ÎικÏοβιακή Î£Ï Î½Î´Ï Î±ÏÏική ÎιοÏÏνθεÏη: ΣÏεδιαÏμÏÏ Î½ÎÏν ...
ÎικÏοβιακή Î£Ï Î½Î´Ï Î±ÏÏική ÎιοÏÏνθεÏη: ΣÏεδιαÏμÏÏ Î½ÎÏν ...
ÎικÏοβιακή Î£Ï Î½Î´Ï Î±ÏÏική ÎιοÏÏνθεÏη: ΣÏεδιαÏμÏÏ Î½ÎÏν ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Μικροβιακή Συνδυαστική Βιοσύνθεση:<br />
Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων<br />
Αλέξανδρος Σίσκος<br />
Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας,<br />
Τμήμα Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας<br />
alesiskos@bio.uth.gr<br />
Μεταπτυχιακό δίπλωμα ειδίκευσης: “Μικροβιακή Βιοτεχνολογία”<br />
Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ<br />
20 Ιανουαρίου 2010
• Μικροβιακή Συνδυαστική Βιοσύνθεση:<br />
Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων<br />
Polyketide drug design with combinatorial biosynthesis/<br />
bioengineering<br />
• Σχεδιασμός νέων φαρμάκων και βιοενεργών ουσιών με τη βοήθεια<br />
γονιδιακών αλλαγών<br />
• Μικροοργανισμοί ως κυτταρικά εργοστάσια μακρομορίων<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 2
ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ<br />
•Μεγάλη ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών με<br />
εξαιρετικά μεγάλη ποικιλία στις δομές. Παράγονται από<br />
μύκητες, βακτήρια, φυτά, θαλάσσιους οργανισμούς.<br />
•Ο παραδοσιακός ορισμός τους θεωρεί ότι παράγονται<br />
από τη συμπύκνωση (πολυμερισμό, συνένωση)<br />
μονάδων οξικού κατά τρόπο ‘κεφαλή-ουρά’. (Λιπαρά<br />
οξέα, τερπένια)<br />
•Ενώσεις εξαιρετικά μεγάλης βιολογικής σημασίας και<br />
χρήσεων (αντιβιοτικά, αντικαρκινικά)<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 3
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
Tartolon B<br />
ΜΑΚΡΟΛΙΔΙΑ (macrolides)<br />
Na<br />
B<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
Me<br />
HO<br />
Me<br />
Me<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
Me<br />
O<br />
Me<br />
O<br />
Me<br />
Me<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
Me O<br />
O<br />
OMe<br />
Me<br />
erythromycin A<br />
αντιβιοτικό<br />
Me<br />
OH<br />
NMe 2<br />
OCH 3<br />
O<br />
OCH 3<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
soraphen A<br />
αντιμυκητιακό<br />
OCH 3<br />
OH<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 4
ΠΟΛΥΕΘΕΡΕΣ ΚΑΙ ΠΟΛΥΕΝΙΑ<br />
OMe<br />
HO<br />
O<br />
HO<br />
MeO<br />
O<br />
H<br />
O<br />
H<br />
O<br />
O<br />
H<br />
O<br />
H<br />
MeO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
HO 2 C<br />
Monensin A<br />
αντιβιοτικό<br />
OH<br />
N<br />
O<br />
O MeO<br />
OH H<br />
O<br />
rapamycin<br />
ανοσοκαταστολέας<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 5
ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ<br />
MeO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
Me<br />
OH OH O<br />
rubrofusarin<br />
OMe<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
MeO<br />
O<br />
O<br />
Aflatoxin B1<br />
καρκινογόνος μυκητοξίνη<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH NH 2<br />
daunomycin<br />
αντικαρκινικό<br />
CO 2 H<br />
OH<br />
6-methylsalicylic acid<br />
αρωματικό αντιβιοτικό<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 6
ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ<br />
• Κοινό χαρακτηριστικό όλων των πολυκετιδίων είναι ο<br />
τρόπος με τον οποίο κατά τη διάρκεια της<br />
βιοσύνθεσής τους σχηματίζονται νέοι δεσμοί C-C:<br />
αποκαρβοξυλιοτική συνένωση μαλονικού και ενός<br />
άκυλο θειοεστέρα με αποτέλεσμα την παραγωγή<br />
ενός β-κετο-θειοεστέρα.<br />
• Ο βιοσυνθετικός μηχανισμός προσομοιάζει εξαιρετικά<br />
με τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων και μάλιστα η<br />
βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων μπορεί να θεωρηθεί<br />
απλά σαν μια ειδική περίπτωση βιοσύνθεσης<br />
πολυκετιδίων.<br />
• Πως τόσο διαφορετικά δομικές ενώσεις προέρχονται από την<br />
ίδια βιοσυνθετική οδό (pathway)?????<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 7
H 3 C<br />
(5)<br />
O<br />
SCoA<br />
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ<br />
acetyl-CoA<br />
carboxylase CO 2<br />
O<br />
O<br />
SACP<br />
OH<br />
O<br />
SACP<br />
O<br />
SCoA<br />
OH<br />
O<br />
malonyl-SCoA<br />
ACP<br />
CoASH<br />
O<br />
SACP<br />
OH<br />
O<br />
malonyl-SACP<br />
O<br />
SACP<br />
O<br />
fatty acid<br />
malonyl-SCoA<br />
SACP<br />
O<br />
SACP<br />
CO 2<br />
HSCoA<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
SACP<br />
SACP<br />
SACP<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 8
ΠΡΟΤΕΙΝΗ ΦΟΡΕΑΣ ΑΚΥΛΙΟΥ<br />
(acyl carrier protein ACP)<br />
SH<br />
N<br />
H<br />
O<br />
N<br />
H<br />
O<br />
O<br />
O-<br />
P O<br />
O<br />
NH<br />
O<br />
4'-phosphopantetheine moiety<br />
peptide chain<br />
Ο ‘βραχίονας’ φωσφοπαντοθενικού της ACP<br />
(θειοεστέρας) πηγαινοφέρνει τα υποστρώματα<br />
μεταξύ των ενζυμικών ενεργοτήτων
R<br />
O<br />
O<br />
AT<br />
KS<br />
ACP<br />
KR<br />
DH<br />
ER<br />
O<br />
R<br />
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΩΝ<br />
SCoA<br />
CO 2<br />
O<br />
SCoA<br />
AT<br />
acyl transferase<br />
keto synthase<br />
acyl carrier protein<br />
keto reductase<br />
dehydratase<br />
enoyl reductase<br />
Ομάδα εκκίνησης<br />
(starter unit)<br />
R<br />
S<br />
KS<br />
O<br />
R<br />
O<br />
S<br />
*<br />
ACP<br />
Ομάδα επέκτασης<br />
(extender unit)<br />
O<br />
O<br />
CO 2<br />
SH<br />
KS<br />
R<br />
R<br />
S<br />
ACP<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R *<br />
*<br />
R<br />
R *<br />
O<br />
O<br />
S<br />
S<br />
S<br />
ACP<br />
ER<br />
ACP<br />
DH<br />
ACP<br />
Σχηματισμός δεσμού C-C στη βιοσύνθεση πολυκετιδίων προς παραγωγή δι-, τρι-, πολυκετιδίων<br />
*<br />
KR<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O
ΔΟΜΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΠΟΛΥΚEΤΙΔΙΩΝ<br />
(σύγκριση με FA)<br />
• Οφείλεται στην επιλογή της ομάδας εκκίνησης (οξικό,<br />
προπιονικό, βουτυρικό, φαινολικό)<br />
• Στην ικανότητα ενσωμάτωσης όχι μόνο ομάδων οξικού, αλλά και<br />
ομάδων προπιονικού (C 3 ) και βουτιρικού (C 4 ) και στον αριθμό<br />
αυτών των ομάδων<br />
• Στο διαφορετικό βαθμό αναγωγής της κέτο ομάδας του β-κετοθειοέστερα<br />
• Συνεπώς προκύπτουν μέχρι και δυο οπτικώς ενεργά κέντρα για<br />
κάθε βιοσυνθετικό κύκλο<br />
• Διαφορετικές αντιδράσεις κυκλοποίησης<br />
• ‘Μέτα πολυκετιδικές’ τροποποίησεις όπως οξειδώσεις,<br />
αναγωγές, μεθυλιώσεις, ακυλιώσεις, γλυκοσυλιώσεις<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 11
ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΩΝ<br />
O<br />
Πλήρης αναγωγή<br />
SEnz<br />
fatty acids<br />
pathway A<br />
R<br />
O<br />
SEnz<br />
+ n<br />
R<br />
O<br />
SEnz<br />
CO 2 H<br />
pathway B<br />
OH OH O O<br />
SEnz<br />
pathway C<br />
complex polyketides<br />
type I<br />
O O O O O O<br />
Καμία αναγωγή<br />
SEnz<br />
aromatic polyketides<br />
type II<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 12
ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ<br />
(Polyketide synthases PKS)<br />
•Οι διαφορές στις δομές των πολυκετιδίων προκύπτουν<br />
από διαφορές στην ενζυμική αρχιτεκτονική, οργάνωση<br />
και λειτουργία.<br />
•Υπάρχουν δυο ακραίες μορφές ενζυμικής οργάνωσης<br />
(όπως και στα FA).<br />
•PKS τύπος I<br />
•PKS τύπος II<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 13
ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ<br />
(Polyketide synthases PKS)<br />
• TYPE I (modular) PKS: πολύπλοκα ενζυμικά συστήματα. Κάθε<br />
αντίδραση της βιοσύνθεσης πραγματοποιείται από μια ξεχωριστή<br />
ενζυμική δραστικότητα (περιοχή-domain) και ηοποία<br />
χρησιμοποιείται κατά κανόνα μια και μόνο φορά. Οι περιοχές<br />
(domain) υπεύθυνες για μια δομική μονάδα ακυλίου είναι<br />
οργανωμένες σε στοιχεία δραστικοτήτων (module) και τα οποία<br />
είναι οργανωμένα σε μια η περισσότερες πολυδραστικές πρωτεΐνες<br />
(πολύ μεγάλου μεγέθους).<br />
• Παράγουν πολύπλοκα μη-αρωματικά πολυκετίδια όπως τα<br />
μακρολίδια, οι πολυεθέρες, τα πολυένια. Απαντώνται συνήθως σε<br />
βακτήρια και θαλάσσιους οργανισμούς. Διαφορετικός βαθμός<br />
αναγωγής σε κάθε βιοσυνθετικό κύκλο. Χρήση προπιονικού,<br />
βουτυρικού.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 14
ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ ΤΗΣ<br />
ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ TYPE I (modular) PKS<br />
eryAI<br />
eryAII<br />
eryAIII<br />
gene level<br />
3 πλαίσια αναγνωσης<br />
load<br />
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3<br />
module 2<br />
module 4<br />
module 6<br />
module 1<br />
module 3<br />
module 5<br />
end<br />
protein level<br />
ER<br />
DH KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
6-Deoxyerythronolide B<br />
Γονιδιακό συγκρότημα ερυθρομυκίνης Α στο Saccharopolyspora erythraea. Η θειοεστεράση<br />
(thiosterare TE) κυκλοποίει (λακτόνη) και απελευθερώνει το πολυκετίδιο από το ένζυμο.
ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ<br />
(Polyketide synthases PKS)<br />
• TYPE II (aromatic) PKS: πιο πρωτόγονη συλλογή ξεχωριστών<br />
ενζύμων. Κάθε ενζυμική δραστικότητα αποτελεί και μια<br />
ξεχωριστή πρωτεΐνη.<br />
• Κάθε μια από τις ενζυμικές αυτές δραστικότητες μπορεί να<br />
χρησιμοποιείται επαναληπτικά σε κάθε βιοσυνθετικό κύκλο (όπως<br />
και οι βακτηριακές FAS).<br />
• Απουσία αναγωγικών δραστικοτήτων (ΣΕ ΠΛΗΡΗ ΑΝΤΙΘΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ<br />
FAS) και συνεπώς τρεις και μόνο ενζυμικές δραστικότητες-πρωτείνες<br />
μπορούν να αποτελούν την ελάχιστη PKS.<br />
• Απαντώνται σε μύκητες και φυτά.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 16
TYPE II (aromatic) PKS:<br />
ARO<br />
Βιοσύνθεση της Doxorubicin από βακτηριακή<br />
τύπου ΙΙ PKS<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 17
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΩΝ<br />
R<br />
O<br />
O<br />
AT<br />
KS<br />
ACP<br />
KR<br />
DH<br />
ER<br />
O<br />
R<br />
SCoA<br />
CO 2<br />
O<br />
SCoA<br />
AT<br />
acyl transferase<br />
keto synthase<br />
acyl carrier protein<br />
keto reductase<br />
dehydratase<br />
enoyl reductase<br />
O<br />
R<br />
O<br />
O<br />
R<br />
R *<br />
R *<br />
O<br />
O<br />
O<br />
S<br />
S CO 2 SH S<br />
KS ACP<br />
KS ACP<br />
type II PKS<br />
FAS type I<br />
KR<br />
R<br />
R<br />
R<br />
R *<br />
* OH<br />
R<br />
R *<br />
O<br />
O<br />
O<br />
S<br />
S<br />
S<br />
ACP<br />
ER<br />
ACP<br />
DH<br />
ACP<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 18
• Η εμφάνιση PKS τύπου Ι ή ΙΙ έχει σχέση με τη δομή του<br />
πολυκετιδίου και όχι τον οργανισμό προέλευσης (σε αντίθεση με<br />
τα FA).<br />
• Η δομική οργάνωση των FAS εξαρτάται από τον οργανισμό που<br />
απαντώνται<br />
– FAS I: Θηλαστικών. Όλες οι ενζυμικές δραστικότητες είναι<br />
συνδεδεμένες (ομοιοπολικά) μεταξύ για να σχηματίσουν μια μεγάλη<br />
πολυδραστική πρωτείνη (συνήθως επτά ενζυμικές δραστικότητες).<br />
– FASII: Βακτηριακή. Αποτελείται από σετ διακριτών πρωτεϊνών οι<br />
οποίες μπορούν να απομονωθούν η κάθε μια ξεχωριστά.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 19
ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ<br />
ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗΣ<br />
• Τα μοντέλα των PKS τύπου Ι και ΙΙ δεν είναι<br />
οι μοναδικές περιπτώσεις που απαντώνται<br />
στη φύση. Ποικιλία παραδειγμάτων όπου η<br />
ενζυμική οργάνωση είναι ενδιάμεση των<br />
ακραίων δομών τύπου I και II.<br />
– Επαναληπτικά PKS Ι (iteratively)<br />
– Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases<br />
CHS). PKS τύπος ΙΙΙ (φυτά)<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 20
Επαναληπτικά (iterative) PKS Ι<br />
• Επαναληπτικά PKS Ι: Ενζυμική αρχιτεκτονική τύπου<br />
Ι, αλλά μερικές ενζυμικές δραστικότητες<br />
χρησιμοποιούνται επαναληπτικά (iteratively). Δηλαδή<br />
οι ενζυμικές δραστικότητες είναι οργανωμένες σε<br />
μεγάλες πολυδραστικές πρωτείνες, αλλά σε αντίθεση<br />
με τις κλασικού τύπου Ι, μερικές από τις<br />
δραστικότητες χρησιμοποιούνται επαναληπτικά.<br />
• Παραδείγματα η βιοσύνθεση από μύκητες των 6-<br />
MSA και lovastatin.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 21
Βιοσύνθεση Lovastatin από επαναληπτική<br />
μυκητιακή PKS τύπου Ι<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 22
Συνθάσες της χαλκόνης<br />
(chalcone synthases CHS)<br />
• Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases CHS): Ενζυμική<br />
αρχιτεκτονική τύπου ΙΙ (ξεχωριστά ένζυμα). Όμως τα ένζυμα<br />
αυτά μπορούν να χρησιμοποιήσουν τις ομάδες ακυλίου με τη<br />
μορφή του συνενζύμου Α (CoA), χωρίς να μεταφερθούν στην<br />
ACP. Επίσης πολλές ενζυμικές αντιδράσεις (αποκαρβοξυλίωση,<br />
κυκλοποίηση, δημιουργία δεσμού C-C, αρωματοποίηση)<br />
• Πολυκετίδια φυτών, φαινυλοπροπανοείδη (χρωστικές, αντι-UV,<br />
χημειοπροστατευτικές κλπ.).<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 23
Naringenin (ναρινγκίνη). Συνθάση της χαλκόνη<br />
(chalcone synthase). Φυτά τυπος ΙΙΙ PKS<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 24
ΜΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ<br />
(non ribosomal peptide synthases NRPS)<br />
• Τα μη ριβοσωμικά πεπτίδια είναι γραμμικά, κυκλικά ή<br />
διακλαδιζώμενα πεπτίδια με συνήθως λιγότερο από 20 μονάδες<br />
• Πολλά μη ριβοσωμικά πεπτίδια είναι πολύ σημαντικά φάρμακα<br />
όπως η κυκλοσπορίνη Α, πενικιλίνη, βανκομυσίνη<br />
• Παράγονται από τις μη ριβοσωμικές πεπτιδικές συνθάσες οι<br />
οποίες εκτός από τα πρωτεϊνογενή αμινοξέα (20) μπορούν και<br />
χρησιμοποίουν γύρω στα 300 !!!! άλλα αμινοξέα<br />
• Οι NRPS έχουν δομή και ενζυμική αρχιτεκτονική παρόμοια με<br />
τον τυπο Ι PKS (modular)<br />
• Για κάθε δομική μονάδα-αμινοξύ, υπάρχει ένα διαφορετικό<br />
στοιχείο ενζυμικών δραστικοτήτων (module) και όλες μαζί είναι<br />
οργανωμένες σε μια η περισσότερες πολυδραστικές πρωτεΐνες<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 25
ΜΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ<br />
(non ribosomal peptide synthases NRPS)<br />
module'<br />
module''<br />
module'<br />
module''<br />
C A PCP<br />
C A PCP<br />
C A PCP C A PCP<br />
R '<br />
S<br />
O<br />
NHR<br />
R''<br />
S<br />
NH 2<br />
O<br />
A: adenylation<br />
PCP: peptyl carrier protein<br />
γνωστό και ως T: thiolation<br />
C: condenastion<br />
πεπτιδικός<br />
δεσμός<br />
SH<br />
E: epimerasation<br />
MT: methylation<br />
Cy: cyclisation<br />
R: reduction<br />
Ox: oxidation<br />
R''<br />
O<br />
RHN<br />
S<br />
O<br />
NH<br />
R '<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 26
• Πολλά παραδείγματα συστημάτων που<br />
είναι μίγματα δυο από των παραπάνω<br />
για παράδειγμα<br />
– εναλλαγή PKS τύπου Ι και ΙΙ,<br />
– μεικτά PKS/NRPS (epothiolone,<br />
myxothiazol, rapamycin)<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 27
MEIKTA PKS/NRPS<br />
(ή μήπωςφυσικήβιοσυνθετικήμηχανική)<br />
O<br />
S<br />
N<br />
O<br />
OH<br />
HS<br />
H 2 N<br />
O<br />
OH<br />
PKS/NRPS systems<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
Epothilone<br />
cysteine<br />
S<br />
N<br />
S<br />
N<br />
OMe<br />
MeO<br />
CONH 2<br />
Myxothiazol<br />
Χρησιμοποίηση αμινοξέων σαν δομικές μονάδες σε φυσικά συστήματα PKS/NRPS.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 28
Βιοσύνθεση ραπαμυκίνης<br />
OMe<br />
HO<br />
O<br />
MeO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
N<br />
O<br />
MeO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
H<br />
rapamycin<br />
ανοσοκαταστολέας<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 29
Ταξινόμηση διαφόρων PKS σε σχέση με<br />
τους οργανισμούς<br />
Τύπος PKS<br />
Οργανισμοί<br />
Modular PKS τύπος Ι<br />
Βακτήρια (πρώτιστα)<br />
Επαναληπτική PKS τύπος Ι<br />
Μύκητες (μερικά βακτήρια)<br />
Επαναληπτική PKS τύπος ΙΙ<br />
Μόνο βακτήρια<br />
Επαναληπτική PKS τύπος ΙΙΙ<br />
PKS/NRPS υβριδικά<br />
Κυρίως φυτά, (μερικά<br />
βακτήρια και μύκητες)<br />
Βακτήρια - μύκητες<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 30
ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ<br />
(combinatorial biosynthesis)<br />
•Το μοντέλο ενζυμικής αρχιτεκτονικής PKS τύπου Ι προβλέπει ότι<br />
κάθε ενζυμική περιοχή (domain) είναι υπεύθυνη για μια και μόνο<br />
αντίδραση της βιοσύνθεσης και κάθε στοιχείο δραστικοτήτων για<br />
κάθε δομική μονάδα.<br />
•Υπόθεση: Πιθανές αλλαγές στο γονίδιο θα πρέπει να<br />
προκαλέσουν τις αντίστοιχες αλλαγές στη δομή του μορίου.<br />
•Αξιοποίηση της τεράστιας βιοσυνθετικής ποικιλίας (δομικές<br />
μονάδες, στερεοχημεία, οξειδωτική κατάσταση) των πολυκετιδίων<br />
για την επίτευξη των τεραστίου εύρους δομικών αλλαγών.<br />
•Παραγωγή υβριδικών αντιβιοτικών ή μη-φυσικών φυσικών<br />
προϊόντων με τη χρήση της λεγόμενης βιοσυνθετικής μηχανικής.<br />
•Mutasynthesis: Η παραγωγή αναλόγων φαρμακευτικών<br />
προϊόντων, όχι με χημική σύνθεση, αλλά με τη χρήση της μοριακής<br />
βιολογίας (σχεδιασμένες αλλαγές στο επίπεδο των γονιδίων)
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 32
ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ<br />
(combinatorial biosynthesis)<br />
• Η συνδυαστική βιοσύνθεση κατέστη δυνατή με τη κατανόηση<br />
της βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων και ανάπτυξη της γενετικής,<br />
κλωνοποίησης, μικροβιολογίας, ετερόλογης έκφρασης<br />
πρωτεϊνών.<br />
• Επίσης η αλληλουχία πολλών βιοσυνθετικών γονιδιωμάτων έχει<br />
αποσαφηνισθεί, προσφέροντας τη δυνατότητα αναγνώρισης<br />
των αλληλουχίας υπεύθυνων για συγκεκριμένες αντιδράσεις.<br />
• Εφαρμογή σε Βακτήρια. Actinomycetes (βακτήρια εδάφους) και<br />
ειδικά στα Streptomyces.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 33
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ<br />
eryAI<br />
eryAII<br />
eryAIII<br />
load<br />
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3<br />
module 2<br />
module 4<br />
module 6<br />
module 1<br />
module 3<br />
module 5<br />
end<br />
ER<br />
DH KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
6-Deoxyerythronolide B
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
NMe 2<br />
O<br />
Me<br />
OH<br />
OMe<br />
erythromycin A<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
6-Deoxyerythronolide<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
Me<br />
OH<br />
OH<br />
hydroxylase<br />
glycosyltransferase<br />
glycosyltransferase<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
NMe 2<br />
O<br />
Me<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
NMe 2<br />
O<br />
Me<br />
OH<br />
OH<br />
hydroxylase<br />
(O)-methyltransferase
ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΟΙ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ - ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ<br />
HO<br />
O<br />
MeO<br />
MeO<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
O<br />
Rapamycin<br />
OMe<br />
HO<br />
O<br />
OMe<br />
O<br />
O<br />
O<br />
N<br />
O<br />
O MeO<br />
OH H<br />
O<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
NMe<br />
HO<br />
2<br />
HO<br />
O<br />
O O<br />
+ O<br />
O<br />
O<br />
H<br />
O<br />
OH<br />
O OMe<br />
O<br />
OH<br />
Erythromycin A<br />
HO<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OMe<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
H<br />
“Erymectamycin”<br />
Avermectin B1b<br />
O<br />
H<br />
OH<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 36
ΔΙΑΓΡΑΦΗ ΤΗΣ KR ΣΤΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ 5 ΤΗΣ<br />
ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ<br />
KS<br />
module 5<br />
KR<br />
AT ACP<br />
DEBS 3<br />
module 6<br />
KR<br />
KS AT ACP<br />
S<br />
O<br />
S<br />
5 O<br />
end<br />
TE<br />
O<br />
OH<br />
κυκλοποίηση<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
5 O<br />
OH<br />
O<br />
μετα PKS<br />
γλυκοσυλίωση<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
5 O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
5<br />
O<br />
O<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
NMe 2<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OMe<br />
Me<br />
OH<br />
erythromycin A<br />
Donadio et al. 1991: Το πρωτοποριακό πείραμα που αποκάλυψε την ενζυμική<br />
αρχιτεκτονική των PKS τύπου Ι και άνοιξε το δρόμο της συνδυαστικής βιοσύνθεσης. Η<br />
διαγραφή της KR προκαλεί την ακριβώς προβλεπόμενη δομική αλλαγή.
ΔΙΑΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ER ΣΤΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ 4 ΤΗΣ<br />
ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ<br />
DEBS 2 DEBS 3<br />
module 4<br />
module 6<br />
module 3<br />
module 5<br />
end<br />
O<br />
DH<br />
ER<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
OH<br />
KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE<br />
O<br />
OH<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
NMe 2<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
Donadio et al. 1993<br />
Me<br />
O<br />
OH<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 38<br />
OH
ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ<br />
Biosynthetic engineering<br />
• Τα παραπάνω πειράματα διαγραφής μίας ενζυμικής περιοχής σκοπό<br />
είχαν την μελέτη των ενζύμων PKS τύπου Ι, αλλά αποκάλυψαν τις<br />
τεράστιες δυνατότητες τις οποίες έχει οι γενετική μηχανική τέτοιων<br />
συστημάτων.<br />
• Από τότε η έρευνα της γενετικής τροποποίησης των PKS έχει<br />
προσελκύσει τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον.<br />
• Μεθοδολογίες που έχουν χρησιμοποιηθεί περιλαμβάνουν τη διαγραφή<br />
περιοχών, μεταφορά περιοχών ή στοιχείων, ανάμειξη περιοχών ή<br />
στοιχείων δυο διαφορετικών PKS γονιδιακών συστημάτων, εμφύτευση<br />
νέων στοιχείων δραστικοτήτων, αλλαγή ενζυμικής εκλεκτικότητας ή<br />
ειδικότητας. Παράγωγή πληθώρα αναλόγων πολυκετιδίων.<br />
• Απομώνωση των αντιστοίχων πρωτείνων DEBS1, 2 και 3 και in vitro<br />
μελέτη.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 39
ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΘΕΙΟΕΣΤΕΡΑΣΗΣ<br />
DEBS-1-TE<br />
AT<br />
ACP<br />
KS<br />
AT<br />
KR<br />
ACP<br />
KS<br />
AT<br />
KR<br />
ACP<br />
TE<br />
OH<br />
S<br />
O<br />
S<br />
O<br />
S<br />
OH<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
cyclise<br />
O<br />
triketide<br />
lactone<br />
O<br />
Cortes et al., 1995: Μεταφορά της θειοεστεράσης στο τέλος της DEBS1 και παραγωγή<br />
του τρικετιδίου αντί του επτακετιδίου. Εξαιρετικό μοντέλο μελέτης των PKS (δουλεύει<br />
και in vitro), παραγωγή αναλόγων στατίτης κτλ. Από τότε η ΤΕ έχουν επιτυχώς<br />
τοποθετηθεί στο τέλος του στοιχείου 3 και 5 δινοντας τα αντίστοιχα τετρα-, εξα-κετίδια<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 40
ΥΒΡΙΔΙΚΗ PKS-ΑΛΛΑΓΗ ΔΟΜΙΚΗΣ ΜΟΝΑΔΑΣ<br />
Hybrid PKS<br />
απουσία μεθυλίου<br />
AT<br />
ACP<br />
KS<br />
AT r<br />
KR<br />
ACP<br />
KS<br />
AT<br />
KR<br />
ACP<br />
TE<br />
OH<br />
S S S<br />
O<br />
O<br />
O<br />
cyclise<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
AT r from RAPS 1<br />
OH<br />
hybrid product<br />
Oliynyk et al., 1996: Αλλαγή δομικής μονάδας στη παραγωγή τρικετίδιου. Πληθώρα<br />
παραδειγμάτων αξιοποίησης διαφορετικών εκλεκτικοτήτων των ΑΤ.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 41
AΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΩΝ ΣΤΗ DEBS1-TE<br />
Hybrid PKS<br />
avermectin<br />
loading<br />
module<br />
ery extension modules<br />
end<br />
OH<br />
KR<br />
KR<br />
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP<br />
S<br />
R<br />
O<br />
S<br />
R<br />
O<br />
OH<br />
S<br />
R<br />
TE<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
cyclise<br />
R<br />
O<br />
O<br />
R: Me, Et, i-Pr, sec-Bu<br />
R: Ph<br />
Jacobsen et al., 1997: Εμφύτευση του στοιχείου φόρτωσης δομικής μονάδας από το γονίδιο της<br />
avermectin. Παραγωγή αναλόγων του τρικετίδιου.<br />
Wilkinson et al., 2001: Εμφύτευση του στοιχείου φόρτωσης δομικής μονάδας (Ph) από το<br />
γονίδιο του soraphen A<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 42
ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ<br />
rap module 2<br />
load<br />
module 1<br />
module 2<br />
module 3<br />
module 4<br />
module 5<br />
module 6<br />
end<br />
ER<br />
DH KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
KR<br />
AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP KS AT ACP TE<br />
O<br />
HO<br />
OH<br />
O<br />
Et OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
Et<br />
novel octaketides<br />
OH<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
•Rowe et al. 2001: Εμφύτευση ολοκλήρου στοιχέιου απο το γονίδιο<br />
της ραπαμυκίνης και παραγωγή νέων οκτακετιδίων μακρολιδίων<br />
από καλιεργειες Saccharopolyspora erythraea.<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 43
ΥΒΡΙΔΙΚΕΣ PKS<br />
Avermectin-erythromycin υβριδικά αντιβιοτικά<br />
O<br />
OH<br />
Ανάλογα της ερυθρομυκίνης<br />
R 2<br />
O<br />
OH<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
NMe 2<br />
Α, Β, D, με τουλάχιστον την<br />
ίδια δραστικότητα<br />
O<br />
O<br />
OR 1<br />
OH<br />
O<br />
R 1 = H or CH 3 ,<br />
R 2 = H or OH<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 44
Mutasynthesis<br />
(a)<br />
(b)<br />
(c)<br />
(d)<br />
Wild type<br />
Μεταλλαγμα στο οποίο η βιοσύνθεση έχει ανασταλεί σε κάποιο κρίσιμο στάδιο<br />
Precursor-directed biosynthesis: στη καλλιέργεια προσθέτουμε ανάλογα<br />
(mutasynthon) των πρόδρομων ενώσεων – ανταγωνισμός με τις φυσικές πρόδρομες<br />
ενώσεις<br />
Mutasynthesis: Μόνο τα ανάλογα παράγονται
Rapamycin → Rapalogues<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 46
Βελτιώνοντας το Borrelidin<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 47
ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ<br />
(combinatorial biosynthesis)<br />
• Συστήματα ετερόλογης έκφρασης<br />
– Streptomyces coelicolor CH999 (actinorodin defecient, τύπος ΙΙ),<br />
– Streptomyces lividans K4-114 (actinorodin defecient, τύπος ΙΙ),<br />
– Saccharopolyspora erythraea JC2 (ερυθρομυκίνη deficient, τυπος Ι)<br />
– E.coli με συν-έκφραση Ppant – ενζύμων<br />
– Myxococcus xanthus<br />
– Pseudomonas putida<br />
• Στα συστήματα ετερόλογης έκφρασης θα πρέπει να λαμβάνεται<br />
υπόψη εάν υπάρχουν?<br />
– Post-PKS ενζυμα<br />
– Φωσφωπαντοθεϊνικός βραχίονας<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 48
Παράδειγμα μεθοδολογίας ετερόλογης<br />
έκφρασης σε Pseudomonas putida<br />
• Μεθοδολογία ετερόλογης έκφρασης βιοσυνθετικών<br />
γονιδίωναπόμηδιαθέσιμεςπήγεςήδύσκολες<br />
πηγές.<br />
– Δημιουργία βιβλιοθηκών βιοσυνθετικών γονιδιωμάτων<br />
– Αναγνώριση και ανάλυση του γονιδιακού συγκροτήματος<br />
– Κλωνοποίηση σε κατάλληλη κατασκευή με υποκινητή κλπ<br />
– Μετασχηματισμός σε pseudomonad<br />
– Παραγωγή της ουσίας στον ετερόλογο ξενιστή<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 49
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 50
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ<br />
•Η συνδυαστική βιοσύνθεση δίνει τη δυνατότητα παραγωγής<br />
βιβλιοθήκης αναλόγων φυσικών προϊόντων με σχεδιασμένες<br />
αλλαγές στο επίπεδο των γονιδίων. Τεραστία δυναμική στην<br />
ανακάλυψη νέων φαρμάκων<br />
•Παντρεύει τη μοριακή βιολογία με τη συνθετική χημεία<br />
•Επιθυμητή η δημιουργία βιοσυνθετικών βιβλιοθηκών δομικών<br />
μονάδων<br />
•Σχεδιασμός φαρμάκων: Στο μέλλον o σχεδιασμός φαρμάκων θα<br />
γίνεται με το ανακάτεμα και ταίριασμα γονιδίων κατά παραγγελία<br />
για τη δημιουργία νέων επιθυμητών ενώσεων. Αξιοποίηση του<br />
ενζυμικού συστήματος σαν μια μοριακή γραμμή παραγωγής<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 51
ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ<br />
Ανασκόπησης (Για τις εξετάσεις να διαβάσετε τα δυο πρώτα)<br />
1. Amoutzias GD, Van de Peer Y, Mossialos D. Evolution and taxonomic<br />
distribution of nonribosomal peptide and polyketide synthases. Future<br />
Microbiol. 2008;3:361-70.<br />
2. Weissman KJ. Mutasynthesis - uniting chemistry and genetics for drug<br />
discovery. Trends Biotechnol. 2007 ;25(4):139-42.<br />
3. Bode HB, Müller R. Analysis of myxobacterial secondary metabolism<br />
goes molecular. J Ind Microbiol Biotechnol. 2006;33(7):577-88.<br />
4. Weissman KJ, Müller R. A brief tour of myxobacterial secondary<br />
metabolism. Bioorg Med Chem. 2009 ;17(6):2121-36.<br />
5. Hertweck C. The biosynthetic logic of polyketide diversity. Angew<br />
Chem Int Ed Engl. 2009;48(26):4688-716.<br />
6. Staunton, J. and Weissman, K.J., 2001. Natural Products Reports, 18,<br />
380-416. (PKS)<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 52
ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ<br />
Ερευνητικά<br />
1. Donadio, S.; Staver, M. J.; McAlpine, J. B.; Swanson, S. J.; Katz, L. Science 1991, 252, 675-<br />
679.<br />
2. Donadio, S.; McAlpine, J. B.; Sheldon, P. L.; Jackson, M.; Katz, L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.<br />
1993, 90, 7119.<br />
3. Cortes, J.; Wiesmann, K. E. H.; Roberts, G. A.; Brown, M. J. B.; Staunton, J.; Leadlay, P. F.<br />
Science 1995, 268.<br />
4. Oliynyk, M.; Brown, M. J. B.; Cortes, J.; Staunton, J.; Leadlay, P. F. Chem. Biol. 1996, 3, 833-<br />
839.<br />
5. Jacobsen, J. R.; Hutcinson, C. R.; Cane, D. E.; Khosla, C. Science 1997, 277, 367-369.<br />
6. Wilkinson, C. J.; Frost, E. J.; Staunton, J.; Leadlay, P. F. Chem. Biol. 2001, 151, 1-12.<br />
7. Hill, A., M., Harris, J. P., Siskos, A., P., 1998. Chem. Commun., 2361-2362.<br />
8. Rowe, C. J., Bohm, I. U., Thomas, I. P., Wilkinson, B., Rudd, B. A.M., Foster, G., Blackaby, A.<br />
P.,Sidebottom, P. J., Roddis, Y., Buss, A. D., Staunton, J., Leadlay, P. F., Chemistry and<br />
Biology 2001, 8, 475-485.<br />
9. Siskos AP, Baerga-Ortiz A, Bali S, Stein V, Mamdani H, Spiteller D, Popovic B, Spencer JB,<br />
Staunton J, Weissman K, Leadlay PF (2005) Molecular Basis of Celmer’s Rules:<br />
Stereochemistry of Catalysis by Isolated Ketoreductase Domains from Modular Polyketide<br />
Synthases. Chem Biol, 12(10): 1145-1153<br />
Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 53