Opsporen in surveillance stalen - UZ Leuven

Evaluation and Development of a Phenotypic 

Screening Strategy for 

Emerging β-lactamases in Gram-negative Bacilli. 

Apr. Willems Elise 

6 April 2011 

Critically Appraised Topic 

Supervisors: Dr. R. Cartuyvels 

Dr. K. Magerman 

PhD S. Nys

Inhoudsweergave 

– Inleiding 

– Deel 1: Extended spectrum ß-lactamasen 

(molecular class A) 

– Deel 2: Derepressed & plasmid-mediated AmpC 

ß-lactamasen 

– Deel 3: Carbapenemases 

– Take home messages

Inleiding: 

Waarom screenen naar emerging β-lactamases in GNB 

Infecties met 

MDR-GNB* 

Morbiditeit 

Mortaliteit 

Hospitalisatie periode 

Gezondheidskosten 

Belangrijke oorzaken van MDR-GNB 

* ESBL 

* plasmid-mediated AmpC 

* derepressed AmpC 

* carbapenemases 

* multi-drug resistente Gram-negatieve bacillen

Inleiding: 

Waarom screenen naar emerging β-lactamases in GNB 

Snel opsporen GNB met 

* ESBL 

* plasmid-mediated AmpC 

* derepressed AmpC 

* carbapenemases 

- Optimalisatie antibioticum therapie 

- Maatregelen ter preventie van ZKH 

verspreiding 

- Epidemiologische doeleinden





ß-lactamasen 



Extended spectrum ß-lactamasen 

• Opsporen in surveillance stalen 

• Opsporen in Gram-negatieve isolaten 

• Confirmatie 

1. Methoden 

2. DDST 

3. Cica-Beta test 

4. Semi-automatische systemen 

5. ESBL Etest ® strips 

6. CDDST





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST

ESBL 

Opsporen in surveillance stalen 

– Beperkte literatuurgegevens 

– Chromogene agars 

• selectieve isolatie & identificatie van ESBL producerende GNB 

• commercieel beschikbaar 

– CHROMagar ESBL (Kanto Chemical) 

– chromID ESBL (bioMérieux) 

– Brilliance ESBL agar (Oxoid) 

chromID ESBL bioMérieux

ESBL 


– Chromogene agars 

• CHROMagar ESBL 1 

– Sensitiviteit (SN) = chromID ESBL 

– Beperking: inclusie van slechts klein # ESBL producers 

• chromID ESBL 2,3 

Chromogene ESBL agars ≥ selectieve GN-agars met AB (disk) toegevoegd. 

– SN ≥ selectieve = werkbesparend GN-agars (ESBL-screening met CTX & CAZ* in non-Enterobacteriaceae) 

• Brilliance ESBL 4 

– SN > Mck-agar met CAZ disk 

– SN = chromID ESBL 

1. Saito R, Lett Appl Microbiol. 2010 

2. Reglier-Poupet H, J Med Microbiol. 2008. 

3. Paniagua R, Diagn Microbiol Infect Dis. 2010. 

4. Huang TD, J Clin Microbiol. 2010. 

*CTX= cefotaxime 

CAZ= ceftazidime





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST

ESBL 

Opsporen in Gram-negatieve isolaten 

– CLSI, EUCAST, BSAC, NVMM 

• Geen uniforme aanbevelingen 

• Geen aanbevelingen voor non-Enterobacteriaceae 

•

ESBL 


– CAZ, CTR of CTX als enige indicator 

– CPD 

• Meest sensitief 

• Slechte specificiteit 

– CAZ + CTR of CAZ + CTX 

• Goede sensitiviteit 

• Goede specificiteit 

CAZ= ceftazidime 

CTR= ceftriaxone 

CTX= cefotaxime 

CPD= cefpodoxime





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST

ESBL confirmatie 

Methoden 

~ in vitro inhibitie van ESBL door clavulaanzuur 

CAZ+CA 

CAZ 

CT/CTL ≥ 8 

CAZ AMC CTX 

CTX 

CTX+ CA 

Phantom zone 

Double disk synergy test 

DDST 

Combined DDST 

CDDST 

Deformatie van cefalosporine inhibitie ellips 

Etest ® ESBL detection strips


Methoden 

~ in vitro inhibitie van ESBL door clavulaanzuur 

Vitek2 panel met ESBL confirmatie test 

(indicatoren= CTX, CAZ, FEP) 

Cica-Beta test strips 

(indicator= chromogeen cefalosporine, HMRZ-86) 

Phoenix panel met ESBL confirmatie test 

(indicatoren= CTX, CTR, CAZ, CPD)


Methoden 

Vals negatieve resultaten mogelijk i.g.v. coproductie van 

• AmpC 

• Carbapenemase





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST


1. DDST 

– Voordelen 

• Goedkoop 

• Goede performantie 

– Nadelen 

• Interpretatie = moeilijk & subjectief 

• Correcte afstand tussen disks 

DDST niet de meest geschikte ESBL confirmatie test





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST



– Voordelen 

• Eenvoudig 

• Reductie ESBL confirmatie tijd 

– Nadeel 

• Grote variaties in gerapporteerde sensitiviteit (74 5 -95% 6 ) 

Verder evaluaties vereist alvorens gebruik in 

routine klinische laboratoria. 

5. Garrec H, J Clin Microbiol. 2011. 

6. Lavigne JP, Pathol Biol (Paris). 2011.





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST


4. Semi-automatische systemen: Phoenix - Vitek2 

– Non-inducible Enterobacteriaceae 

• Phx & Vitek2, afzonderlijk in ≠ studies geëvalueerd. 

• Slechts 1 direct vgl.-studie 7 

– E. coli & Klebsiella spp. 

» SN Phoenix (96%) > Vitek2 (89%) 

» SP Phoenix (85%) = ~ Vitek 2 (81%) 

– Inducible Enterobacteriaceae 

• Phx & Vitek2 

– SN Vitek2 < andere ESBL confirmatie methoden 8 (P< 0,001, Enterobacter spp.) 

– SP Phoenix = 33,3% 9 (Enterobacter & Citrobacter spp.) 

7. Thomson KS, J Clin Microbiol. 2007. 


9. Wiegand I, J Clin Microbiol. 2007.





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST


5. ESBL Etest® strips 


• Garrec H et al., J Clin Microbiol. 2011 

1. Vergelijking performantie Etest ® ESBL detectie strips 

– SN (CT/CTL Etest ® + TZ/TZL Etest ® ) > SN (CT/CTL Etest ® ) 

!!! P > 0,001 

– PM/PML Etest ® : Hoogste SN (97%) & SP (79%) 

Contra aanbevelingen fabrikant!



– AmpC coproducing Enterobacteriaceae 

• CT/CTL & TZ/TZL Etests ®10-14 

– Reden: Vals negatieve & niet interpreteerbare resultaten 

• PM/PML Etest ® op MH agar 11 

– SN = 66%, Enterobacter spp. 

• PM/PML Etest ® op een cloxacillin bevattende agar 

– Nadelen 

– SN= 100% 11 

• Interpretatie = moeilijk 

– ± 30% inhibitie elipsen worden verkeerd afgelezen 110 

• Kostprijs 

– Duurder dan CDDST 

• MIC waarden buiten de concentratiegradiënt niet-interpreteerbaar 

10. Harada S, Korean J Lab Med. 2008. 


12. Laffineur K, Abstr Intersci Conf Antimicrob Agents, 2003 

13. Stürenvurg E, J Antimicrob Chemother. 2004. 

14. Mohanty S, J Infect Dev Ctries 2009.


• opsporen in surveillance stalen 

• opsporen in Gram-negatieve isolaten 


1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST 

» Non-inducible Enterobacteriaceae 

» AmpC coproducing Enterobacteriaceae


6. CDDST 


• Aanbevolen door CLSI, NVMM, BSAC 

– Indicator cefalosporines= CAZ & CTX 

• Garrec H et al., J Clin Microbiol. 2011 

– Performantie (CTX + CAZ) = (CTX) 

– Performantie best voor CTX gecombineerd met FEP





1. Methoden 

2. DDST 




6. CDDST 

» Non-inducible Enterobacteriaceae 

» AmpC coproducing Enterobacteriaceae


6. CDDST 


i. Indicator = 3 e generatie cefalosporine & geen AmpC inhibitor 

zeer lage SN (e.g. 46%, Enterobacter spp., CTX & CAZ) 15 

ii. 

Aanbevelingen NVMM & BSAC (inducible Enterobacteriaceae) 

– Indicator = FEP 

lage SN (e.g. 85%, Enterobacter spp.) 15 

iii. 

FEP (indicator) &/of cloxacillin-containing MH-agar (200-250 µg/ml) 

– SN= 97-100% (Enterobacter spp., P. aeruginosa) 15 

Nood aan bijkomende evaluatie (non-Enterobacter spp. & plasmid-mediated AmpC) 


16. Jiang X, Antimicrob Agents Chemother. 2006.


6. CDDST 


iv. 

Toevoegen boorzuur (AmpC inhibitor) aan CTX (+CA) & CAZ(+CA) 

SN & SP van ESBL detectie 

in chromosomale & plasmid-gemedieerde AmpC producers


6. CDDST 

– ESBL Etest ® 

• Nadelen 

• Geen betere performantie in vgl met CDDST 

CDDST verkozen boven Etests ® voor ESBL confirmatie





ß-lactamasen 



Derepressed & plasmid-mediated AmpC 




1. Variation of modified indirect 3D test 


3. DDST 

4. Etest ® strips 

5. Disk potentiatie test

Derepressed of plasmid-mediated AmpC 


– Chromogene agars voor specifieke isolatie van AmpC producers 

• Nog niet ontwikkeld 

– Rol van chromogene ESBL agars 

• Niet geëvalueed voor AmpC detectie 

• Derepressed AmpC = vals positieven







3. DDST 



Derepressed of plasmid-mediated AmpC 


– Aanbevelingen EUCAST & NVMM 

• Gevoeligheid aan cefoxitine (







3. DDST 



Derepressed of plasmid-mediated AmpC confirmatie 

1. Variation of modified indirect three-dimensional test 

Bereiding enzyme extract vereist meerdere X 

invriezen & ontdooien 

Niet uitvoerbaar in meeste routine klin. labo’s 

Figure 7. The modified indirect three-dimensional test for AmpC detection. 

Organisms showing clear distortion in the zone of inhibition are considered as 

AmpC producers (Test and control strains A and B). Strain C showing minimal 

distortion is considered indeterminate. Strain D is the negative control [56].



– Niet geschikt voor confirmatie derepressed AmpC 

• Livermore DM, J Antimicrob Chemother. 2007. 

– 25 derepressed AmpC producers 

– SN=78% 

– Bruikbaar voor plasmid-mediated AmpC confirmatie=


3. DDST 

– Beperkt geëvalueerd 

– Nadelen 

• Interpretatie = moeilijk & subjectief 

• Correcte afstand tussen disks 

DDST niet de meeste geschikte AmpC confirmatie test

Derepressed of plasmid-mediated AmpC confirmatie: 

4. Etest ® strips (CN/CNI & FX/FXI) 

– Etest ® strips CN/CNI & FX/FXI 

• 1 zijde: concentratiegradient cefotetan (CN) of cefoxitine (FX) 

• Andere zijde: zelfde AB + constante [cloxacillin]


4. Etest ® strips (CN/CNI & FX/FXI) 

– Beperkt # evaluatiestudies 17-19 

• Enkel in plasmid-mediated AmpC producers 

• Goede performantiecijfers 

• SN (CN/CNI + FX/FXI Etest ® ) > SN (CN/CNI Etest ® ) 19 

» Verschil niet significant (94% t.o.v. 96%)! 

Nood aan bijkomende evaluaties (incl. derepressed AmpC producers.) 

17. Adler H,. Abstract ECCMID 2009. 

18. Tsakris A, J Clin Microbiol. 2009. 

19. Bolström A, Abstract ICAAC 2006.


5. Disk potentiatie test 

– AmpC inhibitor= boorzuur 

– Betrouwbaar voor confirmatie plasmid-mediated AmpC productie 20-26 

• ! Verschillen in study design 

– # & type indicator cefalosporine 

– hoeveelheid inhibitor toegevoegd 

– Nood aan bijkomend onderzoek: 

• beste disk potentiation test configuratie 

• in derepressed AmpC producers 

– Nadeel: niet commercieel beschikbaar 

20. Tenover FC, J Clin Microbiol. 2009. 

21. Coudron PE, J. Clin Microbiol. 2005. 

22. Yagi T, J Clin Microbiol. 2005. 

23. Brenwald NP, J Antimicrob Chemother. 2005. 

24. Lee W, Korean J Lab Med. 2009. 

25. Tan TY, Antimicrob Agents Chemother. 2009.





ß-lactamasen 



Carbapenemases 


• Opsporen in Enterobacteriaceae isolaten 


– klasse A in Enterobacteriaceae 

– MBL in Enterobacteriaceae, P. aeruginosa & Acinetobacter spp.

Carbapenemase 


– Beperkte literatuurgegevens 

– Chromogene CHROMagar KPC 

• Slechts beperkt geëvalueerd in KPC & VIM producers 26,27 

• Betrouwbaar ter opsporing andere carbapenemasen (e.g. OXA-48, IMP) 

• Gebrek aan gouden standaard om goede performantiedata te creëren. 

Nood aan bijkomende evaluaties alvorens gebruik in routine laboratoria 

26. Panagea T, Int J Antimicrob Agents. 2011. 

27. Samra Z, J Clin Microbiol. 2008.







Carbapenemase 

Opsporen in Enterobacteriaceae isolaten 

– Aanbevelingen CLSI & DWP*: verschillen! 

Class Niet aanbevolen A carbapenemasen in Proteus, 

SN Serratia, (≥2 µg/ml)= Providencia 75% & 

SN (≥0,5 Morganella µg/ml)= spp. 100% 

MEM: ≤ 23 mm OF ≥0,5 µg/mL 

Aanbevolen in E. coli, Klebsiella, Salmonella, Enterobacter & Citrobacter spp. 

Lage SN ( 78%) 

1) CLSI breekpunten enkel voldoende gevoelig voor KPC 

SN voor detectie ≠ class A carbapenemases= 75% 

2) Minder specifiek als IMP & MEM 

*Dutch Working Party on the Detection of Highly Resistant Microorganisms






1. MHT 

2. Modified MHT 

3. DDST 

4. CDDST 


Klasse A Carbapenemases (e.g. KPC) 

Confirmatie in Enterobacteriaceae 

1. Modified Hodge Test (MHT) 

– Voordeel: hoge SN (93-95%) 

– Nadelen: 

– Lage specificiteit 

– geen onderscheid ≠ klassen carbapenemasen 

– arbeidsintensief 

– soms moeilijk te interpreteren 

2. Modified MHT 26 

– Voordeel: 

– Class A carbapenemasen 100% onderscheidbaar 

– Nadeel: 

van andere klasse ß-lactamasen 

– arbeidsintensief 


Niet ideaal voor gebruik in 

Routine klinische laboratoria 

26. Pasteran F, J Clin Microbiol. 2010.



3. DDST (boorzuur disk) 

– CDDST toont betere performantie 26 

– Interpretatie= moeilijk en subjectief 

– Niet aanbevolen door CLSI & DWP 

Niet de meest geschikte test voor klasse A carbapenemase confirmatie 

26. Pasteran F, J Clin Microbiol. 2010.



4. CDDST 

– Boorzuur = inhibitor 

i. Home-prepared disks 

– Vnl. geëvalueerd in KPC-producerende K. pneumoniae 

verschillend 

Goede performantie



4. CDDST 



ii. Rosco’s KPC+MBL Confirm ID kit* 

– MEM = indicator 

APB = inhibitor 

– Giske et al., Clin Microbiol Infect. 2011. 

* Enkel geëvalueerd voor KPC confirmatie 

* SN= 100%, SP= 98% (~ home prep. disk MEM+600µg APB) 

Rosco Diagnostica A/S, Taastrup, Denmark



4. CDDST 



ii. Rosco’s KPC+MBL Confirm ID kit* 

iii. Aanbelingen DWP (~ advies EUCAST experts & ESGARS)






– MBL in Enterobacteriaceae, P. aeruginosa & Acinetobacter spp. 

1. Modified MHT 


3. MBL Etest ® 

4. DDST & CDDST

Metallo-bèta lactamases 

Confirmatie in Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, Acinetobacter 

1. (Modified) MHT 

– Aanbevolen door CLSI 

– Nadelen: 

– onmogelijk om MBL te onderscheiden van andere klasse 

carbapenemase 


Niet – geschikt arbeidsintensief voor MBL confirmatie



2. Inhibitor based confirmatie testen 

– MBL activiteit ~ Zn 2+ 

Inhibitoren = Zn-chelatoren (e.g. EDTA, MPA, DPA) 

i. Cica-Beta test 

ii. 

– Te lage SN niet geschikt 

MBL Etest ® (IP/IPI) 

– Enkel bruikbaar indien MIC > 4µg/ml 

– Te lage SN niet geschikt 

– Indien MIC ≤ 4 µg/ml niet interpreteerbaar resultaat! 

– Meeste MBL-producerende Enterobacteriaceae: MIC < 4 µg/ml 

» Ondanks, aanbevolen door DWP voor MBL confirmatie in 

Enterobacteriaceae

27. Picão RC, J Clin Microbiol. 2008. 





ii. MBL Etest ® (IP/IPI) 

iii. DDST & CDDST 

– Vele studies met zware beperkingen 

– Meest volledige studie 27 

» CDDST of DDST 

~ genus van geteste bacterie 

» type indicatoren 

» hoogste SN & MPA vermijden (toxisch) 

Methode Indicator Inhibitor Cut-off 

waarde/spacing 

SN/SP 

(%) 

Enterobacteriaceae CDDST IPM (10µg) EDTA (10µL, 100mM) 5 mm 100/100 

P. aeruginosa CDDST CAZ (30µg) EDTA (8µL,100mM) 5 mm 96/100 

Acinetobacter spp. DDST IPM (10µg) EDTA (5µL, 100mM) 10mm 100/33







– Meest volledige studie 

– Rosco’s KPC+MBL ConfirmID kit 

» Indicator= MEM, inhibitor= DPA* 

» Enkel geëvalueerd in MBL producing Enterobacteriaceae 

» SN= 100% (incl. MEM gevoelige stammen) 

– Rosco’s CDDST met IMP & EDTA 

» Geëvalueerd in MBL-producing P. aeruginosa & Acinetobacter spp 

» SN= 100%, lage specificiteit 

*dipicolinic acid







– Meest volledige studie 

– Rosco’s KPC+MBL ConfirmID kit 

– Rosco’s CDDST met IMP & EDTA 

– DWP aanbevelingen voor Enterobacteriaceae 

~Studie met 

beperkingen





ß-lactamasen 



Take home messages 

• Veel literatuur beschikbaar 

– Studies vaak beperkt nood aan bijkomende onderzoeken 

• Resultaten van deze studie 

– Overzicht van performantie, voor-& nadelen van ≠ methoden 

– Toont tegenstrijdigheden tussen richtlijnen en literatuur 

– Vormt basis voor opstellen van screening & confirmatie strategie

todo’s in Jessa ZH 

SOP 

“screenen naar multi-resistente kiemen in diverse stalen” 

herschrijven conform met de bevindingen van dit werk.

Evaluation and Development of a Phenotypic Screening Strategy for 

Emerging β-lactamases in Gram-negative Bacilli.

Opsporen in surveillance stalen - UZ Leuven

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?