単細胞動物ミドリゾウリムシと緑藻クロレラとの細胞 ... - 日本原生動物学会

118原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Fig. 1 Photomicrographs of algae-bearing P. bursariastrain OS1g1N (A), algae-free P. bursaria strain Yad1w(B), Chlorella vulgaris isolated from OS1g1N cells (C),strain Yad1w cells during the early infection process (4 hafter mixing with isolated algae) (D). Ma, Macronucleus.Arrow, single green Chlorella (SGC) which could establishendosymbiosis.報 告 されている (Hörtnagl and Sommaruga, 2007)。 共生 クロレラの 光 合 成 産 物 は 宿 主 の 概 日 リズムの 発 現に 深 く 関 わっており (Miwa et al., 1996; Tanaka andMiwa, 1996, 2000)、 宿 主 と 共 生 クロレラの 細 胞 分 裂 のタイミングは 互 いに 同 調 している (Kadono et al.,2004; Takahashi et al., 2007)。このように、ミドリゾウリムシとクロレラは 相 利 共 生 の 関 係 で、 双 方 の 増 殖速 度 の 調 節 機 構 をも 備 えているが、 両 者 はまだ 単 独でも 増 殖 できる 能 力 を 維 持 している。ミドリゾウリムシを 恒 暗 条 件 下 で 培 養 したり(Karakashian,1963)、タンパク 質 合 成 阻 害 剤 のシクロヘキシミド(Kodama and Fujishima, 2008; Kodama et al., 2007;Weis, 1984)、 光 合 成 阻 害 剤 (Reisser, 1976)、 除 草剤 (Hosoya et al., 1995)で 処 理 すると 容 易 にクロレラを除 去 することができる (Fig. 1B)。クロレラ 除 去 細 胞は、 共 生 クロレラを 保 持 した 状 態 と 比 較 すると 分 裂速 度 はやや 低 下 するが(Görtz, 1982)、 増 殖 能 力 は維 持 している。クロレラ 除 去 細 胞 を、ミドリゾウリムシのホモジネートから 単 離 した 共 生 クロレラ (Fig.1C) と 混 合 すると、 細 胞 口 から 食 胞 に 取 り 込 まれたクロレラの 大 部 分 は 宿 主 によって 消 化 されて 細 胞 肛門 から 排 出 されるが、 一 部 のクロレラは 消 化 を 免 れて 細 胞 内 共 生 を 再 開 する (Fig. 1D) (Karakashian, 1975;Siegel and Karakashian, 1959)。ミドリゾウリムシでは、クロレラとの 細 胞 内 共 生 が 不 安 定 な 自 然 突 然 変異 体 が 得 られている (Tonooka and Watanabe, 2002,2007)。さらに、 細 胞 が 透 明 であるため 共 生 成 立 過 程の 観 察 が 容 易 で、マイクロインジェクションも 可 能な 大 きさの 細 胞 である。これらの 特 徴 は、 二 次 共 生成 立 機 構 解 明 のモデル 材 料 として、ミドリゾウリムシと 共 生 クロレラが 適 切 であると 考 えられる 根 拠 となっていた。しかし、クロレラ 除 去 細 胞 と 共 生 クロレラを 混 合 すると、 短 時 間 で 多 数 のクロレラが 一 気に 食 胞 内 に 取 り 込 まれるため、その 後 のクロレラのFig. 2 Transmission electron micrograph of symbioticalga near the host cell surface. Chl, symbiotic C. vulgaris.CW, cell wall. PV, perialgal vacuole membrane.Mt, mitochondrion. Tc, trichocyst. (Kodama andInouye, unpub. data)運 命 の 観 察 は 困 難 を 極 め、 共 生 成 立 過 程 の 詳 細 はSiegel and Karakasian (1959) による 再 共 生 実 験 以 来 の50 年 もの 間 不 明 瞭 なままであった。 我 々は、クロレラ 除 去 細 胞 に 一 定 数 のクロレラを1.5 分 間 だけパルス的 に 与 え、その 後 チェイスして 食 胞 内 に 取 り 込 まれたクロレラの 運 命 を 計 時 的 に 追 跡 することが 可 能 な最 適 条 件 を 確 立 し、この 方 法 を 用 いてミドリゾウリムシとクロレラとの 共 生 成 立 過 程 の 全 容 を 明 らかにした (Kodama and Fujishima, 2005, 2007, 2008, 2009, 印刷 中 ; Kodama et al., 2007)。2. ミドリゾウリムシの 食 胞 の 分 化Paramecium 属 の 食 胞 の 分 化 の 研 究 はハワイ 大 学 のFokらによってP. multimicronucleatum で 詳 細 に 行 われた (Fok and Allen, 1988)。P. multimicronucleatum の 食胞 の 分 化 は 次 の4 段 階 に 分 類 されている。 新 生 の 球 形の 食 胞 DV-Iに、 食 胞 形 成 後 4-8 分 にアシドソームが 融合 して、 食 胞 内 のpHを 中 性 付 近 から3まで 下 げ、 同時 に、DV-I 膜 とアシドソーム 膜 の 膜 置 換 が 起 こり、収 縮 したDV-IIと 呼 ばれる 食 胞 になる。 食 胞 形 成 後 8-20 分 に、リソソームがDV-IIに 融 合 し、pHが 再 び6まで 上 昇 した 球 形 のDV-IIIに 分 化 して 食 胞 内 容 物 は 消化 される。その 後 、 食 胞 形 成 後 20 分 以 降 には、リソソームの 指 標 酵 素 の 酸 性 フォスファターゼ (AcPase)活 性 の 無 いDV-IVに 分 化 する。DV-IVは、 細 胞 肛 門 と

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 119融 合 し、 食 胞 内 の 未 消 化 物 を 細 胞 外 に 放 出 する。ミドリゾウリムシの 食 胞 の 分 化 に 関 する 報 告 はこれまでに 無 く、 食 胞 の 分 化 過 程 はP. multimicronucleatumと同 様 であると 予 測 されていた (Meier and Wiessner,1989)。しかし、パルスラベルとチェイスを 行い、ミドリゾウリムシの 食 胞 の 分 化 過 程 を 観 察 すると、P. multimicronucleatumとはかなり 異 なることが 明らかになった (Kodama and Fujishima, 2005)。Fig. 3に示 すように 食 胞 の 形 態 の 特 徴 と 食 胞 内 のクロレラの消 化 の 有 無 を 基 にミドリゾウリムシの 食 胞 の 分 化 過程 を8 時 期 (DV-I, DV-II, DV-IIIa, DV-IIIb, DV-IIIc, DV-IVa, DV-IVb, and DV-IVc) に 分 類 し、 各 時 期 の 出 現 時間 を 明 らかにした。クロレラ 除 去 細 胞 と 単 離 した 共生 クロレラを 混 合 すると、クロレラは 細 胞 口 から 取り 込 まれてDV-Iに 包 まれる。 球 形 のDV-Iの 食 胞 膜 は光 学 顕 微 鏡 で 容 易 に 観 察 できる。DV-Iはクロレラと混 合 してから0.5 分 以 内 に 観 察 される。0.5–1.0 分 後 には 食 胞 膜 が 収 縮 するため、 光 学 顕 微 鏡 では 食 胞 膜 が観 察 困 難 なDV-IIに 分 化 する。2.0–3.0 分 後 には 食 胞 膜が 膨 潤 して、 再 び 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 可 能 なDV-IIIに分 化 する。DV-IIIはその 食 胞 内 の 全 てのクロレラが緑 色 のDV-IIIa、 黄 色 く 退 色 した 消 化 途 中 のクロレラと 緑 色 のクロレラとが 共 存 するDV-IIIb、 食 胞 内 の 全てのクロレラが 黄 色 のDV-IIIcの3つのサブステージに 分 けられる。そして、20 分 以 降 には 食 胞 膜 が 再 び収 縮 したDV-IVに 分 化 する。DV-IVもDV-IIIと 同 様に、 食 胞 内 の 全 てのクロレラが 緑 色 のDV-IVa、 消 化がさらに 進 み 直 径 が 小 さく 茶 色 くなったクロレラと緑 色 のクロレラとが 共 存 するDV-IVb、 食 胞 内 の 全 てのクロレラが 茶 色 のDV-IVcの3つのサブステージに分 けられる。ブロモフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、コンゴーレッドのpH 指 示 薬 で 細 胞壁 を 標 識 した 酵 母 菌 をクロレラ 除 去 細 胞 に 与 え、 食胞 内 に 取 り 込 まれた 酵 母 菌 の 色 の 変 化 で 食 胞 内 のpHを 測 定 した 結 果 、P. multimicronucleatumと 同 様 に、DV-IIの 時 期 にアシドソームが 食 胞 に 融 合 して、 食 胞内 のpHは2.4-3.0に 低 下 し、DV-IIIでは 食 胞 内 のpHは6.4-7.0に 上 昇 することが 分 かった (Kodama and Fujishima,2005)。Gomoriの 染 色 (Gomori, 1952) で 食 胞 内のAcPase 活 性 の 有 無 を 調 べると、クロレラの 消 化 が観 察 されるDV-III 以 降 でAcPase 活 性 が 検 出 されることから、DV-IIIでリソソームの 融 合 が 起 こることが分 かった (Kodama and Fujishima, 2009)。3. クロレラの 再 共 生 過 程Fig. 3 Schematic representation of DV differentiation ofP. bursaria. When isolated living Chlorella sp. and algaefreeparamecia were mixed, one or several algae wereingested by the host cytopharynx into a DV-I. pH insideDV-I is 6.4-7.0. Acidified and condensed DV-II appearedat 0.5–1.0 min after mixing. pH inside DV-II is 2.4-3.0.Fusion of lysosomes occurred at 2.0–3.0 min, leading toswollen DV-IIIa to DV-IIIc. The color of the algae fadedby digestion in DV-IIIb and DV-IIIc. pH inside DV-III is6.4-7.0. Condensed DV-IVa to DV-IVc appeared at 20–30 min. pH inside DV-IV is 6.4-7.0. The color of thealgae becomes brown by digestion in DV-IVb and DV-IVc. Green circle means intact algae. Yellow circle meansdigested yellow algae. Brown circle means digestedbrown algae. See color figure in on-line publication.次 に、 食 胞 内 に 取 り 込 まれたクロレラの 運 命 を 追跡 し、 細 胞 内 共 生 を 成 立 させるクロレラが 出 現 する食 胞 とそのタイミングを 明 らかにした。ミドリゾウリムシに 共 生 しているクロレラは1つずつがPV 膜 に 包 まれて、 宿 主 細 胞 質 に 維 持 されている (Fig. 2)。そこで、 単 独 で 存 在 する 緑 色 のクロレラが、どの 食 胞 から、いつ 出 現 するかを 明 らかにするため、クロレラ 除 去 細 胞 5,000 cells/mlと、ミドリゾウリムシから 単 離 した 共 生 クロレラを1:10 4 で 混 合 し、25℃、 恒 明 条 件 下 で1.5 分 のパルスラベルを 行 った。その 後 、15 μmナイロンメッシュで 濾 過 して、Dryl 氏液 で 細 胞 を 洗 浄 して 外 液 のクロレラを 除 去 し、チェイスし、0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6, 9, 24, 48, 72 時 間 後 に4% (w/v) パラホルムアルデヒドで 固 定 して、 共 生 初

120原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Fig. 4 Fates of living and boiled Chlorella sp. during the infection process. Isolated living (A) or boiled (B) Chlorellasp. and algae-free paramecia were mixed, washed, chased, and fixed at 0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6, 9, 24, 48, and 72 hafter mixing. The percentages of cells with SGC, single digested Chlorella (SDC), DV-IIIa, DV-IIIb, DV-IVa, and DV-IVb were determined. Note that all SGCs that appeared before 0.5 h after mixing were digested by 0.5 h. ▲, cells withDV-IIIa or DV-IIIb; ●, DV-IVa or DV-IVb; ○, SGC; ■, SDC. For each fixing time interval, 100 to 300 cells were observed.Bar, 90% confidence limit. (From Kodama and Fujishima, 2005.)期 過 程 で 見 られる1 個 で 緑 色 のクロレラ ( 以 後 singlegreen Chlorella, SGCと 表 す) 、1 個 で 消 化 途 中 のクロレラ ( 以 後 single digested Chlorella, SDCと 表 す)、DV-IIIaまたはDV-IIIb、DV-IVaまたはDV-IVbを 持 つ 細 胞の 割 合 を 調 べた (Fig. 4A)。Fig. 4の 横 軸 はクロレラと混 合 後 の 時 間 、 縦 軸 は 各 食 胞 またはSGC、SDCをもつ 細 胞 の 割 合 を 示 している。DV-IIIaまたはDV-IIIbと、DV-IVaまたはDV-IVbを 持 つ 細 胞 の 割 合 は 時 間 経過 に 伴 って 減 少 し、 食 胞 内 のクロレラは 消 化 されるためSDCを 持 つ 細 胞 の 割 合 が 増 加 する。クロレラと混 合 してから0.05 時 間 後 の12%のSGCは、 最 初 から1つだけ 食 胞 内 に 取 り 込 まれたクロレラを 示 している。このようなSGCは0.5 時 間 以 内 に 全 て 消 化 されるため、0.5 時 間 後 のSGCを 持 つ 細 胞 の 割 合 は、0%になる。しかし0.5 時 間 以 降 は、SGCを 持 つ 細 胞 の 割 合 が時 間 経 過 に 伴 って 増 加 し、72 時 間 後 には34%に 達 した。0.5 時 間 以 降 に 出 現 したSGCは、 宿 主 によって 消化 されることなく、24 時 間 後 には 細 胞 分 裂 によって宿 主 細 胞 内 で 増 殖 を 開 始 し、 細 胞 内 共 生 を 成 立 させた。これらの 結 果 は、 最 終 的 に 細 胞 内 共 生 を 行 うクロレラは 最 初 から 少 数 存 在 していたSGCではなく、30 分 以 降 に 緑 色 のクロレラを 含 むDV-IVaまたはDV-IVbから 出 現 したことを 示 している (Kodama and Fu-jishima, 2005)。10 分 間 煮 沸 して 殺 した 共 生 クロレラを 使 って、1.5分 のパルスラベルとチェイスを 行 いクロレラの 運 命を 追 跡 した (Fig. 4B)。その 結 果 、 煮 沸 したクロレラでも 生 きたクロレラと 同 様 に、SGC を 持 つ 細 胞 と、DV-IIIa を 持 つ 細 胞 の 割 合 は、0.5 時 間 後 には 0%になるが、生 きたクロレラを 与 えた 時 とは 異 なり、その 後 SGCが出 現 することはなかった。また、DV-IVa を 持 つ 細 胞 の割 合 も、1 時 間 後 には 0%になり、72 時 間 後 には 全 てのクロレラが 消 化 または 排 出 された。 煮 沸 したクロレラを 与 えた 時 は、 生 きたクロレラを 与 えた 時 とは 異 なり、 消 化 されたクロレラと、 消 化 を 免 れた 緑 色 のクロレラとが 共 存 する DV-IIIb や DV-IV bは 出 現 しないことが 分 かった。パラホルムアルデヒドなどで 固 定 した共 生 クロレラでも 100%の 消 化 が 誘 導 された。これらの 結 果 から、DV-III 以 降 で 一 部 のクロレラが 消 化 を 免れる 現 象 は、 生 きたクロレラを 与 えた 時 のみに 見 られる 現 象 であることが 明 らかとなった。 生 きたクロレラのみが 持 つ AcPase 活 性 に 対 する 抵 抗 性 が 何 で 決 まるのかはまだ 明 らかにされていない (Kodama and Fujishima,2005; Kodama et al., 2007)。最 終 的 に 細 胞 内 共 生 を 行 うクロレラは、DV-IVa とDV-IVb のどちらの 食 胞 から 出 現 するのだろうか?ク

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 121Fig. 5 Source of SGCs that can establish endosymbiosis. Chlorella sp.-free cells were mixed with isolated algae,washed, chased, and fixed at 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 6, 9, 24, 48, and 72 h after mixing. (A) Cells fixed at 0.5 h after mixingwere classified into five types according to the stages of their DVs: (a) a cell with no algae, (b) a cell with digestedalgae, (c) a cell with DV-IVa, (d) a cell with DV-IVb, (e) a cell with SGC. When a cell had several types of DVs, i.e.,types b–e are seen together, the cell was classified in the order bb>a) を 持 つ 細 胞 としてカウントした。クロレラと 混 合 後 0.5 時 間 では 0%であった SGCを 持 つ 細 胞 の 割 合 は 時 間 経 過 に 伴 って 増 加 し、それとは 対 照 的 に、0.5 時 間 後 では 約 50%であった DV-IVb を持 つ 細 胞 の 割 合 が 減 少 した。72 時 間 後 には、クロレラを 持 たない 細 胞 もしくは SGC を 持 つ 細 胞 の 二 者 のみとなった。 混 合 後 、24 時 間 以 降 の SGC は 細 胞 分 裂 によって 増 殖 を 開 始 するので、 細 胞 内 共 生 に 成 功 したと考 えることができる。 一 方 、この 時 宿 主 は、72 時 間 後までほとんど 細 胞 分 裂 を 行 わなかった。72 時 間 後 のSGC を 持 つ 細 胞 の 割 合 の 約 35%という 値 は、 常 に1%以 下 しか 存 在 しない DV-IVa からの 出 現 のみでは 補 うことができない。 従 って、 最 終 的 に 細 胞 内 共 生 を 行 うクロレラの 大 部 分 は、 消 化 されたクロレラと 消 化 を 免れたクロレラが 共 存 する DV-IVb から 出 現 したことが明 らかになった (Kodama and Fujishima, 2005)。Fig. 6はクロレラの 感 染 過 程 におけるDV-I (Figs. 6Aand B)、DV-II (Figs. 6C and D)、DV-IIIb (Figs. 6E andF)、 DV-IVb (Figs. 6G and H) と、 食 胞 から 脱 出 中 のクロレラ (Figs. 6I and J)、 宿 主 細 胞 表 層 に 接 着 したクロレラ(Figs 6K and L) の 光 学 顕 微 鏡 像 (Figs. 6A, C, E,G, I, and K) と、その 時 のGomori 染 色 像 (Figs. 6B, D, F,

122原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 123Fig. 6 Differential-interference-contrast (DIC) micrographs of infection process of symbiotic C. vulgaris cells to algaefreeP. bursaria cells. Chlorella-free paramecia were mixed with isolated algae and fixed at 0.5 min (A and B), 1 min (Cand D), 10 min (E and F), 30 min (G and H), and 3 h (I-L) after mixing. Cells non-treated with Gomori’s solution ; A, C,E, G, I, K. Cells treated with Gomori’s solution; B, D, F, H, J, L. Experiments were repeated more than 10 times and theresults were reproducible. DV-I; A and B. DV-II; C and D. DV-IIIb; E and F. DV-IVb; G and H. I and J; an alga is justescaping by budding of the DV-IVb membrane (a red arrowhead). Insets of I and J; enlarged photomicrographs of theescaping alga. K and L; algae attached just beneath the host cell surface (black arrows). Note that DV-I (B) and DV-II(D) are AcPase-negative, and DV-IIIb (F) and DV-IVb (H and J) are AcPase-positive. SGCs that escaped from the hostDVs and translocated just beneath the host cell surface are AcPase-negative (L, black arrows). Bars, 10 µm (L) and 2 µm(inset in J). Updated from Kodama and Fujishima 2009. See color figure in on-line publication.H, J, and L) である。クロレラを 取 り 込 んだDV-I (Fig.6A) は、0.5-1 分 以 内 にアシドソームが 融 合 したDV-IIに 分 化 する (Fig. 6C)。DV-IとDV-IIの 食 胞 内 にはAcPase 活 性 は 検 出 されない (Figs. 6B and D)。DV-III以 降 の 食 胞 内 にはAcPase 活 性 が 観 察 される (Figs. 6F,H, J, and L)。AcPase 活 性 を 示 すDV-IIIb (Fig. 6F) や、DV-IVb (Fig. 6H) 内 で 一 部 のクロレラが 食 胞 内 で 一 次的 にリソソーム 耐 性 を 獲 得 する 理 由 を 明 らかにするために、クロレラ 除 去 細 胞 に、クローン 化 した 共 生クロレラ (C. vulgaris, strain 1N) やタンパク 質 合 成 阻害 剤 のシクロヘキシミドで 処 理 したクロレラを 与 えたところ、それでもDV-IVbは 出 現 した。 宿 主 から 単離 した 共 生 クロレラに、PV 膜 が 付 着 していた 可 能 性があるため、ミドリゾウリムシの 細 胞 膜 を 溶 かす 濃度 の 界 面 活 性 剤 で 処 理 したクロレラを 与 えたところ、それでもDV-IVbは 出 現 した。さらに、 消 化 を 免れるクロレラと 消 化 されるクロレラには、その 細 胞周 期 や 宿 主 食 胞 内 での 位 置 に 違 いは 見 られなかった(Kodama et al., 2007)。クロレラ 除 去 細 胞 と 単 離 した共 生 クロレラを 混 合 し、3 時 間 後 に 固 定 して、クロレラを 取 り 込 んだ 食 胞 の 直 径 と、 食 胞 内 のクロレラの消 化 との 関 係 を 調 べた 結 果 、 直 径 が 大 きい 食 胞 、つまり 多 数 のクロレラを 取 り 込 んだ 食 胞 は、 直 径 の 小さな 食 胞 と 比 較 して、 消 化 される 数 が 少 ないことが分 かった (Kodama et al., 2007)。この 結 果 から、 直 径の 大 きな 食 胞 には 宿 主 リソソームが 融 合 しない、もしくは、 融 合 しても 食 胞 内 にリソソーム 酵 素 が 充 満していない 可 能 性 を 考 え、Gomori 染 色 で 直 径 の 大 きな 食 胞 を 観 察 したが、AcPase 活 性 は 食 胞 全 体 に 検 出され、この 可 能 性 は 排 除 された (Kodama and Fujishima,2009)。 一 部 のクロレラだけが 一 次 的 にリソソーム 耐 性 を 獲 得 する 理 由 はまだ 明 らかではない。クロレラと 混 合 後 30 分 以 降 では、DV-IVbから 食 胞膜 の 出 芽 によってほぼ 全 てのクロレラが 徐 々に1 個ずつ 食 胞 膜 に 包 まれて 宿 主 細 胞 質 に 脱 出 する 現 象 が観 察 される (Fig. 6I、 矢 じり)。 食 胞 から 脱 出 中 のクロレラの 周 りには、AcPase 活 性 が 検 出 された (Fig. 6J、矢 じり)。 食 胞 膜 の 出 芽 現 象 は、 煮 沸 して 殺 したクロレラや 酵 母 菌 、さらにはDV-IVb 内 で 消 化 されたクロレラでも 生 じるが、これらは 食 胞 から 脱 出 後 に 例 外無 く 消 化 または 宿 主 細 胞 肛 門 から 排 出 される。 生 きている 共 生 クロレラでなくても、 食 胞 から 脱 出 できることが 分 かった。 一 方 、 直 径 0.81 μmのラテックスビーズ、 宿 主 の 餌 のバクテリア(Klebsiella pneumoniae)、墨 汁 では 食 胞 膜 の 出 芽 による 脱 出 は 生 じなかった (Kodama and Fujishima, 2005)。また、 食 胞 からのクロレラの 脱 出 は、 宿 主 とクロレラの 両 方 のタンパク 質 合 成 を 阻 害 しても 行 われた ( 児 玉 と 藤 島 , 未発 表 )。クロレラと 混 合 後 45 分 以 降 には、 食 胞 から 細 胞 質に 脱 出 したSGCが 宿 主 の 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 して 安定 化 する 現 象 が 観 察 される (Fig. 6K、 矢 印 )。このようなSGCは 宿 主 の 原 形 質 流 動 によって 細 胞 質 内 を 移動 することはない。このSGCを 包 む 膜 の 内 側 にはAcPase 活 性 は 検 出 されなかった (Fig. 6L、 矢 印 )。従 って、PV 膜 の 分 化 は、DV-IVb 膜 の 出 芽 による 食 胞脱 出 の 直 後 から 宿 主 の 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 するまでの 約 15 分 間 に 行 われることが 明 らかになった(Kodama and Fujishima, 2009)。Fig. 7Bはクロレラと 混 合 してから3 分 後 と30 分 後 の食 胞 を 観 察 し、 観 察 した 全 ての 食 胞 に 占 めるFig. 7AaのようなAcPase活 性 陰 性 の 食 胞 ( 白 い 棒 グラフ)、Fig. 7A-bのような 食 胞 の 淵 のみがAcPase 活 性 陽 性 の食 胞 ( 灰 色 の 棒 グラフ)、Fig. 7A-cの 左 の 食 胞 のようなAcPase 活 性 陽 性 の 食 胞 ( 黒 い 棒 グラフ) の 割 合 を 示したグラフである。クロレラと 混 合 後 3 分 では、AcPase 活 性 陽 性 の 食 胞 は 約 10% 存 在 する。その 後 、時 間 経 過 に 伴 ってこの 割 合 は 増 加 し、30 分 後 には 観察 したほぼ 全 ての 食 胞 がAcPase 活 性 陽 性 であった。この 時 、クロレラと 混 合 してから72 時 間 後 に 細 胞 を観 察 してクロレラの 再 共 生 率 を 調 べると 約 85%であった。 再 共 生 率 とは、 観 察 した 全 ての 細 胞 に 占 める 宿 主 細 胞 表 層 に 接 着 したSGCを 持 つ 細 胞 の 割 合 である。この 値 は、クロレラと 混 合 してから30 分 後 のAcPase 活 性 陰 性 の 食 胞 の 約 4%の 食 胞 からの 出 現 のみでは 補 うことが 出 来 ない。つまり、 細 胞 内 共 生 を 成立 させるクロレラはAcPase 活 性 陽 性 の 食 胞 から 出 現したことを 示 している。これらの 結 果 は、「 細 胞 内共 生 を 成 立 させるほぼ 全 てのクロレラは、アシドソームとリソソーム 融 合 後 のDV-IVbから 出 現 する」という 結 果 (Kodama and Fujishima, 2005) を、 組 織 化学 的 な 方 法 でも、 支 持 するものとなった (Kodama andFujishima, 2009)。細 胞 内 共 生 生 物 が 宿 主 細 胞 内 に 侵 入 して 安 定 して

124原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Fig. 7. A, Three kinds of DVs classified according to the localization of their AcPase-activity. AcPase-negative DV (a);DV with partially AcPase-positive area near DV membrane (b); entirely AcPase-positive black DV (left DV in c). Bar,10 μm. B, Timing of appearance of Gomori’s staining-positive DVs. White bars mean AcPase-negative DV. Gray barsmean DV with partially AcPase-positive area near DV membrane. Black bars mean entirely AcPase-positive black DV.Algae-free P. bursaria strain, Yad1w cells, were mixed with symbiotic C. vulgaris strain, 1N cells, for 1.5 min at 5,000paramecia/ml and 5×10 7 algae/ml, washed, chased and fixed at 3 and 30 min after mixing. The cells were stained byGomori’s staining to detect AcPase activity in DVs ingesting the algae. Results obtained from three separate experimentswere summarized as mean % ± SD. For each time point, 472–512 DVs from 233–236 paramecia were observed. At 3min, only 6.3% of the DVs were entirely AcPase-positive. On the other hand, at 30 min, ratios of such DVs were increasedto 95.6%. Thus, it shows that the majority of the DVs become AcPase-positive until 30 min. Updated Kodamaand Fujishima, 2009. See color figure in on-line publication.維 持 されるためには、 第 一 に 宿 主 細 胞 のリソソーム酵 素 の 攻 撃 を 回 避 しなければならない。これには、Listeria 属 とHolospora 属 細 菌 のように 食 胞 膜 を 貫 通 して 細 胞 質 に 脱 出 してリソソーム 酵 素 の 攻 撃 を 回 避 する 例 、Salmonella 属 細 菌 ・ 結 核 菌 ・Legionella 属 細菌 ・Brucella 属 細 菌 のように 食 胞 とリソソームとの 融合 を 阻 止 する 例 が 知 られている (Iwatani et al., 2005;山 本 と 高 谷 , 2006)。 過 去 の 研 究 では、 最 終 的 に 細 胞内 共 生 に 成 功 するクロレラは、 食 胞 にリソソームが融 合 する 前 にDV-IIから 細 胞 質 に 脱 出 すると 考 えられていた (Meier and Wiesssner, 1989)が、 我 々の 結 果 はそれが 間 違 いであることを 示 した。 最 終 的 に 細 胞 内共 生 に 成 功 するクロレラは、アシドソームとリソソームが 融 合 した 食 胞 内 で 一 次 的 にリソソーム 酵 素耐 性 能 を 獲 得 し、 次 に 食 胞 膜 の 出 芽 で 食 胞 膜 に 包 まれて 細 胞 質 に 脱 出 し、この 膜 がリソソーム 融 合 阻 止能 力 を 有 するPV 膜 に 分 化 して、 宿 主 細 胞 表 層 に 接 着して 増 殖 を 開 始 することが 明 らかになった (Kodamaand Fujishima, 2005, 2009, 印 刷 中 )。 共 生 クロレラによる3 段 階 の 宿 主 リソソーム 攻 撃 からのエスケープ 機構 ( 一 次 的 なリソソーム 酵 素 耐 性 能 の 獲 得 、 食 胞 からの 脱 出 、PV 膜 への 分 化 )は、これまでに 報 告 されたどの 寄 生 性 や 共 生 性 生 物 とも 異 なる 新 規 で 複 雑 なエスケープ 機 構 である (Fig. 8)。4. クロレラ 除 去 細 胞 に 取 り 込 まれた 共 生 可 能 なクロレラ 種 と 共 生 不 可 能 なクロレラ 種 の 運 命ミドリゾウリムシと 共 生 可 能 なクロレラと 共 生 不可 能 なクロレラを 宿 主 食 胞 に 取 り 込 ませた 時 の 運 命の 違 いを 調 べるため、9 種 15 株 の 自 由 生 活 クロレラ(C. vulgaris strain C-27, C. sorokiniana strains C-212 andC-43, Parachlorella kessleri strains C-208 and C-531, C.ellipsoidea strains C-87 and C-542, C. saccharophilastrains C-183 and C-169, C. fusca var.vacuolata strains C-104 and C-28, C. zofingiensis strain C-111, C. protothecoidesstrains C-150 and C-206, カイメンの 共 生 藻 であるChlorella sp., strain C-201) をクロレラ 除 去 細 胞 に 一定 条 件 でパルス 的 に 与 え、 食 胞 内 に 取 り 込 まれたクロレラの 運 命 を 追 跡 した。その 結 果 、ミドリゾウリムシに 共 生 可 能 な 自 由 生 活 クロレラのC. vulgaris, C.sorokiniana, P. kessleriは、 宿 主 食 胞 に 取 り 込 まれる

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 125Fig. 8 Schematic representation of timing of PV membrane differentiation from DV membrane in early infection processof symbiotic C. vulgaris to algae-free P. bursaria cells. (A) Spherical DV-I vacuole containing green algae. (B) Differentiationof condensed DV-II vacuole by fusion of acidosomes and acidification. (C) Differentiation of swollen DV-IIIvacuole by fusion of primary lysosomes. AcPase-activity positive area by Gomori’s staining are shown by a gray area inthe DV. In the DV-III vacuole, some of the algae exhibit resistance to the lysosomal enzymes and can maintain greencolor and original morphology. Remaining algae are partially digested and show yellow colors in the same DV. InternalpH of the DV-III vacuole increased. DV-III is further classified into three substages: DV-IIIa contains green algae only;DV-IIIb contains both discolored by partial digestion and green algae; and DV-IIIc contains exclusively discolored algae.(D) Differentiation of condensed DV-IV vacuole. DV-IV is classified into three substages: DV-IVa contains green algaeonly; DV-IVb contains both green and digested brown algae; DV-IVc contains digested brown algae only. (E) Appearanceof a SGC and a SDC through DV-IVb vacuole membrane budding. This phenomenon occurs notwithstanding thefact that alga is intact or partially digested. Note that alga in the buds were still covered by a gray thin layer by Gomori’sstaining. (F) Translocation of the SGCs just beneath the host cell surface, anchor there at about 10 μm interval and initiationof algal cell division to establish endosymbiosis. Note that algae attached beneath the cell surface has no AcPaseactivity, suggesting that the vacuole membrane wrapping the algae differentiate to PV membrane (red circle) immediatelyafter budding from the DV membrane. Afterward, the distance between each alga is shorter. SGCs of infectionincapableand SDCs of infection-capable Chlorella species cannot translocate beneath the host cell surface and eventuallyfailed to establish endosymbiosis. Green circle means intact algae. Yellow circle means digested yellow algae.Brown circle means digested brown algae. Updated from Kodama and Fujishima, 2009. See color figure in on-line publication.と、その 一 部 が 食 胞 膜 の 出 芽 で 細 胞 質 に 脱 出 し、さらに 宿 主 の 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 できた (Fig. 9A、 矢印 )。 一 方 、 共 生 不 可 能 な 他 種 のクロレラ (C. ellipsoidea,C. saccharophila, C. fusca var. vacuolata, C. zofingiensis,C. protothecoides)の 場 合 は、 食 胞 から 細 胞質 への 脱 出 まではできるが、 共 生 可 能 なクロレラのように 宿 主 の 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 することができず、 最 終 的 には 宿 主 細 胞 肛 門 から 排 出 された (Fig.9B) (Kodama and Fujishima, 2007)。これらの 結 果 は、宿 主 細 胞 表 層 直 下 への 接 着 が 二 次 共 生 の 成 立 の 可 否を 決 定 する 最 終 段 階 として 必 須 な 現 象 であることを示 している。さらに、 共 生 可 能 であると 報 告 されているC. vulgaris, C. sorokiniana, P. kessleriの3 種 のクロレラであればどの 株 でも 共 生 できるわけではなく、同 じ 種 でも 共 生 能 力 は 株 に 依 存 することが 分 かった(Table 1)。Takedaらは 我 々が 用 いたクロレラ 除 去 株(P. bursaria, strains OS1w and Yad1w) とは 異 なる 株(P. bursaria, strain T316w) を 用 い、この 株 には 感 染可 能 な3 種 のクロレラの 全 ての 株 が 共 生 したと 報 告 している (Takeda et al., 1998)。これらの 結 果 は、クロレラ 株 だけの 問 題 ではなく、 宿 主 株 とクロレラ 株 の 組み 合 わせも 影 響 する 可 能 性 を 示 唆 している。一 方 、 過 去 の 研 究 では、クロレラの 細 胞 壁 をアルカリ 溶 液 で 処 理 して 残 る 不 溶 性 画 分 (rigid wall)の糖 組 成 が、 共 生 可 能 なクロレラ 種 ではグルコサミン型 であり、 共 生 不 可 能 な 種 ではグルコースとマン

126原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Fig. 9. Photomicrographs of P. bursaria OS1w cells pulse-labeled with symbiotic Chlorella sp. cells isolated fromP. bursaria OS1g cells (A) and with C. saccharophilastrain C-169 cells (B). Paramecia were observed 3 h aftermixing. Note that the symbiotic Chlorella sp. cells arelocalized close to the host cell surface (arrows), whereasC. saccharophila C-169 cells are not. Ma, Macronucleus.From Kodama and Fujishima, 2007. See color figure inon-line publication.されていた(Nishihara et al., 1996; Reisser et al., 1982;Weis, 1980)。 今 回 、 我 々が 調 べたクロレラのうち、Con A 結 合 能 とクロレラ 除 去 細 胞 への 再 共 生 能 を 持 つ株 は 無 かったが、C. sorokiniana, strain C-212にはWGAが 結 合 し、クロレラ 除 去 細 胞 に 再 共 生 することができた (Table 1)。そこで、WGAでC-212 株 の 細 胞壁 をマスクした 後 、クロレラ 除 去 細 胞 と 混 合 し、 再共 生 率 への 影 響 を 調 べたところ、コントロールの 未処 理 のクロレラと 比 較 して 再 共 生 率 に 有 意 差 は 見 られなかった。これらの 結 果 は、クロレラの 細 胞 内 共生 能 力 は 細 胞 壁 の 糖 組 成 とは 無 関 係 であり、 食 胞 から 脱 出 後 に 宿 主 細 胞 表 層 直 下 に 接 着 する 能 力 の 有 無で 決 定 されることを 強 く 示 している (Kodama andFujishima, 2007)。 洲 崎 らはクロレラ 除 去 細 胞 に3 種 の酵 母 菌 (Saccharomyces cerevisiae, Rhodutorula rubra,Yarrowia lipolytica)を 与 え、 食 胞 に 取 り 込 まれた 酵 母菌 がその 後 、 宿 主 細 胞 表 層 に 定 着 するか、 宿 主 細 胞内 で 分 裂 増 殖 できるか、 宿 主 細 胞 質 に 維 持 されるか、 細 胞 内 共 生 を 成 立 させるかを 調 べた。その 結果 、R. rubraとY. lipolyticaは 宿 主 の 細 胞 表 層 に 定 着 して 増 殖 し、 再 び 共 生 クロレラが 与 えられるまでは、安 定 した 細 胞 内 共 生 を 確 立 させた。 一 方 S. cerevisiaeは 細 胞 表 層 には 定 着 せず、1 週 間 から10 日 後 に 自 然に 消 失 したと 報 告 している (Suzaki et al., 2003)。これらの 結 果 は、クロレラ 以 外 でも 宿 主 細 胞 表 層 に 接 着する 能 力 があれば、ミドリゾウリムシに 共 生 可 能 であることを 示 している。ノース 型 であると 報 告 されていた(Takeda et al.,1988)。そこで、アルカリ 溶 液 処 理 を 行 った 各 種 クロレラの 細 胞 壁 と 未 処 理 のクロレラの 細 胞 壁 に 対 するAlexa flour 488で 標 識 した3 種 のレクチン (Con A; マンノースと 結 合 、GS-IIとWGA; Nアセチルグルコサミンと 結 合 ) の 結 合 性 を 調 べ、rigid wallの 糖 組 成 とミドリゾウリムシとの 共 生 能 の 有 無 との 相 関 を 調 べた。その 結 果 、アルカリ 溶 液 処 理 の 有 無 に 関 わらず、クロレラのレクチン 結 合 性 とミドリゾウリムシとの 共生 能 の 有 無 には 相 関 は 見 られなかった (Table 1)。山 田 (1994) は、クロレラウイルスのクロレラへの感 染 能 と、クロレラの 共 生 能 の 関 係 について 考 察 している。クロレラウイルスは、 日 本 各 地 の 淡 水 湖 沼河 川 に 頻 繁 に 存 在 しているウイルスで、ミドリゾウリムシやヒドラなどと 細 胞 内 共 生 を 営 んでいたクロレラにしか 感 染 しない。ウイルスの 宿 主 となるクロレラは 細 胞 表 面 に 特 徴 があり (クロレラウイルスによって 認 識 されるレセプターの 存 在 や 酵 素 による 分解 性 )、これがミドリゾウリムシやヒドラとの 共 生 関係 の 樹 立 にも 重 要 な 因 子 となると 考 察 している。クロレラのミドリゾウリムシへの 共 生 能 の 有 無 が、クロレラウイルスの 感 染 能 の 有 無 とも 関 係 があるのかどうかは 大 変 興 味 深 い。一 方 、 過 去 の 研 究 では、クロレラの 細 胞 壁 をCon Aでマスクすると、 再 共 生 率 が 低 下 するという 報 告 が5. PV 膜 の 性 質共 生 クロレラを 包 むPV 膜 は 宿 主 の 食 胞 膜 由 来 であるが、 両 者 の 性 質 は 大 きく 異 なる。1. 食 胞 膜 には1つ以 上 のクロレラが 包 まれているが、PV 膜 にはクロレラが1つだけ 包 まれている。2. 食 胞 膜 の 直 径 は 食 胞 内のクロレラの 数 によって 変 化 する (2.1-12.9 μm) が、PV 膜 の 直 径 はクロレラの 細 胞 分 裂 時 以 外 はほとんど変 化 しない (2.5-4.5 μm)。3. 食 胞 膜 には 宿 主 の 原 形 質流 動 に 伴 う 移 動 が 見 られるが、PV 膜 には 見 られない。4. 食 胞 膜 には 分 化 に 伴 う 膜 構 造 の 変 化 が 見 られるが、PV 膜 には 見 られない。5. 食 胞 膜 には 宿 主 のリソソームが 融 合 するためAcPase 活 性 が 検 出 されるが、PV 膜 にはリソソームが 融 合 しないためAcPase 活性 が 検 出 されない (Reisser, 1992)。なぜPV 膜 がリソソーム 融 合 を 阻 止 できるか、どのようにPV 膜 を 通 じて 宿 主 と 共 生 クロレラ 間 の 物 質 交 換 がなされているかは 未 だに 明 らかになっていない。PV 膜 の 性 質 に 関しては 多 くの 点 が 不 明 瞭 なままである。我 々は、ミドリゾウリムシを 恒 明 条 件 下 でタンパク 質 合 成 阻 害 剤 のシクロヘキシミドで 処 理 すると、24 時 間 以 内 にPV 膜 が 同 調 して 膨 潤 し ( 我 々はこの 現象 をsynchronous PV-swelling, 略 してSPVSと 呼 んでいる)、SPVSが 誘 導 されると8 割 以 上 のクロレラが 消 化されることを 明 らかにした (Fig. 10B, Kodama andFujishima, 2008)。シクロヘキシミド 処 理 後 48 時 間 た

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 127Table. 1 Lectin-binding activity of the NaOH-treated and untreated cell walls of Chlorella species and their infectivityfor algae-free P. bursariaSpeciesLectin labeling of: aStrainInfectivityNon-treated cells NaOH-treared cells(alternative name)T316w OS1w WGA GS-II Con A WGA GS-II Con AC. vulgaris C-27 b − − − − + + +C. sorokiniana C-212(211-8k) cParachlorella kessleri C-208(formerly called asC. kessleri)+ + + − − ± + ±C-43 b − + − − + + +(211-11g) cC-531C. ellipsoidea C-87C. saccharophila(211-11h) c(211-1a) cC-542(211-1a) cC. fusca var. vacuolata C-104+ − − − − − ± −+ + − − − − ± −− − − − + − + +− − − − + − + +C-183 b − − + + − + +C-169 b − − − + − − +(211-8b) bC. zofingiensis C-111− − − + − − +C-28 b − − − + − − −(211-14) bC. protothecoides C-150(211-11a) b− − − + − − +− − − + − − +C-206 b − − − + − − +Symbiotic Chlorella sp. C-201 b − − − + − + +OS1g b + − − − + + +Dd1g b + − − − + + +KM2g b + − − − + + +Bwk-16(C + ) b+ ± − ± + + +1N b + − − − + + +aAlgal cells were labeled with Alexa Fluor 488-conjugated Con A, WGA or GS-II. +, 100% of cells with FITC fluorescence;±, less than 100 %; -, 0%. For each experiment, more than 100 algal cells were observed.bStrain used only in this study.cStrain used in this study and by Takeda et al. (1998).Updated from Kodama and Fujishima, 2007.

128原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Fig. 10. Photomicrographs of algae-bearing OS1g1N cells suspended in fresh culture medium containing 10 µg/ml ofcycloheximide at 5×10 3 paramecia/ml at 25 ± 1°C under the LL condition: (A) before treatment; (B) 1 day after mixingwith cycloheximide. All PVs containing green algae swelled synchronously. Furthermore, digested algae appeared in thecytoplasm (arrow). (C) 2 days after mixing with cycloheximide, the green algae were numerically reduced. (D) 3 daysafter mixing. (E) 5 days after mixing. (F) 7 days after mixing. All algal cells disappeared from the host cytoplasm. Theparamecium cells became small. Ma, macronucleus. Bar = 10 µm. From Kodama and Fujishima, 2008. See color figurein on-line publication.つと 再 びPV 膜 は 収 縮 する (Fig. 10C)。その 後 、 共 生クロレラの 数 は 徐 々に 減 少 し (Figs. 10D and E)、シクロヘキシミド 処 理 後 7 日 では 観 察 した 全 ての 細 胞 からクロレラが 消 失 した (Fig. 10F)。シクロヘキシミドは1-100 μg/mlではクロレラのタンパク 質 合 成 のみを阻 害 し、 宿 主 のタンパク 質 合 成 は 阻 害 しない (Ayalaand Weis, 1987) ことから、ミドリゾウリムシから 共生 クロレラを 除 去 する 方 法 として 用 いられてきた(Weis, 1984)。しかし、どのようにクロレラが 除 去 されるかについては 調 べられていなかった。シクロヘキシミドによるSPVSは、Schüßler and Schnepf (1992)が 報 告 したモネンシンによるPV 膜 膨 張 の 現 象 と 同 様に、 恒 暗 条 件 下 や 光 合 成 阻 害 剤 のDCMU 存 在 下 では誘 導 されない。さらにクロレラの 除 去 も 誘 導 されない (Fig. 11) (Kodama and Fujsihima, 2008)。この 結 果は、 光 合 成 活 性 存 在 下 で 同 時 に 合 成 されるクロレラのタンパク 質 が、 共 生 クロレラを 包 むPV 膜 への 宿 主リソソーム 融 合 阻 止 能 力 と 深 く 関 わっている 可 能 性を 示 唆 している。Reisser (1992) はクロレラ 細 胞 壁 とPV 膜 が 密 着 していることが 物 質 の 流 動 性 を 低 下 させ、 結 果 としてリソソーム 融 合 を 阻 止 している 可 能性 を 示 唆 しているが、モネンシンではシクロヘキシミドで 誘 導 されたようなSPVSに 引 き 続 く 消 化 の 誘 導は 起 きなかったことから、PV 膜 とクロレラ 細 胞 壁 間の 距 離 がリソソーム 融 合 阻 止 能 力 の 原 因 ではないことが 明 らかになった。さらに 我 々はGomori 染 色 を 用いて、 恒 明 条 件 下 でのシクロヘキシミド 処 理 によって 消 化 されたクロレラには 宿 主 のリソソームが 融 合

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 129し、 恒 暗 条 件 下 や 光 合 成 阻 害 剤 のDCMU 存 在 下 でのシクロヘキシミド 処 理 ではPV 膜 にリソソームは 融 合しないことを 確 認 した (Fig. 12) (Kodama and Fujishima,2008)。 恒 明 条 件 下 におけるシクロヘキシミドによるSPVSと 消 化 の 誘 導 について、Fig. 13のような 仮 説 を 立 てた (Kodama and Fujishima, 2008)。 恒 明条 件 下 のみでSPVSが 誘 導 される 理 由 や、PV 膜 とクロレラ 細 胞 壁 の 間 を 満 たしている 物 質 については 不 明であるが、これまで 情 報 が 希 薄 だったPV 膜 の 性 質 について 新 たな 見 解 が 得 られた。 今 後 は、 光 合 成 活 性存 在 下 で 同 時 に 合 成 されるクロレラのタンパク 質 の検 出 と 機 能 を 解 明 したいと 考 えている。6. まとめと 今 後 の 展 開我 々の 研 究 は、これまでの 細 胞 内 共 生 に 関 する 多くの 研 究 とは 異 なり 真 核 細 胞 の 進 化 のルーツを 探 るのではなく、 二 次 共 生 の 成 立 に 必 要 とされる 諸 現 象の 分 子 機 構 を 明 らかにすることを 目 的 にしている。この 研 究 が 進 めば、 任 意 の 細 胞 の 組 み 合 わせで 細 胞内 共 生 を 人 為 的 に 誘 導 して 有 用 な 細 胞 をつくり 出 すFig. 11. Effects of cycloheximide on the mean number ofgreen algae per host cell under LL and DD conditions.Paramecium cells were suspended in culture media with(open circle) or without (closed circle) 10 µg/ml of cycloheximideat 5×10 3 cells/ml at 25 ± 1 °C, under an LL(A) and a DD (B) conditions. The vertical bars representstandard errors of the mean quantities of green algal cellsper host cell. At each time, 20-30 Paramecium cells wereobserved. The vertical bars, respectively, represent standarderrors of the mean for three samples. Updated fromKodama and Fujishima, 2008.Fig. 12. AcPase activity around the symbiotic algae ofParamecium bursaria cells, strain OS1g, treated with 10µg/ml cycloheximide for 24 h at 5×10 3 cells/ml at 25 ±1°C, under the LL condition (A), DD condition (B), andLL condition in the presence of 10 -7 M of DCMU. Onlyunder the LL condition, many symbiotic algae were digested(some are labeled by white arrowheads) andshowed AcPase activity around them. In contrast, underthe DD condition (B) or the LL condition in the presenceof DCMU (C), algal digestion and AcPase activity in thePVs were not induced. AcPase activities appearing in Band C are those in DVs containing food bacteria. An asteriskdenotes DV containing many digested algae; Ma, macronucleus.Bar, 10 µm. From Kodama and Fujishima,2008. See color figure in on-line publication.

130原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Fig. 13. Schematic drawing illustrating some hypotheses related to the induction of SPVS and digestion of symbioticalga after treatment of alga-bearing Paramecium bursaria cells with 10 mg/ml cycloheximide under LL or DD conditions.As molecules responsible for functions of the PV membrane, two proteins that are synthesized by the algae, excretedoutside the algae and localized on the PV membrane, are postulated. One is a hypothetical maltose transporterrelatedprotein (squares on PV membrane) (Willenbrink, 1987), which is synthesized by the alga during photosynthesisand transports maltose from inside the PV membrane to the outside. Loss of this protein in the LL condition inducesaccumulation of photosynthesized carbohydrates, mainly maltose. Another one is a hypothetical lysosomal fusion blockingprotein (circles on PV membrane) that is synthesized by the algae and which has abilities to block lysosomal fusionto the PV membrane and also to attach to unknown structures immediately beneath the host surface, so that loss of thisprotein induces detachment of the PV from the host cell surface and induces fusion with the host lysosomes. The maltosetransporter-related protein disappears rapidly from the PV membrane when the algal protein synthesis is inhibited bycycloheximide. On the other hand, the lysosomal fusion blocking protein has a longer turnover time than that of the former;for this reason, this protein remains for some time on the PV membrane when the algal protein synthesis is inhibitedby cycloheximide. Under the LL condition (A), the symbiotic alga synthesizes mainly maltose by photosynthesis in thehost cell (Muscatine et al., 1967) and excretes it into a lumen between the cell wall of the algae and the PV membrane.The maltose is then transferred outside of the PV membrane through the maltose transporter-related protein on the PVmembrane. The maltose transporter-related proteins disappear from the PV membrane (B-2) when the algal protein synthesisis inhibited by treatment with cycloheximide under the LL condition (B). Ayala and Weis (1987) reported that, bytreatment with 100 mg/ml cycloheximide, the rate of carbohydrate secretion by symbiotic algae under LL showed nosignificant difference between the treated and untreated groups. Consequently, the concentration of the carbohydratesincluding maltose increases inside the PV membrane, and outside water flows into the PV and induces the SPVS (B-3).Later, the lysosomal fusion blocking protein disappears from the swollen PV membrane (B-4). Therefore, the vacuolecontaining an alga detaches from the host surface; then the host acidosomes fuse to the swollen vacuole and the vacuolecontracts by membrane replacement between the acidosomal membrane and the swollen vacuole (Fok and Allen, 1988;Kodama and Fujishima, 2005). Thereafter, lysosomal fusion occurs to the contracted vacuole and the alga is digested (B-5). As shown in Fig. 10C, the PVs that are able to avoid the lysosomal fusion in the presence of cycloheximide recontractedPV. Such vacuoles might be produced by evasion of lysosomal fusion after acidosomal fusion. Under the DDcondition (C-1), cycloheximide treatment induces loss of the maltose transporter-related protein from the PV membrane(C-2), but no morphological change is induced. Later, the lysosomal fusion blocking protein disappears from the PVmembrane (C-3). The vacuole detaches from the host cell surface and fuses with acidosomes and lysosomes; then thealgae are digested (C-4). Under the DD condition, the fate of the PV is the same as that of C, irrespective of the presenceor the absence of cycloheximide. CH, cycloheximide. From Kodama and Fujishima, 2008. See color figure in on-linepublication.

Jpn. J. Protozool. Vol. 41, No. 2. (2008) 131技 術 の 開 発 が 期 待 される。たとえば、 動 物 細 胞 に 光合 成 能 力 を 獲 得 させる 技 術 開 発 が 可 能 になるであろう。また、ゾウリムシとその 核 内 共 生 細 菌 ホロスポラの 細 胞 内 共 生 の 研 究 は、 共 生 によって 宿 主 細 胞 が各 種 のストレス 耐 性 を 獲 得 し、 生 息 域 を 拡 大 できることを 明 らかにした (Fujishima et al., 2005; Hori andFujishima, 2003)。 細 胞 内 共 生 の 人 為 的 誘 導 技 術 の 開発 は、 究 極 の 省 エネ 対 策 としての 食 料 不 足 の 解 決や、 二 酸 化 炭 素 濃 度 の 減 少 と 酸 素 濃 度 の 増 加 、さらに 生 存 に 不 適 な 各 種 ストレス 環 境 下 でも 生 育 できる生 物 の 作 成 等 に 貢 献 できることが 期 待 される。 動 物と 藻 類 との 細 胞 内 共 生 は 地 球 環 境 のいたるところに存 在 するので、ミドリゾウリムシとクロレラの 細 胞 内共 生 成 立 機 構 の 研 究 で 得 られた 成 果 は、 藻 類 を 細 胞 内共 生 生 物 とする 他 の 様 々な 共 生 系 と 生 態 系 の 維 持 及 び修 復 に 役 立 つことが 期 待 される。7. 謝 辞本 研 究 は、 児 玉 への 日 本 学 術 振 興 会 特 別 研 究 員 奨励 費 と、 藤 島 への 科 学 研 究 費 補 助 金 基 盤 研 究 (B) 海 外(No. 17405020)の 支 援 で 行 われた。引 用 文 献Albers, D. and Wiessner, W. (1985) Nitrogen nutrition ofendosymbiotic Chlorella spec. Endocyt. C. Res., 1,55-64.Albers, D., Reisser, W. and Wiessner, W. (1982) Studieson the nitrogen supply of endosymbiotic chlorellae ingreen Paramecia bursaria. Plant Sci. Lett., 25, 85-90.Ayala, A. and Weis, D.S. (1987) The effect of puromycinand cycloheximide on the infection of algae-freeParamecium bursaria by symbiotic Chlorella. J.Protozool., 34, 377-381.Brown, J.A. and Nielsen, P.J. (1974) Transfer of photosyntheticallyproduced carbohydrate from endosymbioticChlorella to Paramecium bursaria. J. Protozool., 21,569-570.Fok, A.K. and Allen, R.D. (1988) The lysosome system.In: Görtz H-D (ed) Paramecium. Springer-Verlag,Berlin Heidelberg, New York, pp 301-324.Fujishima, M., Kawai, M. and Yamamoto, R. (2005) Parameciumcaudatum acquires a heat-shock resistance inciliary movement by infection of endonuclear symbioticbacterium Holospora obtusa. FEMS Microbiol.Lett., 243, 101-105.Gomori, G. (1952) Microscopic Histchemistry. Principlesand Practice. University of Chicago Press, ChicagoGörtz, H-D. (1982) Infection of Paramecium bursariawith bacteria and yeasts. J. Cell Sci., 58, 445-453.Hori, M. and Fujishima, M. (2003) The endosymbioticbacterium Holospora obtusa enhances heat-shockgene expression in the host. Paramecium caudatum.J. Eukaryot. Microbiol., 50, 293-298.Hörtnagl, P.H. and Sommaruga, R. (2007) Oxidative andUV-induced photooxidative stress in symbiotic andaposymbiotic strains of the ciliate Paramecium bursaria.Photochem. Photobiol. Sci., 6, 842-847.Hosoya, H., Kimura, K., Matsuda, S., Kitamura, M., Takahashi,T. and Kosaka, T. (1995) Symbiotic algae-freestrains of the green paramecium Paramecium bursariaproduced by herbicide paraquat. Zool. Sci., 12,807-810.Iwatani, K., Dohra, H., Lang, B.F., Burger, G., Hori, M.and Fujishima, M. (2005) Translocation of an 89-kDaperiplasmic protein is associated with Holosporainfection. BBRC, 337, 1198-1205.Kadono, T., Kawano, T., Hosoya, H. and Kosaka, T.(2004) Flow cytometric studies of the host-regulatedcell cycle in algae symbiotic with green paramecium.Protoplasma, 223, 133-141.Kamako, S-i. and Imamura, N. (2006) Effect of JapaneseParamecium bursaria extract on photosynthetic carbonfixation of symbiotic algae. J. Eukaryot. Microbiol.,5, 136-141.Karakashian, M.W. (1975) Symbiosis in Parameciumbursaria. Symp. Soc. Exp. Biol., 29, 145-173.Karakashian, S.J. (1963) Growth of Paramecium bursariaas influenced by the presence of algal symbionts.Physiol. Zool., 36, 52-68.Kawakami, H. and Kawakami, N. (1978) Behavior of avirus in a symbiotic system, Paramecium bursariazoochlorella.J. Protozool., 25, 217-225.Kodama, Y. and Fujishima, M. (2005) Symbiotic Chlorellasp. of the ciliate Paramecium do not prevent acidificationand lysosomal fusion of the host digestivevacuoles during infection.Protoplasma, 225, 191-203.Kodama, Y. and Fujishima, M. (2007) Infectivity of Chlorellaspecies for the ciliate Paramecium bursaria is notbased on sugar residues of their cell wall components,but on their ability to localize beneath the host cellmembrane after escaping from the host digestivevacuole in the early infection process. Protoplasma,231, 55-63.Kodama, Y. and Fujishima, M. (2008) Cycloheximideinduces synchronous swelling of perialgal vacuolesenclosing symbiotic Chlorella vulgaris and digestionof the algae in the ciliate Paramecium bursaria. Protist,159, 483-494.Kodama, Y. and Fujishima, M. (2009) Timing of perialgalvacuole membrane differentiation from digestivevacuole membrane in infection of symbiotic algaeChlorella vulgaris of the ciliate Paramecium bursaria.Protist, 160, 65-74.Kodama, Y. and Fujishima, M. (in press) Localization ofperialgal vacuoles beneath the host cell surface is not aprerequisite phenomenon for protection from thehost’s lysosomal fusion in the ciliate Parameciumbursaria. Protist, doi:10.1016/j.protis.2008.11.003.Kodama, Y., Nakahara, M. and Fujishima, M. (2007) Symbioticalga Chlorella vulgaris of ciliate Parameciumbursaria shows temporary resistance to host lysosomalenzymes during the early infection process.Protoplasma, 230, 61-67.

132原 生 動 物 学 雑 誌 第 41 巻 第 2 号 2008 年Meier, R. and Wiessner, W. (1989) Infection of algae-freeParamecium bursaria with symbiotic Chlorella sp.Isolated from green paramecia. II. A timed study. J.Cell Sci., 93, 571-579.Miwa, I., Fujimori, N. and Tanaka, M. (1996) Effects ofsymbiotic Chlorella on the period length and thephase shift of circadian rhythms in Paramecium bursaria.Europ. J. Protistol., 32 (Suppl 1), 102-107.Muscatine, L., Karakashian, S.J. and Karakashian, M.W.(1967) Soluble extracellular products of algae symbioticwith a ciliate, a sponge and a mutant Hydra.Comp. Biochem. Physiol., 20, 1-12.Nishihara, N. Takahashi, T. Kosaka, T. and Hosoya, H.(1996) Characterization of endosymbiotic algae inParamecium bursaria. Jpn. J. Protozool., 29, 35 (inJapanese).Pado, R. (1967) Mutual relation of protozoans and symbioticalgae in Paramaecium bursaria. II. Photosynthesis.Acta. Soc. Bot. Pol., 36, 97-108.Reisser, W. (1976) Die stoffwechselphysiologischen Beziehungenzwischen Paramecium bursaria Ehrbg.und Chlorella spec. in der Paramecium bursariasymbiose.I. Der Stickstoff-und der Kohlenstoff-Stoffwechsel. Arch. Microbiol., 107, 357-360.Reisser, W. (1980) The metabolic interactions betweenParamecium bursaria Ehrbg. and Chlorella spec. inthe Paramecium bursaria-symbiosis III. The influenceof different CO 2 -concentrations and of glucoseon the photosynthetic and respiratory capacity of thesymbiotic unit. Arch. Microbiol., 125, 291-293.Reisser, W. (1986) Endosymbiotic associations of freshwaterprotozoa and algae. In: Progress in Protistology.Vol. 1. Corliss, J. O. and Patterson, D. J. (Eds.),Biopress Bristol. pp. 195-214.Reisser, W. (1992) Endosymbiotic associations of algaewith freshwater protozoa and invertebrates. In: Algaeand symbioses. Reisser, W. (Ed.) Biopress Bristol. pp.1-19.Reisser, W., Klein, T. and Becker, B. (1988) Studies onphycoviruses I. On the ecology of viruses attackingChlorellae exsymbiotic from an European strain ofParamecium bursaria. Arch. Hydrobiol., 111, 575-583.Reisser, W., Radunz, A. and Wiessner, W. (1982) Participationof algal surface structures in the cell recognitionprocess during infection of aposymbiotic Parameciumbursaria with symbiotic chlorellae. Cytobios,33, 39-50.Schüßler, A. and Schnepf, E. (1992) Photosynthesis dependentacidification of perialgal vacuoles in theParamecium bursaria/Chlorella symbiosis: visualizationby monensin. Protoplasma, 166, 218-222.Siegel, R. and Karakashian, S. (1959) Dissociation andrestoration of endocellular symbiosis in Parameciumbursaria. Anat. Rec. 134, 639.Suzaki, T., Omura, G. and Görtz, H-D. (2003) Infection ofsymbiont-free Paramecium bursaria with yeasts. Jpn.J. Protozool., 36, 17-18 (in Japanese).Takahashi, T., Shirai, Y., Kosaka, T. and Hosoya, H. (2007)Arrest of cytoplasmic streaming induces algal proliferationin green paramecia. PLoS ONE 2(12): e1352.doi:10.1371/journal.pone.0001352Takeda, H., Sekiguchi, T., Nunokawa, S. and Usuki, I.(1998) Species-specificity of Chlorella for establishmentof symbiotic association with Paramecium bursaria– Does infectivity depend upon sugar componentsof the cell wall? Eur. J. Protistol., 34, 133-137.Tanaka, M. and Miwa, I. (1996) Significance of photosyntheticproducts of symbiotic Chlorella to establish theendosymbiosis and to express the mating reactivityrhythm in Paramecium bursaria. Zool. Sci., 13, 685-692.Tanaka, M. and Miwa, I. (2000) Correlation of photosyntheticproducts of symbiotic Chlorella with the matingreactivity rhythms in a mutant strain of Parameciumbursaria. Zool. Sci., 17, 735-742.Tonooka, Y. and Watanabe, T. (2002) A natural strain ofParamecium bursaria lacking symbiotic algae. Eur. J.Protistol. 38, 55-58.Tonooka. Y. and Watanabe, T. (2007) Genetics of the relationshipbetween the ciliate Paramecium bursaria andits symbiotic algae. Inv. Biol. 126, 287-294.Van, Etten, J.L., Meints, R.H., Kuczmarski, D., Burbank,D.E. and Lee, K. (1982) Viruses of symbiotic chlorella-likealgae isolated from Paramecium bursariaand Hydra viridis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,3867-3871.Weis, D.S. (1980) Hypothesis: Free maltose and algal cellsurface sugars are signals in the infection of Parameciumbursaria by algae. In: Endosymbiosis and cellbiology, vol I. Schwemmler, W. and Schenk, E.A.(Eds.) Walter de Gruyter, Berlin, pp. 105-112.Weis, D.S. (1984) The effect of accumulation time of separatecultivation on the frequency of infection of aposymbioticciliates by symbiotic algae in Parameciumbursaria. J. Protozool. 31, 14A.Willenbrink, J. (1987) Die pflanzliche Vakuole als Speicher.Naturwissenschaften, 74, 22-29.山 田 隆 (1994) ウイルスによるクロレラの 殺 滅 . 水 産 学シリーズ99 赤 潮 と 微 生 物 - 環 境 にやさしい 微 生 物農 薬 をもとめて. pp. 97-109.Yamada, T., Onimatsu, H. and Van, Etten, J.L. (2006)Chlorella viruses. Adv. Virus Res. 66, 293-336.山 本 友 子 , 高 屋 明 子 (2006) 感 染 症 における 細 胞 貪 食 の役 割 ; 細 菌 がマクロファージによる 貪 食 と 殺 菌を 回 避 するしくみ, 蛋 白 質 核 酸 酵 素 , 51, 118–124.