『 レビス IgE‐ELISA キット(マウス) 』 取 扱 説 明 書

研 究 用 試 薬2012 年 12 月 3 日 改 定『 レビス ® IgE‐ELISA キット(マウス) 』 取 扱 説 明 書この 度 は 弊 社 製 品 をご 購 入 いただきましてありがとうございます。ご 使 用 に 際 してはキットに 同 梱 された 取 扱 説 明書 のみに 従 って 測 定 を 実 施 して 下 さい。なお、 操 作 法 は 弊 社 Web サイト[ 良 い 結 果 を 出 すためのポイント( 動 画 )]、 並びに[Q&A](キットの 蓋 を 開 けた 際 に 一 番 上 にあるカード(13×10cm)に 記 載 されたパスワードをご 利 用 下 さい)をご参 照 下 さい。1. 使 用 目 的本 キットはマウス IgE を 定 量 的 に 測 定 するためのサンドイッチ 酵 素 免 疫 測 定 法 です。本 キットは 研 究 のみにご 使 用 下 さい。特 長● 全 反 応 時 間 は 5 時 間 20 分 です。●マウス 血 清 または 血 漿 中 の IgE を 測 定 します。● 微 量 な 検 体 ( 標 準 操 作 法 は 5μ l)で 測 定 可 能 です。●1 キットは 96 ウエルです。● 標 準 品 はマウス 由 来 のものです。● 全 ての 試 薬 は 溶 液 タイプです。2.キットの 保 存 と 使 用 期 限キットは 2~8℃で 保 存 して 下 さい( 凍 結 厳 禁 )。この 保 存 条 件 下 でキットは 製 造 月 から 6 ヵ 月 ( 外 箱 のラベルに 記 載 )までは 安 定 です。 有 効 期 限 の 過 ぎた 試 薬 は 使 用 しないで 下 さい。 開 封 した 各 試 薬 につきましては、保 管 状 態 により 影 響 を 受 ける 可 能 性 がありますので 早 めのご 使 用 を 推 奨 します。3.イントロダクションIgE (Immunoglobulin E、 免 疫 グロブリン E)は 5 番 目 に 発 見 された 免 疫 グロブリンで、ドメイン 5 個(VH、CHε 1~4)から 構 成 されている Hε 鎖 2 本 と L 鎖 2 本 からなる 分 子 量 約 190,000 の 糖 タンパク 質で、 電 気 泳 動 的 にはγ 1 領 域 に 移 動 します。 代 謝 半 減 期 は 約 3 日 で、 正 常 人 の 血 清 中 での 濃 度 はきわめて低 く 300ng/ml 程 度 ですが、 寄 生 虫 の 感 染 や 枯 草 熱 で 増 加 します。アレルギーに 関 与 する IgE はレアギンと呼 ばれていますが、アレルゲンで 感 作 された 際 増 加 したレアギンは 皮 膚 、 呼 吸 器 、 消 化 器 などに 存 在 する 好塩 基 性 顆 粒 球 や 肥 満 細 胞 の Fcε R1 受 容 体 と Fc 部 位 で 結 合 し、 細 胞 を 感 作 し、これにアレルゲンが 結 合 すると 細 胞 は 脱 顆 粒 を 起 こしてヒスタミン、セロトニン、プロテアーゼ、ヘパリン、 化 学 走 性 因 子 、プロスタグランジン、ロイコトリエン 等 を 放 出 させ、 気 管 支 収 縮 や 粘 膜 浮 腫 、 分 泌 高 進 などにより、 気 管 支 喘 息 、 一 部 のじんま 疹 、アレルギー 性 鼻 炎 、アナフィラキシー 等 の I 型 アレルギー 反 応 を 惹 き 起 こします。弊 社 では 全 般 的 なマウス IgE 及 び 特 定 のアレルゲン(OVA)に 特 異 的 なマウス IgE 測 定 キットを 提 供 しております。4. 測 定 原 理本 キットは 標 準 品 、 希 釈 検 体 を 抗 IgE モノクローナル 抗 体 固 相 化 マイクロプレートウエル 中 でインキュベートします。2 時 間 のインキュベーションと 洗 浄 後 、ビオチン 結 合 抗 IgE モノクローナル 抗 体 を 加 え 捕 捉 されたIgE とともに 2 時 間 インキュベートします。 洗 浄 後 、ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 を 加 え、1 時 間 インキュベートします。 再 度 の 洗 浄 後 、ウエルに 残 ったペルオキシダーゼを 発 色 液 (TMB)と 反 応 させます。 反 応 は 酸性 の 溶 液 の 添 加 で 停 止 され、 反 応 の 結 果 生 じた 黄 色 の 産 物 が 450nm( 副 波 長 620nm)で 比 色 測 定 されます。吸 光 度 は IgE 濃 度 にほぼ 比 例 します。 標 準 品 濃 度 に 対 して 吸 光 度 をプロットし 標 準 曲 線 を 作 製 し、この 標 準曲 線 から 未 知 検 体 中 の 濃 度 が 決 定 されます。5. 注 意 事 項● 本 キットは ELISA 法 の 研 修 を 終 了 した 方 、または 指 導 者 の 下 でご 使 用 下 さい。用 手 法 操 作 で 測 定 する 際 にはピペッティング 操 作 の 再 現 性 が 安 定 した 方 がご 使 用 下 さい。● 準 備 並 びに 本 キット 操 作 中 は 手 袋 、 眼 鏡 、 保 護 用 着 衣 を 身 につけて 下 さい。● 試 薬 類 を 皮 膚 に 付 けないで 下 さい。 本 キットの 試 薬 が 誤 って、 目 、 口 、 傷 口 、 皮 膚 等 に 付 着 した 場 合 は 直ちに 水 道 水 で 充 分 に 洗 い 流 す 等 の 応 急 処 置 を 行 い、 必 要 な 場 合 は 医 師 の 手 当 てを 受 けて 下 さい。1

● 本 キットを 使 用 している 場 所 では 飲 食 や 喫 煙 をしないで 下 さい。● 検 体 は 感 染 の 危 険 性 があるものとして 充 分 注 意 して 取 り 扱 って 下 さい。 本 キットは 動 物 由 来 の 成 分 を 含 んでいます。● 使 用 済 みの 検 体 、 使 用 した 消 耗 品 等 は 1%ホルマリン、2%グルタールアルデヒドまたは 0.1% 以 上 の 次 亜塩 素 酸 ナトリウム 溶 液 に 1 時 間 以 上 浸 けて 下 さい。またはオートクレーブ 滅 菌 処 理 して 廃 棄 して 下 さい。 使用 した 消 耗 品 や 未 使 用 の 薬 品 類 は 所 属 施 設 の 規 定 並 びに 各 地 域 の 法 令 に 従 って 廃 棄 して 下 さい。● 試 薬 類 は 口 でピペッティングしないで 下 さい。●ロット 番 号 の 違 う 試 薬 とは 混 ぜて 使 わないで 下 さい。● 各 ステップでの 静 置 反 応 時 には、ウエルの 乾 燥 、 異 物 の 混 入 、 温 度 の 偏 り、 分 注 試 薬 の 蒸 発 を 防 止 する為 、 必 ずプレートシールを 貼 って 下 さい。●ELISA 法 は 測 定 環 境 により 影 響 を 受 けます。 測 定 操 作 、 静 置 反 応 場 所 の 室 温 :20~25℃( 実 験 台 上 またはインキュベータ 内 温 度 )を 厳 守 して 下 さい。また、 風 速 (エアコン 風 も 含 む):0.4m/sec(*1) 以 上 、 湿 度30% 未 満 の 環 境 下 での 測 定 は 避 けて 下 さい(9. 技 術 上 のヒントをご 参 照 下 さい)。(*1) 風 速 0.4m/sec の 目 安 は 弊 社 Web サイトの 動 画 「 反 応 条 件 」をご 参 照 下 さい。6. 構 成 品構 成 品 状 態 容 量(A) 抗 体 固 相 化 96 ウエルプレート 洗 浄 後 使 用 96 wells(8×12)/1 枚(B) 標 準 IgE 溶 液 (マウス)(100 ng/ml) 希 釈 後 使 用 600μ l/1 本(C) 緩 衝 液 そのまま 使 用 60ml/1 本(D) ビオチン 結 合 抗 IgE 抗 体 希 釈 後 使 用 10μ l/1 本(E) ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 希 釈 後 使 用 20μ l/1 本(F) 発 色 液 (TMB) そのまま 使 用 10ml/1 本(H) 反 応 停 止 液 (1M H2SO4) ※ 取 扱 注 意 そのまま 使 用 10ml/1 本( I ) 濃 縮 洗 浄 液 (10×) 希 釈 後 使 用 100ml/1 本プレートシール取 扱 説 明 書7. 添 付 されていないが 必 要 な 器 具 □チェックリスト□ 精 製 水 ( 蒸 留 水 )□ 標 準 溶 液 希 釈 用 試 験 管□ 洗 浄 液 希 釈 用 ガラス 器 具 (メスシリンダー・ビーカー・ 瓶 )□チップ 交 換 型 ピペット( 使 い 捨 てチップで 5μ l を 正 確 にピペッティングできるもの、 及 び 10~100μ l、100~500μ l を 正 確 にピペッティングできるもの)□ 連 続 分 注 ピペット( 例 Eppendorf の multipette plus)、50μ l を 連 続 分 注 できるもの□ペーパータオル 等 の 吸 水 性 のあるもの( 洗 浄 後 にプレートに 残 った 液 を 取 り 除 く)□ 撹 拌 器 (Vortex タイプ)□マイクロプレート 振 とう 器 ( 約 600~1,200 rpm)□96 ウエルプレート 用 洗 浄 機 (あれば 好 ましい)または 噴 射 ビン( 弊 社 Web サイトの 動 画 「 洗 浄 操 作 」をご 参照 下 さい。)□96 ウエルプレートリーダー(450 ±10 nm 、620nm:600~650nm)□データ 計 算 用 ソフトウェア8. 試 薬 の 調 製*キットの 試 薬 は 使 用 前 に 必 ず 室 温 (20~25℃)に 戻 して 下 さい(2 時 間 位 が 目 安 です)。*6.で「そのまま 使 用 」とある 試 薬 は 室 温 化 後 そのままの 状 態 で 使 用 できます。「 濃 縮 液 」とあるものについては 下 記 の 要 領 で 調 製 して 下 さい。* 測 定 に 必 要 な 分 だけ 試 薬 を 調 製 して 下 さい(ご 不 明 な 際 にはお 問 い 合 わせ 下 さい)。【 濃 縮 された 試 薬 類 】[(B) 標 準 IgE 溶 液 (マウス)(100 ng/ml)]; 標 準 曲 線 作 製 用(B) 標 準 IgE 溶 液 (マウス)(100 ng/ml)( 原 液 )と(C) 緩 衝 液 を 使 って 標 準 溶 液 を 調 製 して 下 さい。24 枚1 部

下 記 は 一 例 です。標 準 溶 液 の 容 量 緩 衝 液 濃 度 (ng/ml)原 液 0μ l 100原 液 150μ l 50μ l 75原 液 100μ l 100μ l 50原 液 50μ l 150μ l 25原 液 20μ l 180μ l 10原 液 5μ l 495μ l 1.00(ブランク) 200μ l 0[(D)ビオチン 結 合 抗 IgE 抗 体 ]10μ l を 充 分 分 取 できる 量 をご 提 供 しています。濃 縮 液 を(C) 緩 衝 液 で 1、000 倍 に 希 釈 して 下 さい。2 段 階 希 釈 をお 薦 めします。[(E)ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 ]20μ l を 充 分 分 取 できる 量 をご 提 供 しています。濃 縮 液 を(C) 緩 衝 液 で 2,000 倍 に 希 釈 して 下 さい。2 段 階 希 釈 をお 薦 めします。[(I) 濃 縮 洗 浄 液 (10×)]濃 縮 洗 浄 液 (10×)を 室 温 化 された 精 製 水 ( 蒸 留 水 )で 10 倍 に 希 釈 して 下 さい。例 :100ml の 濃 縮 洗 浄 液 (10×)+900ml の 精 製 水 ( 蒸 留 水 )(96 ウエル 全 てを 使 用 する 場 合 )【 試 薬 の 安 定 性 と 保 存 方 法 】(A) 抗 体 固 相 化 96 ウエルプレート未 使 用 ( 冷 蔵 状 態 を 保 った 状 態 でシールを 剥 がしていない) 抗 体 固 相 化 ストリップは 同 梱 のジップシールパックに 戻 し、そのまま 2~8℃で 保 存 して 下 さい。 有 効 期 限 内 安 定 性 を 保 ちます。(B) 標 準 IgE 溶 液 (マウス)(100 ng/ml)キットを 分 割 して 使 用 する 際 は 使 用 する 直 前 に 冷 蔵 庫 より 取 り 出 し 希 釈 調 製 し、 残 りの 原 液 は 室 温 に 戻 さないで 直 ちに 蓋 をしっかりと 閉 め、2~8℃で 保 存 して 下 さい。 有 効 期 限 内 安 定 性 を 保 ちます。 希 釈 した 各標 準 溶 液 は 直 ちに 使 用 し、 保 存 はしないで 下 さい。(C) 緩 衝 液 及 び(F) 発 色 液 (TMB)一 部 の 溶 液 を 使 用 する 際 は 必 要 量 より 少 し 多 めの 量 を 別 の 容 器 に 移 し、 残 りは 室 温 に 戻 さないで 直 ちに蓋 をしっかり 閉 め、2~8℃で 保 存 して 下 さい。 有 効 期 限 内 安 定 性 を 保 ちます。(D)ビオチン 結 合 抗 IgE 抗 体 及 び(E)ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物キットを 分 割 して 使 用 する 際 は 希 釈 時 に 冷 蔵 庫 より 取 り 出 し 希 釈 調 製 し、 残 りの 原 液 は 室 温 に 戻 さないで直 ちに 蓋 をしっかりと 閉 め、2~8℃で 保 存 して 下 さい。 有 効 期 限 内 安 定 性 を 保 ちます。 使 用 残 りの 希 釈 済み 液 は 廃 棄 して 下 さい。(H) 反 応 停 止 液 (1M H2SO4)使 用 残 りを 保 存 する 場 合 は、 蓋 をしっかりと 閉 め、2~8℃で 保 存 して 下 さい。 有 効 期 限 内 安 定 性 を 保 ちます。(I) 濃 縮 洗 浄 液 (10×)濃 縮 洗 浄 液 (10×)を 保 存 する 場 合 は、 蓋 をしっかりと 閉 め、2~8℃で 保 存 して 下 さい。 有 効 期 限 内 安 定 性を 保 ちます。 使 用 残 りの 希 釈 済 み 洗 浄 液 は 廃 棄 して 下 さい。9. 技 術 上 のヒント● 検 体 と 試 薬 に 不 純 物 が 混 ざらないように 気 をつけて 下 さい。1 ウエル/1 チップのご 使 用 をお 薦 めします。● 発 色 液 は 96 ウエルプレートに 使 用 するまではほぼ 無 色 または 薄 い 青 色 澄 明 です。 光 を 避 けて 保 存 して 下さい。● 反 応 停 止 液 は 使 用 するまでは 無 色 です。●やむを 得 ず、 測 定 操 作 を、 風 速 :0.4m/sec 以 上 、 湿 度 30% 未 満 の 環 境 下 で 実 施 する 場 合 には、 各 ステップの 静 置 反 応 時 、プレートシールをすることに 加 え、 下 記 のような 方 法 をご 検 討 下 さい。例 )インキュベータ 内 、 発 泡 スチロール 製 箱 内 で 静 置 反 応 させる 等 。 測 定 室 の 環 境 条 件 により 対 策 方 法 が異 なる 場 合 がありますので、 詳 細 を 弊 社 Web サイトの 動 画 「 反 応 条 件 」でご 確 認 下 さい。3

10. 検 体 の 調 製本 キットはマウス 血 清 または 血 漿 中 の IgE を 測 定 します。● 検 体 は 定 法 にしたがって 採 取 しすぐに 測 定 するか、-35℃ 以 下 で 凍 結 保 存 して 下 さい。 凍 結 した 検 体 は測 定 する 直 前 に 解 凍 し 充 分 に 撹 拌 して 下 さい。 繰 り 返 しの 凍 結 融 解 は 避 けて 下 さい。 正 しい 結 果 が 得 られない 原 因 になります。● 採 血 の 際 にヒト 用 の 採 血 管 をご 使 用 になるのは 避 けてください。 血 清 分 離 促 進 剤 等 の 添 加 剤 が 測 定 系 に影 響 を 与 える 可 能 性 が 考 えられます。● 溶 血 した 検 体 や 高 脂 質 検 体 は 異 常 値 の 発 生 原 因 となりますので 避 けて 下 さい。※ 血 液 成 分 の 影 響 ( 高 脂 質 ・ 溶 血 等 )を 抑 制 する 為 に 原 検 体 中 の 脂 質 ( 乳 ビ)・ 溶 血 が 次 項 写 真 より 高い 場 合 は 異 常 値 発 生 の 原 因 となる 場 合 がありますので 測 定 に 使 用 しないで 下 さい。本 キットの 場 合 、 溶 血 は 80mg/dL 以 上 で 影 響 が 現 れます。正 常 検 体 溶 血 検 体 正 常 検 体 溶 血 検 体 正 常 検 体 乳 ビ 検 体 正 常 検 体 乳 ビ 検 体80mg/dL 80mg/dL ( 高 脂 質 検 体 ) ( 高 脂 質 検 体 )● 濁 り 及 び 不 溶 物 のある 検 体 は 遠 心 分 離 等 で 除 去 後 測 定 に 用 いて 下 さい。● 妨 害 物 質 の 影 響 が 疑 わしい 検 体 は、 同 一 検 体 において、 異 なる 2 ポイント 以 上 の 希 釈 率 で 希 釈 直 線 性 を確 認 して 下 さい。● 検 体 は 測 定 範 囲 に 入 るよう、キット 緩 衝 液 を 用 いて 検 体 を 希 釈 して 下 さい。 検 体 を 希 釈 する 場 合 はあらかじめ 試 験 管 (PP、PE、ガラス 製 ) 等 を 用 いて 緩 衝 液 で 希 釈 し 測 定 ウエルに 分 注 して 下 さい。【 検 体 の 安 定 性 と 保 存 方 法 】検 体 は 採 取 後 すぐに 測 定 するか、1 週 間 以 内 に 測 定 する 場 合 は 2~8℃で 保 存 して 下 さい。また、 長 期 に保 管 する 場 合 は、-35℃ 以 下 での 凍 結 保 管 を 推 奨 します。また、 検 体 の 希 釈 は 用 時 調 製 として 下 さい。11. 測 定 操 作 法洗 浄 操 作 を 始 める 前 に 次 に 分 注 する 試 薬 を 前 もって 用 意 して 下 さい。抗 体 固 相 化 プレートのシールは、プレートが 充 分 に 室 温 に 戻 ってから 剥 がして 下 さい。(1) あらかじめ 調 製 した 洗 浄 液 を 各 ウエルに 満 たし、3 回 洗 浄 (*2)します。その 後 、ペーパータオルなどの上 でプレートを 逆 さにし、 軽 く 叩 きつけるようにしてウエルに 残 った 液 を 取 り 除 きます。(2) 検 体 測 定 ウエルに 予 め 適 度 に 希 釈 した 検 体 を 50μ l ずつ 分 注 します。 標 準 操 作 法 では 10 倍 希 釈 ( 緩 衝液 を 45μ l、 検 体 を 5μ l)。(3) 標 準 品 測 定 ウエルに 各 IgE 標 準 溶 液 を 50μ l ずつ 分 注 します。(4) マイクロプレート 振 とう 器 などを 用 いて 撹 拌 (*3)します。(5) プレートシールを 貼 り、 室 温 (20~25℃)で 2 時 間 静 置 (*4)します。(6) 反 応 終 了 後 、 反 応 液 を 捨 て 洗 浄 液 を 各 ウエルに 満 たし、3 回 洗 浄 (*2)します。その 後 、ペーパータオルなどの 上 でプレートを 逆 さにし、 軽 く 叩 きつけるようにしてウエルに 残 った 液 を 取 り 除 きます。(7) 各 ウエルにビオチン 結 合 抗 IgE 抗 体 を 50μ l ずつ 分 注 します。マイクロプレート 振 とう 器 などを 用 いて 撹拌 (*3)します。(8) プレートシールを 貼 り、 室 温 (20~25℃)で 2 時 間 静 置 (*4)します。(9) 反 応 終 了 後 、 反 応 液 を 捨 て 洗 浄 液 を 各 ウエルに 満 たし 3 回 洗 浄 (*2)します。その 後 、ペーパータオルなどの 上 でプレートを 逆 さにし、 軽 く 叩 きつけるようにしてウエルに 残 った 液 を 取 り 除 きます。(10) 各 ウエルにペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 を 50μ l ずつ 分 注 します。マイクロプレート 振 とう 器 などを 用 いて 撹 拌 します。(11) プレートシールを 貼 り、 室 温 (20~25℃)で 1 時 間 静 置 (*4)します。(12) 反 応 終 了 後 、 反 応 液 を 捨 て 洗 浄 液 を 各 ウエルに 満 たし 3 回 洗 浄 (*2)します。その 後 、ペーパータオルなどの 上 でプレートを 逆 さにし、 軽 く 叩 きつけるようにしてウエルに 残 った 液 を 取 り 除 きます。(13) 各 ウエルに 発 色 液 を 50μ l ずつ 分 注 します。マイクロプレート 振 とう 器 などを 用 いて 撹 拌 (*3)します。(14) プレートシールを 貼 り、 室 温 (20~25℃)で 20 分 間 静 置 (*4)します。4

(15) 各 ウエルに 反 応 停 止 液 を 50μ l ずつ 分 注 し、 発 色 反 応 を 停 止 します。(16) 撹 拌 (*3) 後 マイクロプレート 用 分 光 光 度 計 で 450nm( 副 波 長 620nm)での 吸 光 度 を 測 定 します。 副 波長 は 600~650nm の 範 囲 で 使 用 できます。(*2)、(*3)、(*4) 測 定 手 順 概 要 (7 ページ)をご 参 照 下 さい。ワークシート( 例 )Strip 1&2 Strip 3&4 Strip 5&6 Strip 7&8 Strip 9&10 Strip 11&12A 100 ng/ml 検 体 2 検 体 10 検 体 18 検 体 26 検 体 34B 75 ng/ml 検 体 3 検 体 11 検 体 19 検 体 27 検 体 35C 50 ng/ml 検 体 4 検 体 12 検 体 20 検 体 28 検 体 36D 25 ng/ml 検 体 5 検 体 13 検 体 21 検 体 29 検 体 37E 10 ng/ml 検 体 6 検 体 14 検 体 22 検 体 30 検 体 38F 1.0 ng/ml 検 体 7 検 体 15 検 体 23 検 体 31 検 体 39G 0 検 体 8 検 体 16 検 体 24 検 体 32 検 体 40H 検 体 1 検 体 9 検 体 17 検 体 25 検 体 33 検 体 4112. 計 算(1) 測 定 毎 に 標 準 曲 線 を 作 製 します。X 軸 を 標 準 溶 液 濃 度 (ng/ml)、Y 軸 を 吸 光 度 の 標 準 曲 線 グラフを 作 製して 下 さい。 標 準 曲 線 は 弊 社 Web サイト「 技 術 情 報 」「ELISA の 標 準 曲 線 」をご 参 照 下 さい。(2) 標 準 曲 線 より、 希 釈 検 体 の 吸 光 度 に 対 応 する 濃 度 (ng/ml)を 読 み 取 ります。 読 み 取 った 濃 度 に 検 体 希 釈率 ( 本 測 定 法 では 10 倍 )を 乗 じ 測 定 値 とします。* 検 体 の 吸 光 度 が 標 準 曲 線 吸 光 度 より 外 れた 場 合 は(C) 緩 衝 液 にて 適 当 倍 率 に 調 製 し 再 度 測 定 を 実 施して 下 さい。* 一 番 高 濃 度 の 標 準 溶 液 の 吸 光 度 付 近 の 検 体 は 緩 衝 液 にて 適 当 倍 率 に 調 製 し 再 度 測 定 することをお 薦め 致 します。(3) 反 応 温 度 が 高 い 場 合 、 吸 光 度 が 全 体 的 に 高 くなります。 測 定 機 器 によりますが 吸 光 度 の 信 頼 性 のない 領域 の 標 準 曲 線 は 使 用 しないで 下 さい。また、 反 応 温 度 を 20~25℃ 範 囲 内 にして 再 測 定 を 実 施 して 下 さい。*コンピュータソフトでの 演 算 処 理 では、3 次 多 項 式 または 4 パラメーターの 使 用 をお 薦 め 致 します。*マウスの 臨 床 所 見 は 臨 床 症 状 や 他 の 検 査 結 果 などを 総 合 的 に 判 断 して 行 う 事 が 必 要 です。右 のグラフは 標 準 曲 線 例 です( 吸 光 度 は、 測 定 環 境 により 変 動 します)。*プレートリーダーは SUNRISE RAINBOW(TECAN)を 使 用13.キットの 性 能● 測 定 範 囲マウス IgE を 1~100 ng/ml の 範 囲 で 測 定 できます。5

● 特 異 性この ELISA 系 で 使 用 されている 抗 体 はマウス IgE に 対 して 特 異 的 です。関 連 物 質 を 本 キットで 測 定 しました 結 果 は 下 表 の 通 りです。検 体 名 交 差 性 対 象 物 質 濃 度マウス IgE 100% 100 ng/mlマウス IgG

【 測 定 手 順 概 要 とチェックリスト】必 ず 取 扱 説 明 書 を 一 読 して 検 体 条 件 、 測 定 条 件 、 測 定 方 法 を 確 認 後 測 定 操 作 を 行 って 下 さい。操 作 法 は 弊 社 Web サイト[ 良 い 結 果 を 出 すためのポイント( 動 画 )] 並 びに「Q&A」をご 参 照 下 さい。□□□ウエルプレート、 試 薬 類 を 充 分 に 室 温 (20~25℃)に 戻 して 下 さい。 室 温 化 には 2 時 間 位 必 要濃 縮 洗 浄 液 の 希 釈 : 室 温 化 された 精 製 水 で、10 倍 に 希 釈 して 下 さい。標 準 溶 液 の 希 釈 ( 例 ): 室 温 化 された 緩 衝 液 で、 希 釈 して 下 さい。希釈例濃 度 (ng/ml) 100 75 50 25 10 1.0 0標 準 溶 液 (μl) 原 液 原 液 :150 原 液 :100 原 液 :50 原 液 :20 原 液 :5 0緩 衝 液 (μl) 50 100 150 180 495 200各 操 作 注 意 事 項 並 びに 関 連 情 報□ 抗 体 固 相 化 96 ウエルプレート□ ↓ 洗 浄 3 回 (*2)洗 浄 液 除 去 後 、 直 ちに 次 の 試 薬 分 注□希 釈 検 体 ( 例 えば 緩 衝 液 45μl+ 検 体 5μl)または 標 準 溶 液 50μl 「ピペッティング」の 動 画 参 照□ ↓ 撹 拌 (*3)、 室 温 (20~25℃)、2 時 間 反 応 、 静 置 (*4)第 一 反 応 「 反 応 条 件 」の 動 画 参 照□□ビオチン 結 合 抗 IgE 抗 体 の 希 釈室 温 化 された 緩 衝 液 で、1,000 倍 に 希 釈 して 下 さい。↓ 洗 浄 3 回 (*2)希 釈 溶 液 の 調 製 は 第 一 反 応 中 に 行 う2 段 階 希 釈 をお 薦 めします洗 浄 液 除 去 後 、 直 ちに 次 の 試 薬 分 注□ ビオチン 結 合 抗 IgE 抗 体 50μl 「ピペッティング」の 動 画 参 照□ ↓ 撹 拌 (*3)、 室 温 (20~25℃)、2 時 間 反 応 、 静 置 (*4)第 二 反 応 「 反 応 条 件 」の 動 画 参 照□□ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 の 希 釈室 温 化 された 緩 衝 液 で、2,000 倍 に 希 釈 して 下 さい。↓ 洗 浄 3 回 (*2)希 釈 溶 液 の 調 製 は 第 二 反 応 中 に 行 う2 段 階 希 釈 をお 薦 めします洗 浄 液 除 去 後 、 直 ちに 次 の 試 薬 分 注□ ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 50μl 「ピペッティング」の 動 画 参 照□ ↓ 撹 拌 (*3)、 室 温 (20~25℃)、1 時 間 反 応 、 静 置 (*4)□ ↓ 洗 浄 3 回 (*2)□ 発 色 液 (TMB) TMB が 室 温 化 されていることを 確 認第 三 反 応 「 反 応 条 件 」の 動 画 参 照洗 浄 液 除 去 後 、 直 ちに 次 の 試 薬 分 注50μl 分 注 後 、 濃 度 により 青 色 に 変 色□ ↓ 撹 拌 (*3)、 室 温 (20~25℃)、20 分 間 反 応 、 静 置 (*4)□ 反 応 停 止 液 (1M H2SO4) 強 酸 性 につき 取 扱 注 意 50μl 分 注 後 、 濃 度 により 黄 褐 色 に 変 色□ ↓ 撹 拌 (*3)□ 吸 光 度 測 定 ( 主 波 長 450nm、 副 波 長 620nm:600~650nm)直 ちに 撹 拌副 波 長 はプレート 裏 面 の 汚 れ 等 をキャンセルします(*2) 洗 浄 液 をウエルに 分 注 後 、 手 のひらの 上 で 10 秒 ほど 軽 く 振 り 廃 棄 します。3 回 連 続 洗 浄 後 、ペーパータオル 上 にプレートを 逆 さにして 叩 き 洗 浄 液 を 完 全 に 除 去 します。 洗 浄 液 除 去 後 の 乾 燥 に 注 意して 次 の 溶 液 を 直 ちに 分 注 します。 洗 浄 液 をピペットで 添 加 する 際 の 液 量 目 安 は 300μl/ウエルです。 万 一 、 最 小 標 準 溶 液 濃 度 (1.0 ng/ml)の OD 値 よりブランク OD 値 が 高 くなる 場 合 は 解 決 方 法の 1 つとして、ペルオキシダーゼ・アビジン 結 合 物 と 反 応 後 の 洗 浄 回 数 3 回 を 同 じ 流 速 で 4~6 回に 増 やして 下 さい。プレート 洗 浄 機 ご 使 用 の 場 合 の 圧 力 目 安 は 5~25ml/ 分 (ノズルの 径 により 異なります)です。 第 一 反 応 後 の 初 回 の 洗 浄 のみウエル 間 のコンタミに 注 意 して 下 さい。「 洗 浄 操 作 」7

の 動 画 をご 参 照 下 さい。(*3) 撹 拌 の 目 安 は 600~1,200rpm-10 秒 間 、3 回 。「 撹 拌 操 作 」の 動 画 をご 参 照 下 さい。(*4) 撹 拌 終 了 後 プレートシールを 貼 って 静 置 して 下 さい。「 反 応 条 件 」の 動 画 をご 参 照 下 さい。プレートシールは 保 護 紙 を 剥 がして、 粘 着 面 をプレート 側 にして 貼 り 付 けて 下 さい。 一 度 使 用 したプレートシールは 再 使 用 しないで 下 さい。ワークシート1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH【 測 定 名 】【 所 属 】【 測 定 者 】 【 測 定 日 】【キットロット 番 号 】 【 有 効 期 限 】【 備 考 】【 製 品 名 】 ;レビス ® IgE-ELISA キット(マウス)【コード 番 号 】 ;AKRIE-010【 英 語 表 記 】 ;Mouse IgE ELISA KIT(AKRIE-010,Shibayagi,Gunma,Japan)【お 問 い 合 せ 先 】製 造 / 発 売 元 ; 株 式 会 社 シバヤギ〒377-0007 群 馬 県 渋 川 市 石 原 1062-1TEL.0279-25-0279 FAX.0279-23-0313syc-info@shibayagi.co.jphttp://www.shibayagi.co.jp8