122原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年
Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 123Fig. 6 Differential-interference-contrast (DIC) micrographs of infection process of symbiotic C. vulgaris cells to algaefreeP. bursaria cells. Chlorella-free paramecia were mixed with isolated algae and fixed at 0.5 min (A and B), 1 min (Cand D), 10 min (E and F), 30 min (G and H), and 3 h (I-L) after mixing. Cells non-treated with Gomori’s solution ; A, C,E, G, I, K. Cells treated with Gomori’s solution; B, D, F, H, J, L. Experiments were repeated more than 10 times and theresults were reproducible. DV-I; A and B. DV-II; C and D. DV-IIIb; E and F. DV-IVb; G and H. I and J; an alga is justescaping by budding of the DV-IVb membrane (a red arrowhead). Insets of I and J; enlarged photomicrographs of theescaping alga. K and L; algae attached just beneath the host cell surface (black arrows). Note that DV-I (B) and DV-II(D) are AcPase-negative, and DV-IIIb (F) and DV-IVb (H and J) are AcPase-positive. SGCs that escaped from the hostDVs and translocated just beneath the host cell surface are AcPase-negative (L, black arrows). Bars, 10 µm (L) and 2 µm(inset in J). Updated from Kodama and Fujishima 2009. See color figure in on-line publication.H, J, and L) である。クロレラを 取 り 込 んだDV-I (Fig.6A) は、0.5-1 分 以 内 にアシドソームが 融 合 したDV-IIに 分 化 する (Fig. 6C)。DV-IとDV-IIの 食 胞 内 にはAcPase 活 性 は 検 出 されない (Figs. 6B and D)。DV-III以 降 の 食 胞 内 にはAcPase 活 性 が 観 察 される (Figs. 6F,H, J, and L)。AcPase 活 性 を 示 すDV-IIIb (Fig. 6F) や、DV-IVb (Fig. 6H) 内 で 一 部 のクロレラが 食 胞 内 で 一 次的 にリソソーム 耐 性 を 獲 得 する 理 由 を 明 らかにするために、クロレラ 除 去 細 胞 に、クローン 化 した 共 生クロレラ (C. vulgaris, strain 1N) やタンパク 質 合 成 阻害 剤 のシクロヘキシミドで 処 理 したクロレラを 与 えたところ、それでもDV-IVbは 出 現 した。 宿 主 から 単離 した 共 生 クロレラに、PV 膜 が 付 着 していた 可 能 性があるため、ミドリゾウリムシの 細 胞 膜 を 溶 かす 濃度 の 界 面 活 性 剤 で 処 理 したクロレラを 与 えたところ、それでもDV-IVbは 出 現 した。さらに、 消 化 を 免れるクロレラと 消 化 されるクロレラには、その 細 胞周 期 や 宿 主 食 胞 内 での 位 置 に 違 いは 見 られなかった(Kodama et al., 2007)。クロレラ 除 去 細 胞 と 単 離 した共 生 クロレラを 混 合 し、3 時 間 後 に 固 定 して、クロレラを 取 り 込 んだ 食 胞 の 直 径 と、 食 胞 内 のクロレラの消 化 との 関 係 を 調 べた 結 果 、 直 径 が 大 きい 食 胞 、つまり 多 数 のクロレラを 取 り 込 んだ 食 胞 は、 直 径 の 小さな 食 胞 と 比 較 して、 消 化 される 数 が 少 ないことが分 かった (Kodama et al., 2007)。この 結 果 から、 直 径の 大 きな 食 胞 には 宿 主 リソソームが 融 合 しない、もしくは、 融 合 しても 食 胞 内 にリソソーム 酵 素 が 充 満していない 可 能 性 を 考 え、Gomori 染 色 で 直 径 の 大 きな 食 胞 を 観 察 したが、AcPase 活 性 は 食 胞 全 体 に 検 出され、この 可 能 性 は 排 除 された (Kodama and Fujishima,2009)。 一 部 のクロレラだけが 一 次 的 にリソソーム 耐 性 を 獲 得 する 理 由 はまだ 明 らかではない。クロレラと 混 合 後 30 分 以 降 では、DV-IVbから 食 胞膜 の 出 芽 によってほぼ 全 てのクロレラが 徐 々に1 個ずつ 食 胞 膜 に 包 まれて 宿 主 細 胞 質 に 脱 出 する 現 象 が観 察 される (Fig. 6I、 矢 じり)。 食 胞 から 脱 出 中 のクロレラの 周 りには、AcPase 活 性 が 検 出 された (Fig. 6J、矢 じり)。 食 胞 膜 の 出 芽 現 象 は、 煮 沸 して 殺 したクロレラや 酵 母 菌 、さらにはDV-IVb 内 で 消 化 されたクロレラでも 生 じるが、これらは 食 胞 から 脱 出 後 に 例 外無 く 消 化 または 宿 主 細 胞 肛 門 から 排 出 される。 生 きている 共 生 クロレラでなくても、 食 胞 から 脱 出 できることが 分 かった。 一 方 、 直 径 0.81 μmのラテックスビーズ、 宿 主 の 餌 のバクテリア(Klebsiella pneumoniae)、墨 汁 では 食 胞 膜 の 出 芽 による 脱 出 は 生 じなかった (Kodama and Fujishima, 2005)。また、 食 胞 からのクロレラの 脱 出 は、 宿 主 とクロレラの 両 方 のタンパク 質 合 成 を 阻 害 しても 行 われた ( 児 玉 と 藤 島 , 未発 表 )。クロレラと 混 合 後 45 分 以 降 には、 食 胞 から 細 胞 質に 脱 出 したSGCが 宿 主 の 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 して 安定 化 する 現 象 が 観 察 される (Fig. 6K、 矢 印 )。このようなSGCは 宿 主 の 原 形 質 流 動 によって 細 胞 質 内 を 移動 することはない。このSGCを 包 む 膜 の 内 側 にはAcPase 活 性 は 検 出 されなかった (Fig. 6L、 矢 印 )。従 って、PV 膜 の 分 化 は、DV-IVb 膜 の 出 芽 による 食 胞脱 出 の 直 後 から 宿 主 の 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 するまでの 約 15 分 間 に 行 われることが 明 らかになった(Kodama and Fujishima, 2009)。Fig. 7Bはクロレラと 混 合 してから3 分 後 と30 分 後 の食 胞 を 観 察 し、 観 察 した 全 ての 食 胞 に 占 めるFig. 7AaのようなAcPase活 性 陰 性 の 食 胞 ( 白 い 棒 グラフ)、Fig. 7A-bのような 食 胞 の 淵 のみがAcPase 活 性 陽 性 の食 胞 ( 灰 色 の 棒 グラフ)、Fig. 7A-cの 左 の 食 胞 のようなAcPase 活 性 陽 性 の 食 胞 ( 黒 い 棒 グラフ) の 割 合 を 示したグラフである。クロレラと 混 合 後 3 分 では、AcPase 活 性 陽 性 の 食 胞 は 約 10% 存 在 する。その 後 、時 間 経 過 に 伴 ってこの 割 合 は 増 加 し、30 分 後 には 観察 したほぼ 全 ての 食 胞 がAcPase 活 性 陽 性 であった。この 時 、クロレラと 混 合 してから72 時 間 後 に 細 胞 を観 察 してクロレラの 再 共 生 率 を 調 べると 約 85%であった。 再 共 生 率 とは、 観 察 した 全 ての 細 胞 に 占 める 宿 主 細 胞 表 層 に 接 着 したSGCを 持 つ 細 胞 の 割 合 である。この 値 は、クロレラと 混 合 してから30 分 後 のAcPase 活 性 陰 性 の 食 胞 の 約 4%の 食 胞 からの 出 現 のみでは 補 うことが 出 来 ない。つまり、 細 胞 内 共 生 を 成立 させるクロレラはAcPase 活 性 陽 性 の 食 胞 から 出 現したことを 示 している。これらの 結 果 は、「 細 胞 内共 生 を 成 立 させるほぼ 全 てのクロレラは、アシドソームとリソソーム 融 合 後 のDV-IVbから 出 現 する」という 結 果 (Kodama and Fujishima, 2005) を、 組 織 化学 的 な 方 法 でも、 支 持 するものとなった (Kodama andFujishima, 2009)。細 胞 内 共 生 生 物 が 宿 主 細 胞 内 に 侵 入 して 安 定 して
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