είναι εξαιρετική, παρουσιάζοντας<br />
αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα 180 .<br />
Δείκτης n Ευαισθησία Ειδικότητα PPV NPV<br />
GAL-3 + HBME1 142 90.7% 75.0% 69.0% 93.0%<br />
GAL-3 + CK-19 142 83.6% 75.3% 71.8% 85.9%<br />
HBME1 + CK-19 142 82.0% 72.8% 69.4% 84.3%<br />
GAL-3 +HBME1 +CK-19 213 85.2% 74.4% 70.1% 87.7%<br />
Πίνακας 4.4 Σύγκριση της ευαισθησίας, ειδικότητας, PPV και NPV της έκφρασης μεταξύ<br />
συνδυασμένων δεικτών σε αλλοιώσεις του θυρεοειδούς.<br />
Διευκρινήσεις:<br />
PPV (positive predictive value) = θετική προγνωστική αξία, NPV (negative predictive value)<br />
= αρνητική προγνωστική αξία.<br />
Άλλοι πιθανοί δείκτες αποτελούν οι μεταλλάξεις που συμβαίνουν<br />
κατά την ανάπτυξη του ΘΚΘ. Από όλες τις γενετικές μεταλλάξεις που<br />
λαμβάνουν χώρα, και σχετίζονται με τον όγκο του θυρεοειδούς, οι<br />
περισσότερο μελετημένες αποτελούν η σημειακή μετάλλαξη του<br />
πρωτοογκογονιδίου RET που προκαλεί το μυελοειδές καρκίνο του<br />
θυρεοειδούς (κληρονομική μετάλλαξη) , η σποραδική μετάλλαξη που<br />
προκαλεί γενετικό σφάλμα στην οικογένεια των πρωτεϊνών RAS, και η<br />
μετάλλαξη BRAF η οποία αποτελεί την πιο κοινή από τις σωματικές<br />
μεταλλάξεις του ΘΚΘ και πιθανός μια από τις πιο σημαντικές γενετικές<br />
μεταλλάξεις που έχουν ανευρεθεί σε έρευνες για τον καρκίνο του<br />
θυρεοειδούς 181 . Η ανακάλυψη των μεταλλάξεων που συμβαίνουν στον<br />
70
καρκίνο του θυρεοειδούς είναι σημαντική για την κατανόηση του τρόπου με<br />
τον οποίον σχηματίζεται ο καρκίνος αλλά η χρήση τους ξεχωριστά ως<br />
μοριακοί δείκτες δεν είναι πρακτικός τρόπος διάγνωσης της κακοήθειας. Από<br />
την άλλη όμως η συνδυασμένη χρήση τους θα μπορούσε να αποτελέσει μια<br />
πολλά υποσχόμενη μέθοδος προγνωστικών δεικτών.<br />
Το κυτταρολογικό υλικό που χρησιμοποιείται στην συμβατική<br />
κυτταρολογία δεν είναι διαθέσιμο για επιπλέον διερεύνηση είτε λόγω<br />
ανεπαρκής κυτταροβρίθειας, είτε λόγω παρουσίας περίσσιων ποσοτήτων<br />
αίματος, βλέννης ή φλεγμονωδών στοιχείων. Αυτό το κενό καλύπτει η<br />
κυτταρολογία υγρής φάσης με την τεχνολογία της λεπτής επίστρωσης. Η<br />
ποιότητα της ανοσοκυτταροχημικής αντίδρασης σε παρασκευάσματα ΚΥΦ,<br />
όσον αφορά την μορφολογική λεπτομέρεια, και η καθαρότητα του<br />
υποστρώματος είναι καλύτερη της συμβατικής κυτταρολογίας. Η ΚΥΦ<br />
προσφέρει την δυνατότητα δημιουργίας αρχειοθέτησης του υλικού και της<br />
εφαρμογής νέων τεχνικών, όπως η ανοσοκυτταροχημεία στο ίδιο δείγμα,<br />
στοιχείο που δίνει την δυνατότητα επιπλέον και μελλοντικής επανεκτίμησης.<br />
Ο χρυσός κανόνας της ανοσοκυτταροχημείας, προκειμένου να οδηγήσει σε<br />
μια ακριβή διάγνωση, είναι η χρήση μιας ομάδας, τουλάχιστον δύο ή τριών<br />
δεικτών, σε συνδυασμό με την κυτταρομρφολογία 174,182 για την διάγνωση του<br />
ΘΚΘ. Η ΚΥΦ έχει αξιολογηθεί και πιστοποιηθεί σε πολλές έρευνες ως<br />
μέθοδος προεγχειρητικής διάγνωσης των όζων του θυρεοειδούς 182 . Η<br />
μέθοδος αυτή είναι αναπαραγώγιμη, μπορεί να εφαρμοστεί από το<br />
προσωπικό με ελάχιστη εκπαίδευση, είναι ασφαλής, γρήγορη και προσφέρει<br />
την δυνατότητα μιας ακριβής εφαρμογής της ανοσοκυτταροχημείας για την<br />
έρευνα νεοπλασματικών αλλοιώσεων του θυρεοειδούς.<br />
Όλοι αυτοί οι μοριακοί δείκτες συστήνονται μόνο ως<br />
συμπληρωματικοί της κυτταρολογικής μορφολογικής εικόνας για την<br />
διάγνωση της κακοήθειας αφού η χρήση τους ως ανεξάρτητοι δείκτες δεν<br />
είναι, έως τώρα, επαρκής για να τεθεί η διάγνωση.<br />
4.3 Εξελίξεις στην κυτταρολογία του καρκίνου του μαστού<br />
Ο καρκίνος του μαστού είναι ο συχνότερος καρκίνος στις γυναίκες<br />
και προσβάλλει κάθε χρόνο πολλά εκατομμύρια σε όλο τον πλανήτη. Στην<br />
Ελλάδα εμφανίζονται περίπου 3500 νέες περιπτώσεις καρκίνου του μαστού<br />
το χρόνο 183 . Προς το παρόν υπάρχουν τρόποι να περιορισθεί, όχι όμως και<br />
να επιλυθεί το πρόβλημα ολοκληρωτικά. Τρόποι βασισμένοι στην πρόοδο<br />
των απεικονιστικών μεθόδων (ψηφιακή μαστογραφία, ΜRΙ), της<br />
κυτταρολογίας και της γενετικής, σε συνδυασμό με την προληπτική εξέταση<br />
των μαστών για έγκαιρη ανίχνευση.<br />
Ο ρόλος της κυτταρολογίας είναι πολύ σημαντικός τόσο στο πεδίο<br />
της πρώιμης και όψιμης διάγνωσης, όσο και στην παροχή σημαντικών<br />
πληροφοριών προεγχειρητικών, (τύπος, προγνωστικοί/προβλεπτικοί<br />
71
παράγοντες), διεγχειρητικών (εντυπώματα όγκου/φρουρού λεμφαδένα) και<br />
μετεγχειρητικών (υποτροπές, μεταστάσεις). Οι προγνωστικοί παράγοντες<br />
σχετίζονται με την πορεία της νόσου ανεξάρτητα από το είδος της<br />
θεραπευτικής αγωγής ενώ οι προβλεπτικοί επηρεάζουν την πορεία της<br />
νόσου ανάλογα με την επιλογή και εφαρμογή ενός συγκεκριμένου<br />
θεραπευτικού σχήματος. Οι περισσότερο χρήσιμοι προβλεπτικοί παράγοντες<br />
σε επίπεδο ρουτίνας είναι: ER, PR, Her-2/neu ή C-erbB-2, P-53 και Ki-67.<br />
Ανίχνευση της ενίσχυσης του πρωτοογκογονιδίου Her-2neu θεωρήθηκε<br />
σημαντικής προγνωστικής σημασίας βιολογικός δείκτης.<br />
Όπως και στον θυρεοειδή αδένα έτσι και στον μαστό η FNA αποτελεί<br />
ένα χρήσιμο εργαλείο στην διάγνωση των ψηλαφιστών και μη-ψηλαφιστών<br />
αλλοιώσεων του μαστού. Αποτελεί μια ασφαλή, γρήγορη και σχετικά φθηνή<br />
και ανώδυνη διαδικασία.<br />
Οι παλαιότεροι και πλέον εδραιωμένοι μοριακοί προγνωστικοί<br />
παράγοντες στον καρκίνο του μαστού είναι οι ορμονικοί υποδοχείς,<br />
συγκεκριμένα οι υποδοχείς οιστρογόνων (ER) και οι υποδοχείς<br />
προγεστερόνης (PR). Η κατάσταση των ορμονικών υποδοχέων θεωρείται<br />
θετική όταν τουλάχιστον ο ένας από τους δύο τύπους υποδοχέων είναι<br />
θετικός (είτε οι οιστρογονικοί είτε οι προγεστερονικοί είτε και οι δύο). Για την<br />
ανάλυση της κατάστασης των ορμονικών υποδοχέων στον καρκίνο του<br />
μαστού αρχικά χρησιμοποιήθηκαν βιοχημικές μέθοδοι, οι οποίες επέτρεπαν<br />
τη μέτρηση των επιπέδων του κάθε υποδοχέα σε διάλυμα που προέκυπτε<br />
από επεξεργασία και τελικά ρευστοποίηση μέρους του πρωτογενούς όγκου.<br />
Σήμερα, ο προσδιορισμός των ορμονικών υποδοχέων στον πρωτογενή όγκο<br />
γίνεται πιο εύκολα και πιο αντικειμενικά με τη χρήση ανοσοϊστοχημικών<br />
μεθόδων.<br />
Το γονίδιο ERBB2 ή HER2 ή HER2/neu βρίσκεται στο χρωμόσωμα<br />
17. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει, ότι ο πολλαπλασιασμός των αντιγράφων<br />
του γονιδίου αυτού στο γονιδίωμα των καρκινικών κυττάρων σχετίζεται με<br />
πτωχή πρόγνωση και σχετική αντίσταση στην κυτταροτοξική χημειοθεραπεία.<br />
Ο πολλαπλασιασμός των αντιγράφων του ERBB2 στον πρωτογενή όγκο<br />
μπορεί να διαπιστωθεί με ανοσοϊστοχημική χρώση. Η εξέταση αυτή<br />
θεωρείται αρνητική όταν η χρώση αποβεί αρνητική ή ασθενώς θετική (+) και<br />
θετική όταν η χρώση αποβεί ισχυρά θετική (+++). Όταν η χρώση αποβεί<br />
μετρίως θετική (++), τότε θα πρέπει να πραγματοποιηθεί επιπρόσθετη<br />
ανάλυση με φθορίζοντα in situ υβριδισμό (FISH – Fluorescent in situ<br />
Hybridization).<br />
H FISH όμως έχει περιορισμούς, όπως: η εφαρμογή της φέρει την<br />
ανάγκη συνοδείας της από ένα συγκεκριμένο σύστημα απεικόνισης<br />
φθορισμού, περιορισμένη μορφολογική αξιολόγηση σε σχέση με όλο το<br />
ιστολογικό υλικό και ασταθές σήμα ανίχνευσης. Αυτά τα θέματα έχουν<br />
αντιμετωπιστεί με την ανάπτυξη εναλλακτικών μεθοδολογιών in situ<br />
υβριδισμού που βασίζονται σε στρατηγικές ανίχνευσης που μπορεί να<br />
εκτιμηθούν με μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου αντί μικροσκόπιο φθορισμού 184 .<br />
Ο χρωμογόνος in situ υβριδισμός (chromogenic in situ hybridization,<br />
CISH) αποτελεί μια εναλλακτική του FISH για την ανίχνευση του ενισχυμένου<br />
HER2/neu σε μαστικό ιστό που χρησιμοποιεί χρωμογόνο αντί φθορίζουσα<br />
ουσία για την ανίχνευση του υβριδισμένου γονιδίου. Μια άλλη τεχνική η silver<br />
72
in situ hybridization (SISH), παράγει διακριτά σημεία της εναπόθεσης του<br />
μετάλλου από την ενζυμική δράση της υπεροξειδάσης επιτρέποντας<br />
καλύτερη ποσοτική αξιολόγηση του αριθμού των αντιγράφων του γονιδίου. Η<br />
χρήση της συνδυασμένης μορφής του CISH και SISH ή αλλιώς διπλός in situ<br />
υβριδισμός φωτεινού πεδίου (brightfield double in situ hybridization, BDISH)<br />
για την εξέταση της κατάστασης του HER2/neu στο καρκίνο του μαστού<br />
επιτρέπει την απαρίθμηση του χρωμοσώματος 17 και του γονιδίου HER2/neu<br />
στον ίδιο πυρήνα και το αποτέλεσμα είναι συγκρίσιμο με την τεχνική δια<br />
χειρός διπλής χρώσης FISH 184 . Η μέθοδος BDISH είναι μια πολλά<br />
υποσχόμενη εναλλακτική της FISH μεθόδου 184-186 .<br />
Η ανίχνευση της έκφρασης όλων αυτών των δεικτών εφαρμόζεται με<br />
επιτυχία και αξιοπιστία σε κυτταρολογικά υλικά με την τεχνική της<br />
Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης. Σύμφωνα με αποτελέσματα ερευνών η BDISH<br />
εφαρμόζεται εύκολα σε δείγματα ΚΥΦ, πράγμα που έχει μεγάλη σημασία<br />
διότι με την χρήση της καινούργιας μεθόδου σκοπός είναι η αντιμετώπιση του<br />
προβλήματος των ψευδο-θετικών αποτελεσμάτων που δημιουργούνται με<br />
την μέθοδο ICC. H BDISH φαίνεται να προσφέρει μια πιο αντικειμενική<br />
ερμηνεία της κατάστασης του γονιδίου HER2/neu κυρίως με την χρήση της<br />
ΚΥΦ 187 διότι συντηρεί το γενετικό υλικό στην αρχική του κατάσταση ακόμα<br />
και μετά το πέρας 6 μηνών.<br />
Έρευνες έχουν δείξει ότι δείγματα που λαμβάνονται από FNA και<br />
συλλέγονται και επεξεργάζονται με την μέθοδο ΚΥΦ αποτελούν αξιόπιστη<br />
πηγή υλικού για τους διάφορους τύπους ανάλυσης και ανίχνευσης του DNA,<br />
RNA και πρωτεϊνών ακόμα και μήνες μετά την συλλογή του δείγματος αρκεί<br />
αυτό να διατηρηθεί σωστά 188 . Με αυτόν τον τρόπο είναι εφικτή η δημιουργία<br />
τράπεζας γενετικού υλικού, πράγμα ανεκτίμητο για τις μελλοντικές έρευνες.<br />
73
55 ΣΣΧΧΕΕΣΣΗΗ ΚΚΟΟΣΣΤΤΟΟΥΥΣΣ--ΑΑΠΠΟΟΤΤΕΕΛΛΕΕΣΣΜΜΑΑΤΤΙΙΚΚΟΟΤΤΗΗΤΤΑΑΣΣ<br />
ΤΤΗΗΣΣ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗ<br />
Για να εκτιμηθεί η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας της<br />
κυτταρολογίας υγρής φάσης, ώστε αυτή να αποτελέσει την πρωταρχική<br />
μέθοδο στον πρωτοβάθμιο κολποτραχηλικό έλεγχο, πρέπει να αξιολογηθούν<br />
διάφοροι παράγοντες όπως η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου, ο<br />
χρόνος ανάλυσης του επιχρίσματος και το κόστος των σχετικών αναλώσιμων<br />
και εξοπλισμών του εργαστηρίου και αυτά να συγκριθούν στην συνέχεια με<br />
την μέθοδο της συμβατικής κυτταρολογίας.<br />
Έχει αποδειχθεί ότι η ευαισθησία της μεθόδου έχει αυξηθεί με την<br />
ΚΥΦ ενώ η ειδικότητα παραμένει στα ίδια επίπεδα συγκριτικά με την<br />
συμβατική κυτταρολογία. Άλλοι παράγοντες που έχουν βελτιωθεί και<br />
σχετίζονται με το κόστος είναι: η παραγωγικότητα του εργαστηρίου λόγω του<br />
μειωμένου χρόνου εξέτασης ανά επίχρισμα (η επιφάνεια εξέτασης ΚΥΦ<br />
επιχρισμάτων είναι μικρότερη από αυτή των συμβατικών επιχρισμάτων), και<br />
ο συνολικός αριθμός επιχρισμάτων που εξετάζονται λόγω μείωσης στα<br />
ποσοστά μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων (από 9% σε 1,6%) οπότε<br />
λαμβάνονται, επεξεργάζονται και ερμηνεύονται λιγότερα επιχρίσματα. Όσον<br />
αφορά τα αναλώσιμα υλικά αυτά αφορούν τα υλικά που χρησιμοποιούνται<br />
κατά την δειγματοληψία και επεξεργασία (υγρά μονιμοποίησης, φίλτρα κ.λπ.)<br />
του δείγματος. Συγκριτικά με την συμβατική κυτταρολογία τα αναλώσιμα<br />
υλικά που χρησιμοποιούνται στην ΚΥΦ είναι πιο ακριβά 189 . Ο παρακάτω<br />
πίνακας 5.1 παρουσιάζει ενδεικτικά το συνολικό κόστος εφαρμογής της ΚΥΦ<br />
σε εθνικό επίπεδο στο Ηνωμένο Βασίλειο, όπως παρουσιάστηκε σε μια<br />
έρευνα η οποία διενεργήθηκε για να αξιολογήσει την εισαγωγή της ΚΥΦ στο<br />
εθνικό σύστημα υγείας του Ηνωμένου Βασιλείου 189 .<br />
74
Κόστος λήψης δείγματος<br />
Κόστος διαχείρισης*<br />
Κόστος εξοπλισμού παρασκευής<br />
Κόστος προσωπικού παρασκευής<br />
Κόστος αναλώσιμων<br />
Κόστος εξέτασης επιχρισμάτων<br />
Άλλες δαπάνες εργαστηρίου $<br />
Συνολικό κόστος ανά επίχρισμα<br />
Διαφορά με την συμβατική κυτ.<br />
Κόστος τεχνολογίας (€)<br />
Συμβατική ΚΥΦ<br />
Τ3000 Τ2000 PrepStain<br />
39.400<br />
15.400<br />
250<br />
120<br />
1.300<br />
11.600<br />
43.300<br />
111.370<br />
37.500<br />
14.300<br />
2.500<br />
250<br />
19.300<br />
8.600<br />
40.100<br />
122.550<br />
11.180<br />
37.500<br />
14.300<br />
1.600<br />
2.000<br />
19.300<br />
8.600<br />
40.100<br />
123.400<br />
12.030<br />
37.500<br />
14.300<br />
1.100<br />
980<br />
11.900<br />
8.600<br />
40.100<br />
114.480<br />
3.110<br />
Πίνακας 5.1 Κόστος εφαρμογής της ΚΥΦ σε εθνικό επίπεδο στο Ηνωμένο Βασίλειο.<br />
Διευκρινίσεις: οι τιμές αφορούν εργαστήρια που έχουν την ικανότητα να εξετάσουν 60.000<br />
επιχρίσματα το χρόνο, επίσης λαμβάνεται υπόψη ότι το ποσοστό μη ικανοποιητικών<br />
επιχρισμάτων έχει μειωθεί από 9% στο 1,6% με την χρήση της ΚΥΦ.<br />
*γραμματειακές λειτουργίες<br />
$χώροι αποθήκευσης, εκπαίδευση προσωπικού, γραμματειακοί υπάλληλοι κ.ά.<br />
Σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία η ΚΥΦ είναι πιο ακριβή<br />
μέθοδος για το εργαστήριο άρα και για τον ασθενή.<br />
Το αυξημένο κόστος των καινούργιων τεχνολογιών μπορεί να<br />
δικαιολογηθεί μόνο σε περίπτωση που η απόδοσή τους είναι αρκετά<br />
καλύτερη από τις τρέχουσες μεθόδους. Αν και συνολικά οι έρευνες που έχουν<br />
διεξαχθεί αποδεικνύουν ότι η ΚΥΦ βελτιώνει την ευαισθησία ενώ η ειδικότητα<br />
παραμένει σταθερή (κεφάλαιο 3.1), από την άλλη αρκετές είναι και εκείνες οι<br />
έρευνες που υποστηρίζουν ότι η χρήση της ΚΥΦ δεν επιφέρει τέτοια<br />
δραματική βελτίωση στην ευαισθησία που να δικαιολογεί το κόστος της 190 .<br />
Ωστόσο στα ευρήματα όλων των σχετικών ερευνών συμπεριλαμβάνονται: η<br />
στατιστικά σημαντική μείωση στα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων και<br />
η ικανότητα να εφαρμοστούν πολλαπλά επιχρίσματα αλλά και επιπλέον<br />
εξετάσεις (π.χ. μοριακές) από το υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό στο φιαλίδιο<br />
με το συντηρητικό υγρό, στοιχεία που έχουν θετικές οικονομικές επιπτώσεις<br />
τόσο για το εργαστήριο (λιγότερα επιχρίσματα συλλέγονται, επεξεργάζονται<br />
και εξετάζονται) όσο και για τον ασθενή (δεν επισκέπτεται ξανά τον γιατρό για<br />
την λήψη επιπλέον δείγματος).<br />
Πολυάριθμες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι με την χρήση της<br />
εξέτασης HPV βελτιώνεται η ευαισθησία σε μεγάλο ποσοστό συγκριτικά με<br />
την κυτταρολογία αλλά με αντίθετες επιπτώσεις όσον αφορά την ειδικότητα.<br />
Για αυτόν τον λόγο οι μελέτες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι ο<br />
συνδυασμός των δύο τεχνολογιών αποτελεί την καλύτερη λύση. Στις ΗΠΑ ο<br />
πρωτοβάθμιος έλεγχος συμπεριλαμβάνει την χρήση της ΚΥΦ σε συνδυασμό<br />
75
με την HPV DNA ανάλυση σε γυναίκες άνω των 30 ανά τρία χρόνια. Άλλες<br />
χώρες στην Ευρώπη συμπεριλαμβάνουν στον κολποτραχηλικό έλεγχο την<br />
κυτταρολογική εξέταση (συμβατική ή ΚΥΦ) και επιπλέον HPV DNA ανάλυση<br />
σε περιπτώσεις ASCUS κάθε χρόνο, και επίσης ακόμα αξιολογείται η<br />
περίπτωση εφαρμογής της HPV DNA ανάλυσης ως πρωταρχική μέθοδος<br />
στον έλεγχο των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων κάθε δύο ή τρία χρόνια.<br />
Αποτελέσματα ερευνών (εικόνα 5.1) έχουν δείξει ότι η χρήση της<br />
ΚΥΦ κάθε δύο με τρία χρόνια σε συνδυασμό με την HPV DNA ανάλυση<br />
σε περιπτώσεις ASCUS ή η χρήση της HPV DNA ανάλυσης σε<br />
συνδυασμό με την κυτταρολογία σε γυναίκες άνω των 30 ετών είναι<br />
πολύ πιο αποτελεσματικές και λιγότερο δαπανηρές μέθοδοι ελέγχου από ότι<br />
η χρήση της συμβατικής κυτταρολογίας κάθε χρόνο 191-192 . Γενικά όλες οι<br />
έρευνες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι ο έλεγχος που εφαρμόζεται σε<br />
μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα του ενός έτους σε συνδυασμό με την χρήση<br />
πιο ευαίσθητων μεθόδων (παρά μόνο συμβατικής κυτταρολογίας) είναι πολύ<br />
πιθανό να επιφέρει μια εύλογη ισορροπία μεταξύ κόστους και όφελους 192-197 .<br />
Εικόνα 5.1 Διαφορές κόστους και προσδόκιμου ζωής ανάλογα με τις διάφορες στρατηγικές<br />
ελέγχου. Οι στρατηγικές που βρίσκονται στην καμπύλη απόδοσης κυριαρχούν εκείνων που<br />
βρίσκονται δεξιά της καμπύλης επειδή είναι πιο αποτελεσματικές και είτε κοστίζουν λιγότερο<br />
είτε έχουν μία πιο ελκυστική σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας από την αμέσως επόμενη<br />
βέλτιστη στρατηγική. Η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας αντιστοιχεί στην κλίση της<br />
γραμμής που συνδέει τις δύο στρατηγικές ελέγχου που συγκρίνονται, αυτή η κλίση γίνεται<br />
απότομη όταν σημειώνεται αύξηση του προσδόκιμου ζωής ανά δολάριο 193 .<br />
76
Επίσης και η εισαγωγή των αυτοματοποιημένων συστημάτων<br />
ανάλυσης κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έχει θετικό αντίκτυπο στην σχέση<br />
κόστους-αποτελεσματικότητας καθώς με την αύξηση στην ευαισθησία και<br />
ειδικότητα (κεφάλαιο 3.5), την μειωμένη ανάγκη εργαστηριακού προσωπικού,<br />
τον μειωμένο χρόνο ανάλυσης ανά επίχρισμα και όλα αυτά σε συνδυασμό με<br />
τα πλεονεκτήματα που επιφέρει η εφαρμογή της ΚΥΦ και της HPV DNA<br />
ανάλυσης στον πρωτοβάθμιο κολποτραχηλικό έλεγχο, η σχέση κόστουςαποτελεσματικότητας<br />
αναμένεται να φτάσει σε άρτια επίπεδα στο μέλλον<br />
ωφελώντας τόσο τα εργαστήρια όσο και τους ασθενείς.<br />
77
66 ΣΣΥΥΜΜΠΠΕΕΡΡΑΑΣΣΜΜΑΑ<br />
Το τεστ Παπανικολάου έχει αναγνωριστεί ευρέως ως μια<br />
αποτελεσματική μέθοδος για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της<br />
μήτρας (ΚΤΜ). Παρόλα αυτά, περιπτώσεις όπως διφορούμενες και<br />
ανακριβείς διαγνώσεις είναι ένα συχνό φαινόμενο και οι αιτίες είναι: το ευρύ<br />
φάσμα ευαισθησίας (30%-87%) και το ποσοστό των ψευδο-αρνητικών<br />
αποτελεσμάτων (14% έως 33%) που οφείλονται στους περιορισμούς κατά<br />
την δειγματοληψία του δείγματος και την παρασκευή του επιχρίσματος. Η<br />
απάντηση σε αυτούς τους περιορισμούς ήρθε με την εισαγωγή της<br />
Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης, το πρώτο μεγάλο βήμα στον<br />
προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας μετά την<br />
ανακάλυψη του τεστ Παπανικολάου. Η καινούργια αυτή τεχνολογία σημείωσε<br />
περαιτέρω μείωση στα περιστατικά καρκίνου τραχήλου της μήτρας.<br />
Αν και ακόμα μέχρι και σήμερα υπάρχουν διαφωνίες όσον αφορά<br />
την αποτελεσματικότητα της μεθόδου και αν αυτή έχει επιφέρει βελτίωση<br />
στον κολποτραχηλικό έλεγχο σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία, τα<br />
πλεονεκτήματα της ΚΥΦ υπερτερούν της κλασικής μεθόδου και την<br />
καθιστούν ως την προτιμότερη μέθοδο συλλογής, επεξεργασίας και<br />
παρασκευής επιχρισμάτων γυναικολογικής και μη-γυναικολογικής<br />
κυτταρολογίας.<br />
Τα πλεονεκτήματα που κατέστησαν την μέθοδο αυτή δημοφιλή και<br />
την καθιέρωσαν ως την πρωταρχική μέθοδο στον πρωτοβάθμιο<br />
κολποτραχηλικό έλεγχο σε χώρες όπως οι Ηνωμένες Πολιτείες, το Ηνωμένο<br />
Βασίλειο, η Γαλλία και ο Καναδάς, είναι:<br />
Η άμεση μονιμοποίηση, με την οποία επιτυγχάνεται η διατήρηση των<br />
λεπτομερειών του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος στην καλύτερη<br />
δυνατή κατάσταση.<br />
Όλο το υλικό που συλλέγεται είναι διαθέσιμο για μικροσκοπική<br />
αξιολόγηση<br />
Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα προετοιμάζεται για την κυτταρολογική<br />
αξιολόγηση, αλλά ανάλογα με τις ανάγκες, πολλαπλάσια δείγματα<br />
μπορούν να προετοιμαστούν από το ίδιο φιαλίδιο.<br />
78
Το καθαρό υπόστρωμα, με αυτό τον τρόπο τα επιθηλιακά κύτταρα<br />
που έχουν ενδιαφέρον είναι λιγότερο πιθανό να «κρυφτούν».<br />
Τα τυχαιοποιημένα κύτταρα επιστρώνονται σε ένα λεπτό στρώμα<br />
πάνω σε μια σταθερή περιοχή του πλακιδίου. Η περιοχή που<br />
καλύπτεται είναι μικρή και ο χρόνος που απαιτείται για την εξέταση του<br />
είναι μικρότερος από αυτόν που απαιτείται για την εξέταση<br />
συμβατικών παρασκευασμάτων.<br />
Μείωση στα ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων.<br />
Η δυνατότητα εφαρμογής μοριακών εξετάσεων όπως HPV τεστ,<br />
έλεγχο για γονόρροια και χλαμύδια.<br />
Δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης των δειγμάτων<br />
Συνολικά στην γυναικολογική κυτταρολογία η ακρίβεια της μεθόδου<br />
φαίνεται να είναι καλύτερη από της συμβατικής μεθόδου σημειώνοντας<br />
αύξηση στην ευαισθησία, ενώ η ειδικότητα είτε παραμένει στα ίδια επίπεδα<br />
είτε έχει αυξηθεί. Τα ποσοστά ανίχνευσης των χαμηλού βαθμού αλλοιώσεων<br />
του πλακώδους επιθηλίου έχουν αυξηθεί σημαντικά με την χρήση της ΚΥΦ,<br />
όπως επίσης και τα ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS ευρημάτων. Όμως<br />
όσον αφορά την ανίχνευση των HSIL τα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών<br />
αποτελεσμάτων σε αυτή την κατηγορία φαίνεται να είναι υψηλότερα σε σχέση<br />
με τις άλλες κατηγορίες, πράγμα που υποδηλώνει μια δυσκολία στην<br />
αναγνώριση αυτών των κυττάρων. Όμως, η μέθοδος έχει παρουσιάσει<br />
συνολική μείωση στα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων. Στην<br />
μη-γυναικολογική κυτταρολογία οι επιδόσεις της ΚΥΦ είναι πολλά<br />
υποσχόμενες. Η εκπαίδευση των κυτταρολόγων στην ανάλυση αυτών των<br />
επιχρισμάτων είναι κρίσιμο σημείο καθώς τα μη-γυναικολογικά επιχρίσματα<br />
ΚΥΦ παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές με αυτά των συμβατικών<br />
παρασκευασμάτων. Παρόλα αυτά, η ΚΥΦ φαίνεται να είναι η προτιμότερη<br />
μέθοδος για τον κυτταρολογικό έλεγχο ανάμεσα στους κυτταρολόγους και<br />
κυτταροπαθολόγους καθώς, εκτός των άλλων, φέρει σημαντικές βελτιώσεις<br />
στο ποσοστό των ανεπαρκών δειγμάτων, μειώνοντάς το σημαντικά, και<br />
επίσης δίνει την δυνατότητα αυτοματοποίησης στην ανάλυση των<br />
επιχρισμάτων με την χρήση ειδικών συστημάτων όπως είναι: το ThinPrep<br />
Imaging System για την ανάλυση ThinPrep κολποτραχηλικών επιχρισμάτων,<br />
το BD FocalPoint Slide Profiler και το BD FocalPoint GS για την ανάλυση<br />
SurePath κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Με την χρήση των<br />
αυτοματοποιημένων συστημάτων ανάλυσης εικόνας έχει σημειωθεί αύξηση<br />
της ειδικότητας και της ευαισθησίας για την ανίχνευση αλλοιώσεων του<br />
τραχήλου της μήτρας, έχει σημειωθεί αύξηση της παραγωγικότητας και της<br />
απόδοσης του προσωπικού και κατά συνέπεια του εργαστηρίου στο σύνολό<br />
του.<br />
Καθώς ο τομέας της διαγνωστικής κυτταρολογίας οδεύει με γοργά<br />
βήματα προς το μέλλον με την εφαρμογή μοριακών μεθόδων και την<br />
ανακάλυψη της άμεσης σχέσης ορισμένων μοριακών δεικτών με την γέννηση<br />
ή εξέλιξη νεοπλασμάτων, η τεχνολογία της κυτταρολογίας υγρής φάσης<br />
φέρνει ένα τεράστιο προβάδισμα στην ανάπτυξη αυτών των καινούργιων<br />
μεθόδων. Η ΚΥΦ έχει την δυνατότητα εφαρμογής πολλαπλών εξετάσεων<br />
από το ίδιο δείγμα αφού έχει αποδειχτεί ότι συντηρεί σε εξαιρετική κατάσταση<br />
79
τόσο τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων όσο και το νουκλεϊκό οξύ<br />
τους, καθιστώντας έτσι την ανίχνευση του DNA, RNA και πρωτεϊνών των<br />
κυττάρων εφικτή ακόμα και μετά το πέρας αρκετών εβδομάδων, αρκεί το<br />
δείγμα να συντηρηθεί σωστά σε κατάλληλο περιβάλλον.<br />
Επειδή στο 95-100% των περιπτώσεων ΚΤΜ έχει ανευρεθεί το DNA<br />
του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων, ο έλεγχος για την ανίχνευσή του σε<br />
κυτταρολογικά επιχρίσματα αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι<br />
προσυμπτωματικού ελέγχου. Μετά την ανάπτυξη της τεχνολογίας της ΚΥΦ<br />
και την κατανόηση των δυνατοτήτων που αυτή προσφέρει, από το 2001 στις<br />
ΗΠΑ το πρόγραμμα κολποτραχηλικού ελέγχου γυναικών άνω των 30<br />
περιέχει: έλεγχο με την τεχνολογία της ΚΥΦ και συμπληρωματική HPV DNA<br />
ανάλυση από το υπολειπόμενο κυτταρολογικό υλικό κάθε 3 χρόνια με την<br />
χρήση της μοριακής μεθόδου HC2, ενώ για τις γυναίκες που είναι κάτω των<br />
30 ο έλεγχος γίνεται με την μέθοδο ΚΥΦ κάθε 2-3 χρόνια και η HPV DNA<br />
ανάλυση εφαρμόζεται μόνο σε περίπτωση εύρεσης ASCUS στα<br />
κυτταρολογικά τους αποτελέσματα. Με βάση τις σχετικές έρευνες αυτός<br />
βρέθηκε να είναι ο πιο αποτελεσματικός τρόπος διαχείρισης των γυναικών<br />
που συμμετέχουν στον προσυμπτωματικό έλεγχο αφού παρέχει την<br />
καλύτερη δυνατή σχέση μεταξύ οφέλους (προσδόκιμο ζωής) – κόστους. Μια<br />
άλλη προσέγγιση αποτελεί η χρήση της HPV DNA ανάλυσης ως πρωταρχική<br />
μέθοδος στον προσυμπτωματικό έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων σε<br />
δείγματα που λαμβάνονται με την μέθοδο ΚΥΦ και στην συνέχεια, όταν<br />
απαιτείται, εφαρμογή κυτταρολογικής εξέτασης για την διαλογή γυναικών.<br />
Δεδομένου ότι η HPV DNA ανάλυση είναι πιο ευαίσθητη μέθοδος συγκριτικά<br />
με την κυτταρολογική (συμβατική ή ΚΥΦ) και λαμβάνοντας υπόψη τα<br />
ευρήματα διαφόρων ερευνών τα οποία δείχνουν ότι η πλειοψηφία των<br />
γυναικών στην Ευρώπη οι οποίες φέρουν LSIL αλλοίωση έχουν hrHPV τύπο,<br />
οι ερευνητές θεωρούν ότι αυτή η προσέγγιση θα αποτελέσει την ιδανικότερη<br />
μεθοδολογία ελέγχου για τον ΚΤΜ στον γυναικείο πληθυσμό της Ευρώπης.<br />
Πέραν της HPV DNA ανάλυσης, έχει προταθεί η χρήση διαφόρων<br />
μοριακών δεικτών σε δείγματα ΚΥΦ για τον έλεγχο ή την πρόβλεψη εξέλιξης<br />
των HPV αλλοιώσεων σε καρκίνο. Οι μοριακοί αυτοί δείκτες είναι:<br />
η πρωτεΐνη p16 INK4a , η υπερέκφραση της οποίας δείχνει αλλοιώσεις CIN<br />
η έκφραση της πρωτεΐνης πολλαπλασιασμού Ki-67, η οποία σε<br />
περιπτώσεις ανίχνευσής της στην διάμεση και επιφανειακή στιβάδα<br />
δηλώνει αλλοίωση CIN ή καρκίνο<br />
το ιικό φορτίο των hrHPV τύπων, υψηλό ιικό φορτίο σημαίνει παρουσία<br />
αλλοίωσης CIN, η σχέση αυτή έχει αποδειχτεί κυρίως για τον τύπο HPV-<br />
16.<br />
Δείκτες ενσωμάτωσης και η αναλογική τους σχέση, π.χ. η υπερέκφραση<br />
των ιικών δεικτών Ε6 και Ε7 και η μείωση στην ποσότητα του DNA κατά<br />
την αναλογία Ε2/Ε6, η οποία αξιολογείται με την real-time PCR, δηλώνει<br />
εξέλιξη της νόσου.<br />
Η έκφραση της πρωτεΐνης του καψιδίου του HPV, L1, η ανίχνευση της<br />
οποίας δηλώνει αλλοιώσεις CIN (κυρίως σε περιπτώσεις LSIL) και η<br />
σταδιακή της μείωση είναι δείκτης εξέλιξης της νόσου.<br />
Άλλοι τρόποι προσέγγισης αποτελούν οι μοριακές δοκιμές οι οποίες<br />
εφαρμόζονται σε δείγματα που έχουν συλλεχθεί με την τεχνολογία ΚΥΦ και<br />
80
ανιχνεύουν συνδυασμούς μοριακών δεικτών όπως είναι η διπλή<br />
ανοσοκυτταροχημική χρώση p16 INK4a / Ki-67, η οποία θεωρείται ότι αποτελεί<br />
έναν αξιόλογο δείκτη πρόγνωσης του ΚΤΜ, και μοριακές δοκιμές οι οποίες<br />
ανιχνεύουν το mRNA των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7, που αποτελεί<br />
στοιχείο της ενσωμάτωσης του ιικού DNA στο DNA του ξενιστή και του<br />
πολλαπλασιασμού του υβριδίου. Οι μέθοδοι συνδυασμού μοριακών<br />
προγνωστικών δεικτών αποτελούν ιδανικοί υποψήφιοι για την μελλοντική<br />
εφαρμογή τους στο προσυμπτωματικό έλεγχο για τον ΚΤΜ, καθώς αυξάνουν<br />
την ευαισθησία αλλά και την ειδικότητα ανίχνευσης αλλοιώσεων που πιθανόν<br />
να εξελιχθούν σε CIN2+ ή καρκίνο.<br />
Καθώς όμως, μέχρι σήμερα, δεν έχει αποδειχθεί η αξιοπιστία και η<br />
πλήρης διαγνωστική αξία αυτών των μοριακών δεικτών ώστε να<br />
χρησιμοποιηθούν ως μοναδικοί προγνωστικοί δείκτες του ΚΤΜ, μπορούν να<br />
χρησιμοποιηθούν μόνο ως συμπληρωματικοί δείκτες σε συνδυασμό με την<br />
κυτταρολογική εξέταση. Δεδομένου λοιπόν των πλεονεκτημάτων της ΚΥΦ,<br />
δηλαδή την δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης κολποτραχηλικών<br />
επιχρισμάτων, την δυνατότητα εφαρμογής πολλαπλών εξετάσεων από το<br />
ίδιο δείγμα, την άριστη συντήρηση των DNA, RNA και πρωτεϊνών του<br />
κυττάρου για αρκετές εβδομάδες, σε συνδυασμό με την εφαρμογή<br />
συμπληρωματικών εξετάσεων ανίχνευσης μοριακών δεικτών, που έχουν<br />
δείξει εξαιρετικά ποσοστά ευαισθησίας και ειδικότητας και πολύ υψηλή<br />
αρνητική προγνωστική αξία, τα περιστατικά καρκίνου τραχήλου της μήτρας<br />
ενδέχεται να σημειώσουν σημαντική μείωση.<br />
Η μοριακή διάγνωση του καρκίνου δεν έχει περιοριστεί όμως μόνο στην<br />
γυναικολογική κυτταρολογία αλλά αποτελεί ένας πολλά υποσχόμενος τρόπος<br />
διάγνωσης και στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία όπως είναι η διάγνωση<br />
του καρκίνου του θυρεοειδούς και του μαστού. Ενώ η ΚΥΦ κερδίζει ολοένα<br />
και περισσότερο έδαφος ως μέθοδος συλλογής και επεξεργασίας μηγυναικολογικών<br />
δειγμάτων παράλληλα πολλοί είναι εκείνοι που συνεχίζουν<br />
να εκδηλώνουν τις ανησυχίες τους για την εφαρμογή της τεχνολογίας αυτής<br />
στην διάγνωση αλλοιώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς και μαστού. Η ΚΥΦ<br />
παρέχει την δυνατότητα μοριακών εξετάσεων για την ανίχνευση έκφρασης<br />
διαφόρων πρωτεϊνών αλλά και μεταλλάξεων που έχουν ανιχνευτεί στο<br />
γενετικό υλικό καρκινικών κυττάρων. Η ανίχνευσή τους γίνεται με<br />
ανοσκυτταροχημικές χρώσεις όπως ο φθορίζον in situ υβριδισμός (FISH),<br />
ενώ για την ανίχνευση των αλλαγών που υφίσταται το γονιδίωμα των<br />
καρκινικών κυττάρων μαστού τελευταία εφαρμόζονται όλο και πιο πολύ οι<br />
περισσότερο οικονομικά αποδοτικές μέθοδοι, που χρησιμοποιούν την<br />
τεχνολογία της FISH αλλά έχουν κάποιες διαφορές, αυτές είναι: ο<br />
χρωμογόνος in situ υβριδισμός (CISH) που χρησιμοποιεί χρωμογόνο αντί<br />
φθορίζουσα ουσία και ο silver in situ υβριδισμός (SISH). Η νεότερη μέθοδος,<br />
όπως ο συνδυασμός των δύο συστημάτων CISH και SISH (brightfield double<br />
in situ hybridization, BDISH) έχει αποδειχθεί μια πολλά υποσχόμενη<br />
εναλλακτική της FISH μεθόδου για την ανίχνευση γενετικών αλλαγών σε<br />
καρκινικά κύτταρα μαστού. Όλες αυτές οι καινούργιες μέθοδοι θεωρούνται<br />
χρήσιμες, απλές και εύκολα αναπαραγώγιμες με πολύ καλά αποτελέσματα<br />
όσον αφορά την σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας. Η εφαρμογή τους σε<br />
81
δείγματα κυτταρολογίας υγρής φάσης έχει αποδειχτεί ότι είναι πιο ακριβής και<br />
έχει βρεθεί ότι μειώνονται αισθητά τα ψευδο-θετικά αποτελέσματα.<br />
Γενικά η κυτταρολογία υγρής φάσης έχει αποδειχτεί ένα πολύ<br />
δυναμικό διαγνωστικό εργαλείο. Η χρήση της έχει βελτιώσει την διάγνωση<br />
του καρκίνου εισάγοντας νέες δυνατότητες και αποτελώντας την βάση για την<br />
εφαρμογή νέων μεθόδων που αναμένεται να οδηγήσουν την διαγνωστική<br />
κυτταρολογία από την κυτταρομορφολογική διάγνωση στην μοριακή<br />
διάγνωση.<br />
82
ΠΠΕΕΡΡΙΙΛΛΗΗΨΨΗΗ<br />
Το τεστ Παπανικολάου έχει αναγνωριστεί ευρέως ως μια<br />
αποτελεσματική μέθοδος για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της<br />
μήτρας. Οι διάφοροι περιορισμοί της μεθοδολογίας αυτής όμως οδήγησαν<br />
στην ανάπτυξη νέας τεχνικής η οποία αναμένεται να ενισχύσει τον<br />
προσυμπτωματικό έλεγχο για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αυτή<br />
είναι η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης. Η ΚΥΦ έγινε αμέσως αποδεκτή και<br />
υιοθετήθηκε από πολλά εργαστήρια. Πλέον χρησιμοποιείται ευρέως, σχεδόν<br />
σε όλες τις ανεπτυγμένες χώρες για τον έλεγχο κολποτραχηλικών<br />
επιχρισμάτων. Επιπλέον, η χρήση της έχει εισαχθεί και στην μηγυναικολογική<br />
κυτταρολογία για την διάγνωση καρκίνων σε δείγματα όπως<br />
θυρεοειδή και μαστού. Η τεχνική (συλλογή κυτταρικού υλικού σε υγρό μέσο<br />
συντήρησης και μεταφοράς) έχει εγκριθεί από τον FDA και έχει αποδειχτεί ότι<br />
με την χρήση της έχουν αυξηθεί τα ποσοστά ανίχνευσης των τραχηλικών<br />
αλλοιώσεων αυξάνοντας την ευαισθησία ενώ η ειδικότητα παραμένει σε ίδια<br />
επίπεδα. Η επεξεργασία και ανάλυση των επιχρισμάτων ΚΥΦ, τα οποία<br />
έχουν ληφθεί με αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης, έχει αποδειχτεί μια<br />
πολύ επιτυχημένη μεθοδολογία με πολύ καλά αποτελέσματα, η χρήση της<br />
όμως δεν είναι τόσο διαδεδομένη όπως στην γυναικολογική κυτταρολογία<br />
καθώς υπάρχουν ακόμα αντιπαραθέσεις όσον αφορά την<br />
αποτελεσματικότητα της μεθόδου σε δείγματα μη-γυναικολογικής<br />
κυτταρολογίας. Παρόλα αυτά η ΚΥΦ προσφέρει αδιαμφισβήτητα<br />
πλεονεκτήματα, τα οποία αποτέλεσαν την αιτία υιοθέτησής της στα<br />
προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου σε αρκετές χώρες. Τα<br />
πλεονεκτήματα αυτά είναι η δραματική μείωση στο ποσοστό μη<br />
ικανοποιητικών δειγμάτων, δυνατότητα αυτοματοποίησης τόσο στην<br />
επεξεργασία όσο και στην ανάλυση (κολποτραχηλικά παρασκευάσματα) των<br />
επιχρισμάτων με συνέπεια να βελτιωθεί η απόδοση του εργαστηρίου, εύκολη<br />
και γρήγορη δια χειρός ανάλυση των επιχρισμάτων, λόγω των τεχνικών<br />
χαρακτηριστικών της, και δυνατότητα επικουρικών εξετάσεων στο<br />
υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό. Οι έρευνες έχουν δείξει ότι η τεχνική ΚΥΦ<br />
εκτός του ότι παρέχει πολύ καλή συντήρηση των μορφολογικών<br />
χαρακτηριστικών των κυττάρων, συντηρεί σε άριστη κατάσταση και το<br />
νουκλεϊκό οξύ των κυττάρων (DNA και RNA). Δεδομένου λοιπόν της<br />
δυνατότητας εφαρμογής επικουρικών εξετάσεων σε συνδυασμό με την<br />
ικανότητα διατήρησης τόσο των μορφολογικών χαρακτηριστικών όσο και του<br />
γονιδιώματος των κυττάρων, η ΚΥΦ αποτελεί μια κατάλληλη μέθοδος για την<br />
εφαρμογή μοριακών εξετάσεων και παράλληλα αποτελεί ένα χρήσιμο<br />
εργαλείο για μελλοντικές έρευνες.<br />
83
AABBSSTTRRAACCTT<br />
The Pap test is widely recognized as an effective method to prevent<br />
cervical cancer. However, various limitations of this methodology led to the<br />
development of a new technique that is expected to enhance cervical<br />
cytology screening, the Liquid-based cytology (LBC). LBC was immediately<br />
accepted and endorsed by many laboratories and is now extensively used<br />
throughout the developed world for cervical cytology screening. Furthermore,<br />
its use has been introduced to non-gynecological cytology for the diagnosis<br />
of cancer, e.g. thyroid and breast cancer. The LBC technique (collection of<br />
cellular material in liquid medium for preservation and transport) was<br />
approved by FDA and had demonstrated increased detection rates for<br />
cervicovaginal lesions increasing sensitivity while specificity remains the<br />
same. Processing and screening LBC slides, which are obtained by fine-<br />
needle aspirations, has been proved a very successful methodology with<br />
good results. Its use though it is not widespread in non-gynecologic cytology<br />
as it is in gynecologic cytology, as there are still controversies regarding the<br />
effectiveness of the method when used in such samples. Nevertheless, LBC<br />
has major advantages which were the cause for introducing it in screening<br />
programs in several countries. Such advantages are the significant decrease<br />
in unsatisfactory rates, the ability of automation in both processing and<br />
analyzing (cervicovaginal specimen) smears, thus improving laboratory<br />
performance, easy and rapid manual analysis, because of its technical<br />
features, and the ability of ancillary tests on the residual LBC specimen.<br />
Besides providing a good preservation of morphologic features of the cells,<br />
studies have shown that LBC also provides an excellent preservation of<br />
nucleic acid (DNA and RNA). Given the ability of ancillary tests and the<br />
excellent preservation of cell genome, LBC is an appropriate method for the<br />
application of molecular test and is a useful tool for future research.<br />
84
ΒΒΙΙΒΒΛΛΙΙΟΟΓΓΡΡΑΑΦΦΙΙΑΑ<br />
1. Edmund S. Cibas, Barbara S. Ducatman. «Cytology: Diagnostic principals and<br />
clinical correlates», 3rd ed., Elsevier, 2009. ISBN 978-1-4160-5329-3<br />
2. McGoogan E. Liquid-based cytology: the new screening test for cervical cancer<br />
Control. Journal of Family Planning and Reproductive Health Care 2004; 30(2):<br />
123–125<br />
3. Payne N, Chilcott J, McGoogan E. Liquid-based Cytology in Cervical Screening: A<br />
Rapid and Systematic Review. Southampton, UK: The National Co-coordinating<br />
Centre for Health Technology Assessment, 2000.<br />
4. Fahey MT, Irwig L, Macaskill P. Meta-analysis of Pap test accuracy. Am J<br />
Epidemiol 1995; 141: 680–689<br />
5. American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) Committee<br />
Opinion. New Pap test screening techniques. Int J Gynecol Obstet 1998; 63: 312–<br />
314.<br />
6. Nanda K, McCrory DC, Myers ER, Bastian LA, Hasselblad V, Hickey JD, Matchar<br />
DB. Accuracy of the Papanicolaou test in screening for and follow-up of cervical<br />
cytologic abnormalities: a systematic review. Ann Intern Med. 2000 May<br />
16;132(10):810-9<br />
7. Ronco G, Cuzick J, Pierotti P, et al.: Accuracy of liquid-based versus conventional<br />
cytology: Overall results of new technologies for cervical cancer screening:<br />
randomized controlled trial. BMJ 2007;335(7609):28<br />
8. Davey E, Barratt A, Irwig L, et al.: Effect of study design and quality on<br />
unsatisfactory rates, cytology classifications, and accuracy in liquid-based versus<br />
conventional cervical cytology: A systematic review. Lancet 2006;367(9505):122-<br />
132<br />
9. Britt-Marie Ljung. Thyroid Fine-Needle Aspiration: Smears Versus Liquid-based<br />
Preparations. Cancer Cytopath. 2008; 114:144-148<br />
10. Afify AM, Liu J, Al-Kafaji BM. Cytologic artifacts and pitfalls of thyroid fineneedle<br />
aspiration using ThinPrep. Cancer (Cancer Cytopathol). 2001;93:179–186.<br />
11. Michael CW, Hunter B. Interpretation of fine-needle aspirates processed by<br />
the ThinPrep technique: cytologic artifacts and diagnostic pitfalls. Diagn<br />
Cytopathol. 2000;23:6–13.<br />
12. Frost AR, Sidway MK, Ferfelli M, et al. Utility of thin-layer preparations in<br />
thyroid fine-needle aspiration. Cancer (Cancer Cytopathol). 1998;84:17–25.<br />
13. Reinhard Bollmann. Liquid-based cytology for risk-adapted cervical<br />
screening. Gynakol Geburtsmed Gynakol Endokrinol 2008;4(2): 164–180.<br />
www.akademos.de/gyn. ISSN 1614-8533<br />
85
14. M. Arbyn et al. European guidelines for quality assurance in cervical cancer<br />
screening: recommendations for collecting samples for conventional and liquidbased<br />
cytology. Cyt. 2007;18:133–139.<br />
15. Martin-Hirsch P. and colleagues. Efficacy of cervical-smear collection<br />
devices: a systematic review and meta-analysis. Lancet 1999; 354: 1763–70<br />
16. Papanicolaou Technique Approved Guidelines (NCCLS Document GP15-A2)<br />
17. ThinPrep® 2000 System Operator’s Manual, CYTYC. 2007<br />
18. SurePath® Collection Product Insert – 779-07084-00 Rev. F, Becton,<br />
Dickinson and Company 2011: 3 www.bd.com<br />
19. Monsonego J. Emerging issues of HPV infections: From science to practice.<br />
Basel, Karger, 2006: 149<br />
20. PrepStain® System Product Insert – 779-07085-00 Rev. F, Becton,<br />
Dickinson and Company 2011: 1 www.bd.com<br />
21. BD CytoRich Non-Gyn, Non-Gynecological Applications Procedures &<br />
Protocols, BD Diagnostics, 2007<br />
22. CytoRich Red preservative Fluid Product Insert - 779-10004-02 REV C. F,<br />
Becton, Dickinson and Company 2011: 1 www.bd.com<br />
23. Renshaw ΑΑ, Mody DR, Walsh M, Bentz JS, Colgan TJ. The significance in<br />
certification in Liquid based cytology. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1269–1272<br />
24. ThinPrep Pap Test morphology. Reference Atlas. Section one. Microscopic<br />
evaluation of ThinPrep Slides. Deanna K. Iverson. [www.cytologystuff.com]<br />
25. Wilbur DC, Prey MU, Miller WM, Pawlick GF, Colgan TJ. The AutoPap<br />
System for primary screening in cervical cytology. Comparing the results of a<br />
prospective, intended-use study with routine practice. Acta Cytol 1998;42:214–20<br />
26. Koss LG, Sherman ME, Cohen MB, Anes AR, Darragh TM, Lemos LB, et al.<br />
Significant reduction in the rate of false-negative cervical smears with a neural<br />
network-based technology (PAPNET Testing System). Hum Pathol<br />
1997;28:1196–203<br />
27. Ashfaq R, Liang Y, Saboorian MH. Evaluation of PAPNET system for<br />
rescreening of negative cervical smears. Diagn Cytopathol 1995;13:31–6<br />
28. Bibbo M, Hawthorne C, Zimmerman B. Does. Use of the AutoPap assisted<br />
primary screener improve cytologic diagnosis? Acta Cytol 1999;43:23-6.<br />
[PUBMED]<br />
29. Lozano R. Comparison of computer-assisted and manual screening of<br />
cervical cytology. Gynecol Oncol 2007;104:134-8. [PUBMED]<br />
30. Miller FS, Nagel LE, Kenny-Moynihan MB. Implementation of the ThinPrep<br />
imaging system in a high-volume metropolitan laboratory. Diagn Cytopathol<br />
2007;35:213-7. [PUBMED<br />
31. Schledermann D, Hyldebrandt T, Ejersbo D, Hoelund B. Automated<br />
screening versus manual screening: A comparison of the ThinPrep imaging<br />
system and manual screening in a time study. Diagn Cytopathol 2007;35:348-52.<br />
[PUBMED]<br />
32. Roberts JM, Thurloe JK, Bowditch RC, Hyne SG, Greenberg M, Clarke<br />
JM, et al . A three-armed trial of the ThinPrep imaging system. Diagn Cytopathol<br />
2007;35:96-102. [PUBMED]<br />
33. Wilbur DC et al. he Becton Dickinson FocalPoint GS Imaging System. Am J<br />
Clin Pathol 2009; 132: 767-775.<br />
34. Anqelique W. Levi et al. Implementation of FocalPoint GS location-guided<br />
imaging system. Cancer (Cancer Cytopathol) 2011;120<br />
35. Abulafia O, Pezzullo JC, Sherer DM. Performance of ThinPrep liquid-based<br />
cervical cytology in comparison with conventionally prepared Papanicolaou<br />
smears: a quantitative survey. Gynecol Oncol. 2003;90:137-144<br />
86
36. Bernstein SJ, Sanchez-Ramos L, Ndubisi B. Liquid-based cervical cytologic<br />
smear study and conventional Papanicolaou smears: a metaanalysis of<br />
prospective studies comparing cytologic diagnosis and sample adequacy. Am J<br />
Obstet Gynecol. 2001;185:308-317<br />
37. Klinkhamer PJ, Meerding WJ, Rosier PF, Hanselaar AG. Liquid-based<br />
cervical cytology. Cancer. 2003;99:263-271<br />
38. Arbyn M, Bergeron C, Klinkhamer P, et al. Liquid compared with<br />
conventional cervical cytology: a systematic review and meta-analysis. Obstet<br />
Gynecol. 2008;111:167-177<br />
39. Hartmann KE, Hall SA, Nanda K, Boggess JF, Zolnoun D. Screening for<br />
Cervical Cancer. Systematic Review No. 25. Rockville, MD: Agency for<br />
Healthcare Research and Quality; 2002<br />
40. Sulik S, Kroeger K, Schultz J. et al. Are fluid-based cytologies superior to the<br />
conventional Papanicolaou test? A systematic review. J Fam Pract 2001; 50:<br />
1040-1046<br />
41. Arbyn M, Buntinx F, Van Ranst M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Dillner<br />
J (2004) Virologic versus cytologic triage of women with equivocal Pap smears: a<br />
meta-analysis of the accuracy to detect high-grade intraepithelial neoplasia. J Natl<br />
Cancer Inst 96(4): 280–293<br />
42. Cox JT. Liquid-based cytology: evaluation of effectiveness, costeffectiveness,<br />
and application to present practice. J Natl Compr Canc Netw. 2004<br />
Nov;2(6):597-611<br />
43. Eversole GM, Moriarty AT, Schwartz MR, et al. Practices of participants in<br />
the College of American Pathologists interlaboratory comparison program in<br />
cervicovaginal cytology, 2006. Arch Pathol Lab Med. 2010;134:331-335<br />
44. Lee KR, Ashfaq R, Birdson GG, et al. Comparison of conventional<br />
Papanicolaou smears and a fluid-based, thin-layer system for cervical cancer<br />
screening. Obstet Gynecol. 1997;90:278-284<br />
45. Hatch KD, Sheets E, Kennedy A, et al. Multicenter direct to vial evaluation of<br />
a liquidbased pap test. J Low Genit Tract Dis. 2004;8:308-312<br />
46. Ashfaq R, Gibbons D, Vela C, et al. ThinPrep Pap test. Accuracy for<br />
glandular disease. Acta Cytol. 1999;43:81-85<br />
47. Bai H, Sung CJ, Steinhoff MM. ThinPrep Pap test promotes detection of<br />
glandular lesions of the endocervix. Diagn Cytopathol. 2000;23:19-22<br />
48. Carpenter AB, Davey DD. ThinPrep Pap test: performance and biopsy<br />
follow-up in a university hospital. Cancer. 1999;87:105-112<br />
49. Guidos BJ, Selvaggi SM. Detection of endometrial adenocarcinoma with the<br />
ThinPrep Pap test. Diagn Cytopathol. 2000;23:260-265<br />
50. Schorge JO, Hossein Saboorian M, Hynan L, Ashfaq R. ThinPrep detection<br />
of cervical and endometrial adenocarcinoma: a retrospective cohort study.<br />
Cancer. 2002;96:338-343<br />
51. Wang N, Emancipator SN, Rose P, et al. Histologic follow-up of atypical<br />
endocervical cells. Liquid-based, thin-layer preparation vs. conventional Pap<br />
smear. Acta Cytol. 2002;46:453-457<br />
52. Marino JF, Fremont-Smith M. Direct-to-vial experience with AutoCyte PREP<br />
in a small New England regional cytology practice. J Reprod Med. 2001;46:353-<br />
358<br />
53. ] Fremont-Smith M, Marino J, Griffin B, et al. Comparison of the SurePath<br />
liquid-based Papanicolaou smear with the conventional Papanicolaou smear in a<br />
multisite direct-to-vial study. Cancer. 2004;102:269-279<br />
54. Clayton et al. Comparison of ThinPrep Preparations to Other Preparation<br />
Types in Gastrointestinal Cytology. Arch Pathol Lab Med. 2010;134:1116–1120<br />
87
55. Bishop JW, MacFarlane K, Cheubront D, et al. Cell recovery and appearance<br />
in thin-layer preparations in nongynecologic cytology. Anal Quant Cytol Histol.<br />
1998;20(4):229–237<br />
56. Elsheikh TM, Kirkpatrick JL, Wu HH. Comparison of ThinPrep and cytospin<br />
preparations in the evaluation of exfoliative cytology specimens. Cancer (Cancer<br />
Cytopathol). 2006;108(3):144–149<br />
57. Leung CS, Chiu B, Bell V. Comparison of ThinPrep and conventional<br />
preparations: nongynecologic cytology evaluation. Diagn Cytopathol.<br />
1997;16(4):368–371<br />
58. Moriarty AM, Schwartz MR, Ducatman BS, et al. A liquid concept—do classic<br />
preparations of body cavity fluid perform differently than ThinPrep cases? Arch<br />
Pathol Lab Med. 2008;132(11):1716–1718<br />
59. Laucirica R, Bentz JS, Souers RS, et al. Do liquid-based preparations of<br />
urinary cytology perform differently than classically prepared cases: observations<br />
from the College of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in<br />
Nongynecologic Cytology. Arch Pathol Lab Med. 2010;134(1):19–22<br />
60. Volmar KE, Vollmer RT, Routbort MJ, et al. Pancreatic and bile duct brushing<br />
cytology in 1000 cases: review of findings and comparison of preparation<br />
methods. Cancer. 2006;108(4):231–238<br />
61. Siddiqui MT, Gokaslan ST, Saboorian MH, et al. Comparison of ThinPrep<br />
and conventional smears in detecting carcinoma in bile duct brushings. Cancer.<br />
2003;99(4):205–210<br />
62. Ylagan LR, Liu LH, Maluf HM. Endoscopic bile duct brushing of malignant<br />
pancreatic biliary strictures: retrospective study with comparison of conventional<br />
smear and ThinPrep techniques. Diagn Cytopathol. 2003;28(4):196–204<br />
63. Minamiguchi S, McEvoy R, Fraig M, et al. Bile duct brushings on ThinPrep:<br />
experience with 68 specimens. Diagn Cytopathol. 2004;30(4):292–293<br />
64. DEY P., LUTHRA U. K., GEORGE J., ZUHAIRY F., GEORGE S. S., HAJI B.<br />
I. Comparison of ThinPrep and conventional preparations on fine needle<br />
aspiration cytology material, Acta Cytol, 2000, 44(1):46–50<br />
65. BÉDARD Y. C., POLLETT A. F., Breast fine-needle aspiration. A<br />
comparison of ThinPrep and conventional smears, Am J Clin Pathol, 1999,<br />
111(4):523–527<br />
66. RANA D. N., O’DONNELL M., MALKIN A., GRIFFIN M., A comparative<br />
study: conventional preparation and ThinPrep 2000 in respiratory cytology,<br />
Cytopathology, 2001, 12(6):390–398<br />
67. COCHAND-PRIOLLET B., PRAT J. J., POLIVKA M., THIENPONT L.,<br />
DAHAN H., WASSEF M., GUILLAUSSEAU P. J., Thyroid fine needle<br />
aspiration: the morphological features on ThinPrep slide preparations. Eighty<br />
cases with histological control, Cytopathology, 2003, 14(6):343–349<br />
68. Renshaw et al. Comparison of Performance of Conventional and ThinPrep<br />
Gynecologic Preparations in the College of American Pathologists Gynecologic<br />
Cytology Program. Arch Pathol Lab Med. 2004;128:17–22<br />
69. Linder J, Zahniser D. ThinPrep Papanicolaou testing to reduce false-negative<br />
cervical cytology. Arch Pathol Lab Med. 1998;122:139–144<br />
70. LEE K. R., PAPILLO J. L., ST. JOHN T., EYERER G. J. A., Evaluation of<br />
the ThinPrep processor for fine needle aspiration specimens, Acta Cytol, 1996,<br />
40(5):895–899<br />
71. Solomon D, Nayar R. The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology:<br />
Definitions, Criteria and Explanatory Notes, 2nd edn. New York: Springer-Verlag;<br />
2004<br />
72. ] Geyer JW, Carrico C, Bishop JW. Cellular constitution of Autocyte PREP_<br />
cervico-vaginal samples with biopsy-confirmed HSIL. Acta Cytol 2000;44:505<br />
88
73. Studeman KD, Ioffe OB, Puszkiewicz J, Sauvegeot J, Henry MR. Effect of<br />
cellularity on the sensitivity of detecting squamous lesions in liquid-based cervical<br />
cytology. Acta Cytol 2003;47:605–10<br />
74. Bolick DR, Kerr J, Staley BE, Ke Lin K. Effect of cellularity in the detection<br />
rates of high grade and low grade squamous intraepithelial lesions. Acta Cytol<br />
2002;46:922–3<br />
75. McQueen F. Duval E. The definition of an adequately cellular LBC specimen.<br />
Cytopathology 2006;17:168–74<br />
76. Siebers, Klinkhamer, Vedder, Arbyn, Bulten. Causes and Relevance of<br />
Unsatisfactory and Satisfactory but Limited Smears of Liquid-Based Compared<br />
With Conventional Cervical Cytology. Arch Pathol Lab Med. 2012;136:76–83;doi:<br />
10.5858/arpa.2011-0113-OA<br />
77. Corkill M, Knapp D, Martin J, Hutchinson ML. Specimen adequacy of<br />
ThinPrep sample preparations in a direct-to-vial study. Acta Cytol. 1997;41(1):39–<br />
44<br />
78. Duggan MA, Khalil M, Brasher PMA, Nation JG. Comparative study of<br />
theThinPrep Pap test and conventional cytology results in a Canadian cohort.<br />
Cytopathology. 2006;17(2):73–81<br />
79. Moriarty AT, Clayton AC, Zaleski S, et al. Unsatisfactory reporting rates. Arch<br />
Pathol Lab Med. 2009;133(12):1912–1916<br />
80. Alsharif M, McKeon DM, Gulbahce HE, Savik K, Pambuccian SE.<br />
Unsatisfactory SurePath liquid-based Papanicolaou tests. Cancer Cytopathol.<br />
2009;117(1):15–26<br />
81. Martin H. Luu, Andrew H. Fischer, Latha Pisharodi, Christopher L. Owens.<br />
Improved Preoperative Definitive Diagnosis of Papillary Thyroid Carcinoma in<br />
FNAs Prepared With Both ThinPrep and Conventional Smears Compared With<br />
FNAs Prepared With ThinPrep Alone. Cancer (Cancer Cytopathol) 2011;119:68–<br />
73<br />
82. Andra R. Frost, Mary K. Sidawy, Mary Ferfelli, Sana O. Tabbara, M, Nicole<br />
A. Bronner, Keith R. Brosky, Mark E. Sherman. Utility of Thin-Layer Preparations<br />
in Thyroid Fine-Needle Aspiration. Cancer (Cancer Cytopathol) 1998;84: 17–25<br />
83. Alaa M. Afify, Jing Liu, Basim M. Al-Khafaji. Cytologic Artifacts and Pitfalls of<br />
Thyroid Fine-Needle Aspiration Using ThinPrep. Cancer (Cancer Cytopathol)<br />
2001;93:179–186<br />
84. Jeremy R. Parfitt, C. Meg McLachlin, Michele M. Weir. Comparison of<br />
ThinPrep and Conventional Smears in Salivary Gland Fine-Needle Aspiration<br />
Biopsies. Cancer (Cytopathol) 2007;111:123–9<br />
85. Chhieng DC, Talley LI, Roberson J, et al. Interobserver variability:<br />
Comparison between liquid-based and conventional preparations in gynecologic<br />
cytology. Cancer (Cytopathol). 2002;96:67–73<br />
86. Wilbur DC, Dubeshter B, Angel C, Atkison KM. Use of thin-layer preparations<br />
for gynecologic smears with emphasis on the cytomorphology of high grade<br />
intraepithelial lesions and carcinomas. Diagn Cytopathol. 1996;14:201– 211<br />
87. Renshaw et al The Significance of Certification in Liquid-Based Cytology and<br />
Performance in the College of American Pathologists Interlaboratory Comparison<br />
Program in Cervicovaginal Cytopathology. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1269–<br />
1272<br />
88. de Luna R, Eloubeidi MA, Sheffield MV, Eltoum I, Jhala N, Jhala D, Chen<br />
VK, Chhieng DC. Comparison of ThinPrep® and conventional preparations in<br />
pancreatic fine-needle aspiration biopsy. Diagn. Cytopathol. 2004;30:71–76<br />
89. Belinson JL, Qiao YL, Pretorius RG, Zhang WH, Rong SD, Huang MN, et al.<br />
Shanxi Province cervical cancer screening study. II: Self-sampling for high-risk<br />
89
human papillomavirus compared to direct sampling for human papillomavirus and<br />
liquid based cervical cytology. Int J Gynecol Cancer 2003;13:819–26<br />
90. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, et al.<br />
Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at recruitment<br />
from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial. J Natl<br />
Cancer Inst 2006;98:765–74<br />
91. Emilia H. Koumans, et al. Comparison of Methods for Detection of<br />
Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Using Commercially Available<br />
Nucleic Acid Amplification Tests and a Liquid Pap Smear Medium. J. Clinc.<br />
Microb. 2003;4: 1507–1511<br />
92. Chernesky et al. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria<br />
gonorrhoeae Infections in North American Women by Testing SurePath Liquid-<br />
Based Pap Specimens in APTIMA Assays. J. Clin. Microbiol. 2007, 45(8):2434<br />
93. Chernesky et al. Abilities of APTIMA, AMPLICOR, and ProbeTec Assays To<br />
Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in PreservCyt ThinPrep<br />
Liquid-Based Pap Samples. J. Clin. Microbiol. 2007, 45(8):2355<br />
94. Shahidul Islam et al. Reprocessing unsatisfactory ThinPrep Papanicolaou<br />
test specimens increases sample adequacy and detection of significant<br />
cervicovaginal lesions. Cancer Cytopath. 2004 ;102:67–73<br />
95. Grapsa et al. Repeat Processing of Residual ThinPrep Pap Tests: Sampling<br />
of the Vial May Not Be Invariably Homogeneous. Acta Cytologica 2011;55:213-<br />
217<br />
96. Sin Hang Lee et al. Molecular tests for human papillomavirus (HPV),<br />
Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in liquid-based cytology<br />
specimen. BMC Women's Health 2009, 9:8<br />
97. Khalbuss WE, Pananowitz L, Parwani AV. Digital imaging in cytopathology.<br />
Pathology research international. Volume 2011, article ID 264683, 10 pages, Doi:<br />
10.4061/2011264683<br />
98. Dziura B, Quinn S, Richard K. Performance of an imaging system vs. manual<br />
screening in the detection of squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix.<br />
Acta Cytol 2006;50:309-11<br />
99. Pantanowitz L, Maryanne Hornish, Robert A Goulart. The impact of digital<br />
imaging in the field of cytopathology. CytoJournal 2009;6:6 [SIENCE DIRECT]<br />
100. Colgan TJ, Patten SF, Lee JS. A clinical trial of the AutoPap 300 QC System<br />
for quality control of cervicovaginal cytology in the clinical laboratory. Acta Cytol<br />
1995;39:1191-8<br />
101. Alasio LM, Alphandery C, Grassi P, Ruggeri M, De Palo G, Pilotti S.<br />
Performance of the AutoPap Primary Screening System in the detection of highrisk<br />
cases in cervicovaginal smears. Acta Cytol 2001;45:704-8. [PUBMED]<br />
102. Teach WD. Validation of AutoPap primary screening system sensitivity and<br />
high-risk performance. Acta Cytol 2002;46:296-302<br />
103. Parker EM, Foti JA, Wilbur DC. FocalPoint slide classification algorithms<br />
show robust performance in classification of high-grade lesions on SurePath<br />
liquid-based cervical cytology slides. Diagn Cytopathol 2004;30:107-10.<br />
[PUBMED]<br />
104. Biscotti CV, Dawson AE, Dziura B, Galup L, Darragh T, Rahemtulla A, et al .<br />
Assisted primary screening using the automated ThinPrep imaging system. Am J<br />
Clin Pathol 2005;123:281-7. [PUBMED]<br />
105. Passamonti B, Bulletti S, Camilli M, D′Amico MR, Di Dato E, Gustinucci D, et<br />
al . Evaluation of the FocalPoint GS System performance in an Italian populationbased<br />
screening of cervical abnormalities. Acta Cytol 2007;51:865-71. [PUBMED]<br />
90
106. Chivukula M, Saad RS, Elishaev E, White S, Mauser N, Dabbs DJ.<br />
Introduction of the ThinPrep Imaging System (TIS): Experience in a high volume<br />
academic practice. CytoJournal 2007;4:6<br />
107. Thrall MJ, Russell DK, Bonfiglio TA, Hoda RS. Use of the ThinPrep®<br />
Imaging System does not alter the frequency of interpreting Papanicolaou tests as<br />
atypical squamous cells of undetermined significance. Cytojournal 2008;24;5:10<br />
108. Eltoum IA, Roberson J. Impact of HPV testing, HPV vaccine development,<br />
and changing screening frequency on national Pap test volume: Projections from<br />
the National Health Interview Survey (NHIS). Cancer 2007;111:34-40. [PUBMED]<br />
109. Eltoum IA, Roberson J. Impact of expected changes in national papanicolaou<br />
test volume on the cytotechnology labor market: an impending crisis. Am J Clin<br />
Pathol 2007;128:665-70. [PUBMED]<br />
110. Πανοτοπούλου-Φλαμπουράρη Ε. HPV και καρκίνος του τραχήλου της<br />
μήτρας. Η φυσική ιστορία της λοίμωξης βάσει επιδημιολογικών και κλινικών<br />
δεδομένων.<br />
http://www.ddy.gr/LinkClick.aspx?fileticket=7SXRAx5D15E%3D&tabid=108&mid=<br />
465&language=en-US<br />
111. Castle et al. Comparison between Prototype Hybrid Capture 3 and Hybrid<br />
Capture 2 Human Papillomavirus DNA Assays for Detection of High-Grade<br />
Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cancer. J. Clin Microbiol. 2003;41(9):4022–<br />
4030<br />
112. Davy Vanden Broeck. «Human Papillomavirus and Related Diseases – From<br />
Bench to Bedside – Research Aspects», InTech, Rijeka, Croatia, 2012, ISBN 978-<br />
953-307-855-7<br />
113. Huang et al. Comparsion between the Hybrid Capture II test and an<br />
SPF1/GP6+ PCR-Based Assay for Detection of Human Papillomavirus DNA in<br />
Cervical Swab Samples<br />
114. Jain S, Tseng C-J, Horng S-G, Soong Y-K, Pao CC. Negative predictive<br />
value of human papillomavirus test following conization of the cervix uteri.<br />
Gynecol Oncol. 2001;82:177–180<br />
115. Lin C-T, Tseng C-J, Lai C-H, et al. Value of human papillomavirus<br />
deoxyribonucleic acid testing after conization in the prediction of residual disease<br />
in the subsequent hysterectomy specimen. Am J Obstet Gynecol. 2001;184:940–<br />
945<br />
116. Paraskevaidis E, Koliopoulos G, Alamanos Y, Malamou-Mitsi V, Lolis ED,<br />
Kitchener HC. Human papillomavirus testing and the outcome of treatment for<br />
cervical intraepithelial neoplasia. Obstet Gynecol. 2001;98:833–836<br />
117. Goldie SJ, Kim JJ, Wright TC. Cost-effectiveness of human papillomavirus<br />
DNA testing for cervical cancer screening in women aged 30 years or more.<br />
Obstet Gynecol. 2004;103(4):619-31<br />
118. Arbyn, M., Martin-Hirsch, P., Buntinx, F., Van Ranst, M., Paraskevaidis, E. &<br />
Dillner, J.. Triage of women with equivocal or low-grade cervical cytology results:<br />
a meta-analysis of the HPV test positivity rate. J Cell Mol Med, 2009;13(4):648-<br />
659<br />
119. Arbyn, M., Sankaranarayanan, R., Muwonge, R., Keit,a N., Dolo, A.,<br />
Mbalawa, C.G., Nouhou, H., Sakande. B., Wesley, R., Somanathan, T., Sharma,<br />
A., Shastri, S. & Basu, P.. Pooled analysis of the accuracy of five cervical cancer<br />
screening tests assessed in eleven studies in Africa and India. Int J Cancer<br />
2008;1;123(1): 153-160<br />
120. Petry KU, Menton S, Menton M, van Loenen-Frosch F, de Carvalho Gomes<br />
H, Holz B, et al. Inclusion of HPV testing in routine cervical cancer screening for<br />
women above 29 years in Germany: results for 8466 patients. Br J Cancer.<br />
2003;88:1570-7. [PMID: 12771924]<br />
91
121. Bigras G, de Marval F. The probability for a Pap test to be abnormal is<br />
directly proportional to HPV viral load: results from a Swiss study comparing HPV<br />
testing and liquid-based cytology to detect cervical cancer precursors in 13,842<br />
women. Br J Cancer. 2005;93:575-81. [PMID: 16136031]<br />
122. Ca´rdenas-Turanzas M, Nogueras-Gonzalez GM, Scheurer ME, Adler-<br />
Storthz K, Benedet JL, Beck JR, et al. The performance of human papillomavirus<br />
high-risk DNA testing in the screening and diagnostic settings. Cancer Epidemiol<br />
Biomarkers Prev. 2008;17:2865-71. [PMID: 18843032]<br />
123. Coste J, Cochand-Priollet B, de Cremoux P, Le Gale`s C, Cartier I, Molinie´<br />
V, et al; French Society of Clinical Cytology Study Group. Cross sectional study of<br />
conventional cervical smear, monolayer cytology, and human papillomavirus DNA<br />
testing for cervical cancer screening. BMJ. 2003;326:733. [PMID: 12676841]<br />
124. Mayrand MH, Duarte-Franco E, Rodrigues I, Walter SD, Hanley J, Ferenczy<br />
A, et al; Canadian Cervical Cancer Screening Trial Study Group. Huma<br />
papillomavirus DNA versus Papanicolaou screening tests for cervical cancer. N<br />
Engl J Med. 2007;357:1579-88. [PMID: 17942871]<br />
125. Denton et al. The Sensitivity and Specificity of p16 INK4a Cytology vs HPV<br />
Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and<br />
LSIL Pap Cytology Results. American Journal of Clinical Pathology, 2010;134: 12-<br />
21<br />
126. Akpolat I, Smith DA, Ramzy I, Chirala M, Mody DR. The utility of p16INK4a<br />
and Ki-67 staining on cell blocks prepared from residual thin-layer cervicovaginal<br />
material. Cancer. 2004; 102: 142–149<br />
127. Bibbo M, Klump WJ, DeCecco J, Kovatich AJ. Procedure for<br />
immunocytochemical detection of P16INK4A antigen in thin-layer, liquid-based<br />
specimens. Acta Cytol. 2002; 46: 25–29. PubMed<br />
128. Bibbo M, DeCecco J, Kovatich AJ. P16INK4A as an adjunct test in liquidbased<br />
cytology. Anal Quant Cytol Histol. 2003; 25: 8–11. PubMed<br />
129. Guo M, Hu L, Baliga M, He Z, Hughson MD. The predictive value of<br />
p16(INK4a) and Hybrid Capture 2 human papillomavirus testing for high-grade<br />
cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2004; 122: 894–901. PubMed<br />
130. Murphy N, Ring M, Killalea AG, et al. p16INK4A as a marker for cervical<br />
dyskaryosis: CIN and cGIN in cervical biopsies and ThinPrep smears. J Clin<br />
Pathol. 2003; 56: 56–63<br />
131. Nieh S, Chen SF, Chu TY, Lai HC, Fu E. Expression of p16 INK4A in<br />
Papanicolaou smears containing atypical squamous cells of undetermined<br />
significance from the uterine cervix. Gynecol Oncol. 2003; 91: 201–208<br />
132. Nieh S, Chen SF, Chu TY, Lai HC, Fu E. Expression of p16INK4A in Pap<br />
smears containing atypical glandular cells from the uterine cervix. Acta<br />
Cytol. 2004; 48: 173–180<br />
133. Pientong C, Ekalaksananan T, Swadpanich U, et al. Immunocytochemical<br />
detection of p16INK4a protein in scraped cervical cells.Acta Cytol. 2003; 47: 616–<br />
623<br />
134. Sahebali S, Depuydt CE, Segers K, et al. P16INK4a as an adjunct marker in<br />
liquid-based cervical cytology. Int J Cancer. 2004; 108:871–876<br />
135. Saqi A, Pasha TL, McGrath CM, Yu GH, Zhang P, Gupta P. Overexpression<br />
of p16INK4A in liquid-based specimens (SurePath) as marker of cervical<br />
dysplasia and neoplasia. Diagn Cytopathol. 2002; 27: 365–370<br />
136. Yoshida T, Fukuda T, Sano T, Kanuma T, Owada N, Nakajima T. Usefulness<br />
of liquid-based cytology specimens for the immunocytochemical study of p16<br />
expression and human papillomavirus testing: a comparative study using<br />
simultaneously sampled histology materials. Cancer. 2004; 102: 100–108<br />
92
137. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, Fukuda T, Nakajima T. Expression status<br />
of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in<br />
cervical and genital lesions. Am J Pathol 1998;153:1741 – 8<br />
138. Klaes R, Benner A, Friedrich T, et al. p16INK4a immunohistochemistry<br />
improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial<br />
neoplasia. Am J Surg Pathol 2002;26:1389 – 99<br />
139. Agoff SN, Lin P, Morihara J, Mao C, Kiviat NB, Koutsky LA. p16(INK4a)<br />
expression correlates with degree of cervical neoplasia: a comparison with Ki-67<br />
expression and detection of high-risk HPV types. Mod Pathol 2003;16:665 – 73<br />
140. Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16INK4a as a marker<br />
of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a<br />
population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers<br />
Prev2004;13:1355 – 60<br />
141. Hu L, Guo M, He Z, Thornton J, McDaniel LS, Hughson MD. Human<br />
papillomavirus genotyping and p16INK4a expression in cervical intraepithelial<br />
neoplasia of adolescents. Mod Pathol 2005;18:267 – 73<br />
142. Benevolo M, Mottolese M, Marandino F, et al. Immunohistochemical<br />
expression of p16(INK4a) is predictive of HR-HPV infection in cervical low-grade<br />
lesions. Mod Pathol 2006;19:384 – 91<br />
143. Focchi GR, Silva ID, Nogueira-de-Souza NC, Dobo C, Oshima CT, Stavale<br />
JN. Immunohistochemical expression of p16(INK4A) in normal uterine cervix,<br />
nonneoplastic epithelial lesions, and low grade squamous intraepithelial lesions. J<br />
Low Genit Tract Dis 2007; 11:98 – 104<br />
144. Sahebali E., Ki-67 immunocytochemistry in liquid based cervical cytology:<br />
useful as an adjunctive tool? J Clin Pathol 2003;56:681-686<br />
145. Lilli, F.B.(2005). Determination of human papillomavirus (HPV) load and type<br />
in highgrade cervical lesions surgically resected from HIV-infected women during<br />
followup of HPV infection. Clin Infect Dis 40, 451-457<br />
146. Xi, L.F., Hughes, J.P., Castle, P.E., Edelstein, Z.R., Wang, C., Galloway,<br />
D.A., Koutsky, L.A., Kiviat ,N.B. & Schiffman, M. (2011). Viral load in the natural<br />
history of human papillomavirus type 16 infection: a nested case-control study. J<br />
Infect Dis 15;203(10): 1425-1433<br />
147. Denis, F., Hanz, S. & Alain, S.(2008). Clearance, persistence and recurrence<br />
of HPV infection. Gynecol Obstet Fertil 36: 430-440<br />
148. Zappacosta, R., Caraceni, D., Ciccocioppo, L., Ottaviantonio, M., Conti, F.,<br />
Andreozzi, S., Petrucci, F. & Rosini S. (2010). Is HPV-DNA testing a useful tool in<br />
predicting low grade squamous intraepithelial lesion outcome? A retrospective<br />
longitudinal study. Int J Immunopathol Pharmacol 23(1): 317-326<br />
149. Cuschieri et. al., Assessment of human papillomavirus mRNA detection over<br />
time in cervical specimens collected in liquid based cytology medium. 2005;124(1-<br />
2):211-215<br />
150. Powell et al. Recovery of human papillomavirus nucleic acids from liquidbased<br />
cytology media. 2006;137(1):58-62<br />
151. Cuschieri et. al., Human Papillomavirus mRNA and p16 Detection as<br />
Biomarkers for the Improved Diagnosis of Cervical Neoplasia. Cancer Epidemiol<br />
Biomarkers PrevOctober 2008 17; 2536<br />
152. Xiao W, Bian M, Ma L, Liu J, Chen Y, Yang B, Wu Q: Immunochemical<br />
analysis of human papillomavirus L1 capsid protein in liquidbased cytology<br />
samples from cervical lesions. Acta Cytol 2010; 54: 661–667<br />
153. Sarmadi S, Izadi-Mood N, Pourlashkari M, Yarandi F, Sanii S: HPV L1<br />
capsid protein expression in squamous intraepithelial lesions of cervix uteri and its<br />
relevance to disease outcome. Arch Gynecol Obstet 2011, E-pub ahead of print<br />
93
154. Yu L , Wang L , Zhong J, Chen S: Diagnostic value of p16INK4A, Ki-67,<br />
and human papillomavirus L1 capsid protein immunochemical staining on cell<br />
blocks from residual liquid-based gynecologic cytology specimens. Cancer<br />
Cytopathol 2010; 118: 47–55<br />
155. Sahebali S, Depuydt CE, Boulet GA, Arbyn M, Moeneclaey LM, Vereecken<br />
AJ, Van Marck EA, Bogers JJ: Immunocytochemistry in liquid-based cervical<br />
cytology: analysis of clinical use following a cross-sectional study. Int J Cancer<br />
2006; 118: 1254–1260<br />
156. Schmidt D, Bergeron C, Denton KJ, Ridder R: p16/Ki-67 dual-stain cytology<br />
in the triage of ASCUS and LSIL Papanicolaou cytology: results from the<br />
European Equivocal or Mildly Abnormal Papanicolaou Cytology Study. Cancer<br />
Cytopathol 2011; 119: 158–166<br />
157. Petry KU, Schmidt D, Scherbring S, Luyten A, Reinecke-Luthge A, Bergeron<br />
C, Kommoss F, Loning T, Ordi J, Regauer S, Ridder R: Triaging Pap cytology<br />
negative, HPV positive cervical cancer screening results with p16/Ki-67 Dualstained<br />
cytology. Gynecol Oncol 2011; 121: 505–509<br />
158. Dixon et al. Isolation of RNA from residual BD SurePath liquid-based<br />
cytology specimens and detection of HPV E6/E7mRNA using the PreTect HPV-<br />
Proofer assay. 2008;154(1-2):220-222<br />
159. Coquillard et al. Quantification of intracellular HPV E6/E7 mRNA expression<br />
increases the specificity and positive predictive value of cervical cancer screening<br />
compared to HPV DNA. 2011;120(1):89-93<br />
160. Molden, T., Nygard, J.F., Kraus, I., Karlsen, F., Nygard, M., Skare, G.B.,<br />
Skomedal, H., Thoresen, S.O. & Hagmar, B. (2005). Predicting CIN2+ when<br />
detecting HPV mRNA and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR: A<br />
2-year follow-up of women with ASCUS or LSIL Pap smear. Int J Cancer 10: 973-<br />
977<br />
161. Benevolo, M., Vocaturo, A., Caraceni, D., French, D., Rosini, S., Zappacosta,<br />
R., Terrenato, I., Ciccocioppo, L., Frega, A. & Giorgi Rossi, P. (2011) Sensitivity,<br />
Specificity, and Clinical Value of Human Papillomavirus (HPV) E6/E7 mRNA<br />
Assay as a Triage Test for Cervical Cytology and HPV DNA Test. J Clin Microbiol<br />
49(7): 2643-2650<br />
162. E. D. Rossi,M. Rafaeli, C.Minimo et al., “Immunohistochemicalevaluation of<br />
thyroid neoplasms in Thin-Layer smears from fine needle aspiration biopsies,”<br />
Cancer Cytopathology,vol. 105, no. 2, pp. 87–95, 2005<br />
163. M.-E. Nga, G. S. Lim, C. H. Son, and M. P. Kumarasinghe, “HBME-1 and<br />
CK19 are highly discriminatory in the cytological diagnosis of papillary thyroid<br />
carcinoma,” Diagnostic Cytopathology, vol. 36, no. 8, pp. 550–556, 2008<br />
164. D. El Demellawy, A. Nasr, and S. Alowami, “Application of CD56, P63 and<br />
CK19 immunohistochemistry in the diagnosis of papillary carcinoma of the<br />
thyroid,” Diagnostic Pathology, vol. 3, no. 1, article no. 5, 2008<br />
165. M. L. Prasad, N. S. Pellegata, Y. Huang, H. N. Nagaraja, A. De La Chapelle,<br />
and R. T. Kloos, “Galectin-3, fibronectin- 1, CITED-1, HBME1 and cytokeratin-19<br />
immunohistochemistry is useful for the differential diagnosis of thyroid tumors,”<br />
Modern Pathology, vol. 18, no. 1, pp. 48–57, 2005<br />
166. D. El Demellawy, A. L. Nasr, S. Babay, and S. Alowami, “Diagnostic utility of<br />
CD56 immunohistochemistry in papillary carcinoma of the thyroid,” Pathology<br />
Research and Practice, vol. 205, no. 5, pp. 303–309, 2009<br />
167. A. Naito, H. Iwase, T. Kuzushima, T. Nakamura, and S. Kobayashi, “Clinical<br />
significance of E-cadherin expression in thyroid neoplasms,” Journal of Surgical<br />
Oncology, vol. 76, no. 3, pp. 176–180, 2001<br />
94
168. L. S. Freudenberg, S. Sheu, R. G¨orges et al., “Prognostic value of c-erbB-2<br />
expression in papillary thyroid carcinoma,” NuklearMedizin, vol. 44, no. 5, pp.<br />
179–180, 2005<br />
169. C. Zafon,G.Obiols, J. Castellv´ı, S. Ramon Y Cajal, J. A. Baena, and J.<br />
Mesa, “Expression of p21cip1, p27kip1, and p16 INk4a cyclin-dependent kinase<br />
inhibitors in papillary thyroid carcinoma: correlation with clinicopathological<br />
factors,” Endocrine Pathology, vol. 19, no. 3, pp. 184–189, 2008<br />
170. A. N. Haberal, S. Toru, O. O¨ zen, Z. Arat, and B. Bilezikc¸i, “Diagnostic<br />
pitfalls in the evaluation of fine needle aspiration cytology of the thyroid:<br />
correlation with histopathology in 260 cases,” Cytopathology, vol. 20, no. 2, pp.<br />
103–108, 2009<br />
171. L. Griffith, C. G. Chiu, A.M. Gown, S. J. M. Jones, and S. M. Wiseman,<br />
“Biomarker panel diagnosis of thyroid cancer: a critical review,” Expert Review of<br />
Anticancer Therapy, vol. 8, no. 9, pp. 1399–1413, 2008<br />
172. Pazaitou-Panayiotou Κ. et al. The Immunocytochemistry Is a Valuable Tool<br />
in the Diagnosis of Papillary Thyroid Cancer in FNA’s Using Liquid-Based<br />
Cytology. [Διαδίκτυο]: Journal of Oncology Volume 2010 (2010), Article<br />
ID 963926, 5 pages<br />
doi:10.1155/2010/963926. http://www.hindawi.com/journals/jo/2010/963926/<br />
173. J. Y. Kim, H. Cho, B. D. Rhee, and H.-Y. Kim, “Expression of CD44 and<br />
cyclin D1 in fine needle aspiration cytology of papillary thyroid carcinoma,” Acta<br />
Cytologica, vol. 46, no. 4, pp. 679–683, 2002<br />
174. M. R. Nasr, S. Mukhopadhyay, S. Zhang, and A.-L. A. Katzenstein,<br />
“Immunohistochemical markers in diagnosis of papillary thyroid carcinoma: utility<br />
of HBME1 combined with CK19 immunostaining,” Modern Pathology, vol. 19, no.<br />
12, pp. 1631–1637, 2006<br />
175. D. L. Segev, D. P. Clark, M. A. Zeiger, and C. Umbricht, “Beyond the<br />
suspicious thyroid fine needle aspirate: a review,” Acta Cytologica, vol. 47, no. 5,<br />
pp. 709–722, 2003<br />
176. A. Bartolazzi, F. Orlandi, E. Saggiorato et al., “Galectin-3-expression analysis<br />
in the surgical selection of follicular thyroid nodules with indeterminate fine-needle<br />
aspiration cytology: a prospective multicentre study,” The Lancet Oncology, vol. 9,<br />
no. 6, pp. 543–549, 2008<br />
177. L. J. Mills, D. N. Poller, and C. Yiangou, “Galectin-3 is not useful in thyroid<br />
FNA,” Cytopathology, vol. 16, no. 3, pp. 132– 138, 2005<br />
178. K. T. Mai, R. Bokhary, H. M. Yazdi, J. Thomas, and A. S. Commons,<br />
“Reduced HBME-1 immunoreactivity of papillary thyroid carcinoma and papillary<br />
thyroid carcinoma-related neoplastic lesions with H¨urthle cell and/or apocrine-like<br />
changes,” Histopathology, vol. 40, no. 2, pp. 133–142, 2002<br />
179. A. Mitselou, E. Ioachim, D. Peschos et al., “E-cadherin adhesion molecule<br />
and syndecan-1 expression in various thyroid pathologies,” Experimental<br />
Oncology, vol. 29, no. 1, pp. 54–60, 2007<br />
180. Husain A Saleh et al., Differential expression of galectin-3, CK19, HBME1,<br />
and Ret oncoprotein in the diagnosis of thyroid neoplasms by fine needle<br />
aspiration biopsy. CytoJournal 2009, 6:18<br />
181. Grogan R.H. et al., The Evolution of Biomarkers in Thyroid Cancer—From<br />
Mass Screening to a Personalized Biosignature. Cancers 2010; 2: 885-912<br />
182. D. K. Das and P. N. Sharma, “Diagnosis of papillary thyroid carcinoma in fine<br />
needle aspiration smears: factors that affect decision making,” Acta Cytologica,<br />
vol. 53, no. 5, pp. 497–506, 2009<br />
183. Βαλερή Ρ. M., «Εξελίξεις στην κυτταρολογική διάγνωση του καρκίνου του<br />
μαστού», 9o Πανελλήνιο συνέδριο Κλινικής Κυτταρολογίας, Αθήνα, 2011<br />
95
184. Gruver AM, Peerwani Z, Tubbs RR. Out of the darkness and into the light:<br />
bright field in situ hybridisation for delineation of ERBB2 (HER2) status in breast<br />
carcinoma. J Clin Pathol. 2010;63(3):210–219<br />
185. Nitta H, Hauss-Wegrzyniak B, Lehrkamp M, et al. Development of automated<br />
brightfield double in situ hybridization (BDISH) application for HER2 gene and<br />
chromosome 17 centromere (CEN 17) for breast carcinomas and an assay<br />
performance comparison to manual dual color HER2 fluorescence in situ<br />
hybridization (FISH). Diagn Pathol. 2008;3:41<br />
186. Pedersen et al., he Correlation Between Dual-color Chromogenic In Situ<br />
Hybridization and Fluorescence In Situ Hybridization in Assessing HER2 Gene<br />
Amplification in Breast Cancer. Diagnostic Molecular Pathology. 2009;18(2):96-<br />
102<br />
187. Vocaturo et al., Chromogenic In Situ Hybridization to Detect HER-2/neu<br />
Gene Amplification in Histological and ThinPrepR-Processed Breast Cancer Fine-<br />
Needle Aspirates: A Sensitive and Practical Method in the Trastuzumab Era. The<br />
Oncologist 2006;11:878–886<br />
188. Tisserand, et al., ThinPrep_-Processed Fine-Needle Samples of Breast Are<br />
Effective Material for RNA- and DNA-Based Molecular Diagnosis. Cancer (Cancer<br />
Cytopathol) 2003;99:223–32<br />
189. Moss S.M. et al., Evaluation of HPV/LBC Cervical Screening Pilot Studies.<br />
2006<br />
http://ia201120.eu.archive.org/ea/20060731065549/http://www.cancerscreening.n<br />
hs.uk/cervical/evaluation-hpv-2006feb.pdf<br />
190. Whitlock EP. Et al., Liquid-Based Cytology and Human Papillomavirus<br />
Testing to Screen for Cervical Cancer: A Systematic Review for the U.S.<br />
Preventive Services Task Force. Ann Intern Med. 2011;155:687-697<br />
191. Kim J, Wright TC, Goldie SJ. Cost-effectiveness of alternative triage<br />
strategies for atypical squamous cells of undetermined significance. JAMA.<br />
2002;287:2382–90<br />
192. Goldie et al., Cost-Effectiveness of Human Papillomavirus DNA Testing for<br />
Cervical Cancer Screening in Women Aged 30 Years or More. Obstet Gynecol<br />
2004;103:619 –31<br />
193. Goldie et al., Cost-Effectiveness of Human Papillomavirus DNA Testing for<br />
Cervical Cancer Screening in Women Aged 30 Years or More. Obstet Gynecol<br />
2004;103:619 –31<br />
194. Cuzick J, Pasieni P, Davies, P, Adams J, Normand C, Frater A, et al. A<br />
systematic review of the role of human papillomavirus testing within a cervical<br />
screening programme. Health Technol Assess 1999;3:14<br />
195. Hutchinson ML, Berger BM, Farber FL. Clinical and cost implications of new<br />
technologies for cervical cancer screening: the impact of test sensitivity. Am J<br />
Manage Care 2000;6:766–80<br />
196. Mandelblatt JS, Lawrence WF, Womack SM, Jacobson D, Yi B, Hwang YT,<br />
et al. Benefits and costs of using HPV testing to screen for cervical cancer. JAMA<br />
2002;287:2372–81<br />
197. Myers E, McCrory D, Nanda K, Matchar D. Mathematical model for the<br />
natural history of human papillomavirus infection and cervical carcinogenesis. Am<br />
J Epidemiol 2000;151:1158 –71<br />
96
Change language