CONFIGURACIÓN DE LOS SERES VIVOS GUIÓN DE PRÁCTICAS

Prácticas - Configuración de los Seres Vivos
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Universidad Miguel Hernández de Elche
Facultad de Ciencias.
Licenciatura en Ciencias Ambientales
CONFIGURACIÓN DE LOS SERES VIVOS
GUIÓN DE PRÁCTICAS
Curso 2005-2006
Alumno
Apellidos:
Nombre:
Grupo:
Ciencias Ambientales Curso 2005-2006

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Práctica 1. El microscopio óptico.
1. Objetivo
Aprender a usar correctamente el microscopio óptico compuesto, familiarizándose con
sus componentes y con diferentes métodos de medición, mediante el estudio cualitativo y
cuantitativo de distintas preparaciones microscópicas.
2. Introducción
Desde su invención, el microscopio ha sido una herramienta útil en el desarrollo
científico. Aunque las lentes de aumento han sido conocidas a lo largo de la historia, no fue
hasta la llegada del moderno microscopio compuesto (s. XVII-XVIII) cuando este instrumento
comenzó a ser aplicado al estudio biológico. Si para la mayoría de biólogos, el microscopio es
una herramienta de trabajo importante, para los biólogos celulares es indispensable.
El microscopio compuesto está formado por dos elementos; un sistema primario de
lentes de aumento y un segundo sistema de lentes, similar a un telescopio. La luz es forzada a
pasar a través de la muestra y es enfocada con los sistemas de lentes primarias y secundarias.
Si reemplazados la fuente de luz por una fuente de electrones, el microscopio se convierte en
un microscopio electrónico de transmisión. Si la luz es proyectada sobre la muestra y los
sistemas de lentes captan la luz rebotada por la muestra el microscopio se convierte en un
microscopio quirúrgico. Si son electrones los que son proyectados sobre la muestra, barriendo
su superficie hablamos de un microscopio electrónico de barrido.
La función de un microscopio es mejorar la resolución del ojo humano. El microscopio
se usa para ampliar una imagen de un objeto de forma que podamos observar detalles que
serían imposibles de observar a simple vista por el ojo humano. A causa de esta ampliación, la
resolución se confunde a menudo con la magnificación o aumento que se refiere al tamaño de
la imagen. En general, a mayor magnificación mayor resolución; aunque ésto no siempre es
cierto. Hay limitaciones de carácter práctico en el diseño de las lentes que pueden resultar en
un incremento de la magnificación sin incrementar la resolución.
Considerando la figura 1.1, si una imagen de una célula es aumentada desde 10x a
45x, la imagen es más grande; pero no necesariamente más nítida. La imagen de la izquierda
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está aumentada sin mejorar la resolución, mientras que la imagen de la derecha tiene los
mismos aumentos, pero la resolución ha mejorado. Cuando la imagen es aumentada 10 veces
(desde 10x a 100x) es imposible usar la imagen de la izquierda; sin embargo, la imagen de la
derecha nos da una información más detallada. Sin resolución la cantidad de detalles
observables es fija y, a pesar de incrementar el tamaño de la imagen, no se observan más
detalles. En este punto se alcanza el límite de resolución o poder de resolución del
objetivo. Esta propiedad de los objetivos viene fijada por su diseño y construcción. Para
cambiar la resolución, la única solución a menudo es usar objetivos diferentes.
La razón de la dicotomía entre magnificación y poder de resolución es la capacidad
del ojo humano para diferenciar entre dos objetos próximos. Es necesario que dos objetos
estén separados 0,1 mm, aproximadamente, cuando los mantenemos a 25 cm de los ojos para
poder detectarlos como objetos diferentes. Si están a menos de 0,1 mm los percibimos como
un único objeto. Si los dos objetos están separados 0,01 mm no podremos discriminarlos como
dos objetos; a menos que aumentemos su imagen por 10x, con lo que hemos alterado
eficazmente nuestra capacidad de resolución desde 0,1 mm a 0,01 mm o, inversamente,
nuestro poder de resolución a aumentado en un factor de 10.
Figura 1.1. Magnificación frente a resolución.
Sólo magnificación
Magnificación y resolución
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Así pues, una lente puede aumentar una imagen sin incrementar la resolución. Varios
artefactos pueden ser inherentes al diseño de las lentes, provocando que el objeto aparezca
con los límites desdibujados. Por lo que, incluso si aparecen separados 0,1 mm, los límites
están tan desdibujados que perdemos la capacidad de diferenciar ambos objetos. Al igual que
nos sucede al observar los optotipos oftalmológicos; podemos intuir las letras al incrementar el
tamaño pero somos incapaces de identificarlas correctamente.
Generalmente, se habla de la idoneidad de los objetivos microscópicos en términos de
su magnificación o aumentos; mientras que el valor más importante es su resolución.
Todos los microscopios poseen un objetivo que puede aumentar por 40x el tamaño normal de
una muestra; pero sólo un objetivo de buena calidad permite observar correctamente una
muestra.
Como se ha mencionado el valor de la resolución puede ser determinado de dos formas:
1. La distancia más pequeña entre dos puntos, que permite observarlos como
distintos. Con esta medida, conforme disminuye la distancia aumenta la resolución.
Hay una correlación inversa entre el límite de resolución (Fórmula de Abbe) y lo
que de hecho se resuelve:
Límite de resolución = (0,61·λ)/AN
2. Para cambiar esta fórmula a una correlación directa, se necesita sólo el reciproco del
límite de resolución. El poder de resolución es inversamente reciproca al límite
de resolución. Así, la resolución aumenta conforme aumenta la distancia.
Consecuentemente, en la mayoría de microscopios hoy en día usan la resolución, en
lugar del límite de resolución, para indicar la calidad de sus objetivos.
Poder de resolución = AN/(0,61·λ)
El poder de resolución de los objetivos es una característica de sus propiedades físicas y
de la longitud de onda de la luz que pasa a través de sus lentes. Las propiedades físicas se
resumen en un valor conocido como apertura numérica (AN), mientras que la longitud de
onda es determinada por el color de la luz utilizada.
Apertura numérica (AN) = n·sen θ
Figura 1.2. Apertura numérica e índice de refracción.
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La apertura numérica de una lente depende de dos parámetros. Del ángulo de
incidencia de la luz en la lente y del índice de refracción del material óptico de fabricación
de la lente. La mitad del ángulo del cono de luz incidente se designa por el símbolo θ. La mitad
del ángulo de incidencia de la luz se usa para calcular el ángulo de luz subtendida relativa al
eje óptico del microscopio. El ángulo de incidencia de la luz y, por tanto, θ pueden ser
modificado por el condensador situado debajo de la platina. Si el condensador es móvil, el
ángulo de incidencia puede variarse; así, conforme el condensador está más cerca del objeto
más grande es el ángulo de incidencia de la luz. Traduciéndose en una mejora de la resolución
del microscopio.
Figura 1.3. Apertura numérica y ángulo de incidencia de la luz.
Las propiedades refractivas de un objetivo se resumen en un valor conocido como
índice de refracción (IR ó n). El índice de refracción está en función de la distorsión de la
luz al pasar del aire a la lente y viceversa. En un microscopio, el material de fabricación de la
lente está especialmente formulado para incrementar su índice de refracción; sin embargo,
una vez fabricada esta propiedad no puede ser cambiada. Aunque el medio alrededor del
objetivo si puede ser modificado; sustituyendo el aire entre el objetivo y el portaobjetos por
aceite de inmersión, de índice de refracción superior al del aire.
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Considerando todo lo anterior, en la práctica la máxima resolución se puede optimizar
de tres formas:
a) El método más fácil es aumentar el ángulo de la luz incidente, alterando la posición
y/o diseño del condensador, situado debajo de la platina.
b) El índice de refracción puede ser mejorado mediante el uso de lentes especialmente
fabricadas y/o mediante el control del medio a través del cual pasa la luz, usando
aceite de inmersión en objetivos diseñados para este propósito.
c) Disminuir la longitud de onda de la luz usada. Por razones prácticas, la modificación
de la longitud de onda tiene mayor efecto sobre la resolución del microscopio que
cambios en el ángulo de incidencia de la luz (θ) o el índice de refracción (n).
En microscopía óptica de campo claro es conveniente trabajar en el rango de luz visible
y la longitud de onda más corta del espectro de luz visible es el azul. Por lo que, los
microscopios incorporan un filtro azul en su diseño; que se conoce como filtro de luz día,
generalmente.
Aberraciones
Las distorsiones o aberraciones cromáticas y esféricas son inherentes al diseño de las
lentes; debido a que las lentes son esféricas y proyectan una imagen esférica. Sin embargo, la
teoría óptica se basa en imágenes planas. Además, las diferentes longitudes de onda de luz
son refractadas distintamente; la imagen esférica se distorsiona incluso en múltiples imágenes,
debido a que cada longitud de onda forma una imagen separada.
Una lente que está corregida para producir campos planos en vez de curvos se conoce
como lente “plan” (plana), mientras que una lente corregida para campo plano y aberración
cromática se denomina lente “plan achromat” (plana acromática). Si la lente está corregida
para aberraciones cromáticas para el rojo y azul, mientras que la corrección esférica es sólo
para el verde, es una lente “achromat” (acromática).
Angulo de incidencia
Aunque el ángulo θ puede ser alterado, existe un límite teórico (180º) a este ángulo
para el paso de luz a la lente. Para cada objetivo hay una posición idónea del condensador en
la que se presenta la luz al objetivo con un ángulo apropiado, permitiendo un máximo de
intensidad de luz; mientras mantiene θ tan grande como sea posible. En los microscopios
buenos se puede ver el diafragma del condensador en el campo de luz y permiten un ajuste
preciso (vertical y horizontal) del condensador a su posición ideal. El diafragma de iris se usa
para corregir las aberraciones esféricas de las lentes y debe ser ajustado para cada objetivo.
No deben ser usados para controlar la intensidad de luz a menos que la resolución no sea
importante para el observador.
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Alineación
Un uso correcto de un microscopio requiere que la óptica y la fuente de luz estén
correctamente alineadas en el eje óptico. Todas las correcciones de aberraciones dependen de
una adecuada alineación del microscopio. Generalmente, se usan dos técnicas para alinear el
microscopio:
a) La primera se conoce como iluminación crítica. En
este proceso una imagen de la fuente de luz
(filamento de la lámpara) es proyectada en el plano
del objeto, superponiéndose la imagen de la fuente
de luz en el objeto. Sin embargo, tiene la desventaja
de que exige el uso de una fuente de luz uniforme
plana; lo que realmente no es posible con el
filamento de una lámpara de tungsteno.
b) El segundo procedimiento de alineación es conocido
como iluminación Koehler y es el más común. En
este procedimiento, una imagen del diafragma de
campo se proyecta en el plano del objeto. Este
procedimiento requiere un condensador de campo
equipado con un diafragma de iris móvil (o
centrable).
Figura 1.4. Iluminación Koehler (August Koehler, 1893).
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Ejercicio 1. El microscopio óptico de campo claro.
1. Introducción
El microscopio óptico compuesto es un instrumento que permite observar objetos no
visibles a simple vista mediante un sistema óptico de lentes, que al ser atravesadas por la
imagen de un objeto la amplifican.
- Partes del microscopio
En un microscopio óptico se distinguen una parte mecánica y otra óptica:
a) La parte mecánica consta de las siguientes piezas:
• Pie de soporte o estativo: alberga la fuente de iluminación.
• Brazo: continuación del pie donde están insertadas el resto de piezas.
• Tubo: cilindro hueco por donde circulan los rayos luminosos. En la parte inferior
tiene un revolver con los sistemas de lentes, llamados objetivos, y en la superior
porta la lente llamada ocular.
• Platina: superficie horizontal para colocar la preparación microscópica. Esta se
sujeta mediante una pinza, y puede moverse sobre la platina mediante un carro
accionado por tornillos, en un plano inferior. Cualquier punto de la preparación
puede ser fijado por el observador, tomando sus coordenadas con los nonios que
porta el carro. La platina puede desplazarse en sentido vertical gracias a dos pares
de tornillos situados a derecha e izquierda sobre el brazo: los tornillos
macrométricos, que provocan desplazamientos rápidos, y los micrométricos, que
mueven la platina muy lentamente. Mediante el desplazamiento de la platina se
consigue el enfoque de la preparación.
b) La parte óptica del microscopio óptico se compone de:
• Ocular: sistema de lentes convergentes situado en la parte superior del tubo.
• Objetivos: son tubos que albergan sistemas de lentes convergentes que
proporcionan aumentos hasta 100x. Los objetivos están montados sobre una pieza
base, llamada revolver, que permite intercambiarlos sobre la preparación. Cada
objetivo lleva impresas sus características ópticas (aumentos, apertura numérica,
etc.).
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• Condensador: es un sistema de lentes convergentes situado inmediatamente por
debajo de la platina (en nuestro caso, es fijo y se desplaza junto con la platina). Su
función es concentrar los rayos luminosos sobre la preparación.
• Diafragma: palanca montada en la misma pieza del condensador, que regula la
entrada de luz a éste y a la preparación. Al igual que en las cámaras fotográficas, un
diafragma abierto proporciona más luz, pero menor profundidad de campo (nitidez
del enfoque a diferentes niveles horizontales de la preparación).
• Fuente luminosa: es una lámpara de tungsteno, montada en el interior del pie.
Figura 1.1.1. Componentes del microscopio óptico.
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- Principios de magnificación
El principio de magnificación de un microscopio consiste en dos sistemas de lentes
convexas que se combinan apropiadamente para magnificar las muestras.
Junto a la muestra AB, un sistema de lentes convexas (Lo), llamado objetivo, se usa
para magnificar de 1 a 100 veces y crear una imagen real A’B’. Junto al ojo un sistema de
lentes llamado ocular es usado para magnificar de 5 a 20 veces y crear una imagen virtual
A’’B’’ a una distancia de visión nítida (aproximadamente a 250 mm del ojo). Es esta imagen
aumentada A’’B’’ la que vemos durante la observación microscópica (Figura 1.1.2).
Figura 1.1.2. Esquema óptico del microscopio.
- Características ópticas del microscopio
• Aumento total (M): Es el producto de los aumentos del objetivo por los del ocular. Puede
obtenerse un rango de aumentos variable. Se calcula como:
M = M objetivo x M ocular (x M i )
Donde:
M objetivo = aumento del objetivo.
M ocular = aumento de los oculares (indicado en los oculares).
M i = aumentos intermedios si corresponden (por defectos es 1)
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• Apertura numérica (AN): Determina la eficiencia del condensador y el objetivo. Cuanto
mayor es la AN, las imágenes resultan de mayor calidad. Se calcula como:
Apertura numérica (AN) = n·sen θ
Donde:
n = índice de refracción del medio entre el objetivo y la preparación.
θ = la mitad del ángulo máximo con el que penetra en el objetivo el cono de luz,
desde un punto enfocado en el eje óptico.
• Límite de resolución: Es la distancia mínima real que tiene que haber entre dos puntos
para que el microscopio pueda mostrar dichos puntos como distintos y separados. Se
calcula mediante la fórmula de Abbe:
Límite de resolución = (0,61·λ)/AN
Donde:
λ = longitud de onda de la luz incidente (400 nm para la luz azul).
AN = apertura numérica.
El poder de resolución del ojo humano es aproximadamente 70 µm.
• Distancia de trabajo: es el espacio entre el objetivo y la cara superior de la preparación,
cuando la imagen está enfocada. Cuando mayor es el aumento del objetivo menor es la
distancia de trabajo.
• Profundidad de campo: es el espesor de muestra de la preparación microscópica que
aparece nítido por encima y por debajo del plano de enfoque. Cuanto mayor es la AN del
objetivo (ó mayor es su aumento) menor es la profundidad de campo.
2. Material
• Microscopio binocular.
• Portaobjetos con preparaciones microscópicas.
3. Procedimiento

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1. Comprobar la magnificación y la apertura numérica de los objetivos que están en el
revolver del microscopio y la magnificación de las lentes oculares. Estos valores están
impresos en cada uno de los objetivos (Figura 1.1.3) y de los oculares. En la tabla 1.1.1
anotar los valores de magnificación para cada objetivo y ocular y la AN para cada objetivo
y el condensador. Calcular la magnificación total y el límite de resolución para cada
objetivo y el límite de resolución máximo del microscopio usando aceite de inmersión (AN
= 1,5). Asumir que la luz que atraviesa la muestra tiene una longitud de onda de 400 nm.
Figura 1.1.3. Características de los objetivos.
Tabla 1.1.1.
Magnificación Apertura Numérica Aumento Total Límite de Resolución
Magnificación de los oculares:
Apertura numérica del condensador:
Indica el objetivo de mayor AN:
A.N. para una interfase de aire: 1,0
A.N para una interfase de aceite 1,5
Límite de resolución máximo del microscopio:
(0,61xλ)/AN
(µm)

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2. Girar el revolver porta objetivos hasta que el objetivo de menor aumento esté en posición
de observación. Coger una preparación microscópica, colocarla en la platina asegurándose
que queda correctamente fijada, y con el cubreobjetos hacia arriba. Encender el
microscopio ajustar la intensidad de luz con el potenciómetro a un nivel confortable para el
observador. Nunca controlar la intensidad de luz con el condensador, asegurarse que el
condensador esté abierto y en posición correcta.
3. Ajustar los oculares a la posición neutra de dioptrías (“0”). Ajustar los oculares a la
distancia interpupilar y dioptrías del observador. La mayoría de microscopios están
equipados con un tirador entre los oculares para su ajuste y sólo se requiere empujar o
tirar directamente de los oculares juntos o individualmente. Mover los oculares (derecha e
izquierda) hasta ver un campo de visión uniforme.
4. Enfocar el microscopio sobre cualquier objeto dentro del campo de visión:
• Localizar un punto suficientemente contrastable en el centro del campo de visión y
cerrar el ojo izquierdo. Usando los tornillos macro- y micrométrico enfocar hasta
obtener una imagen nítida con el ojo derecho solamente.
• Ahora cerrar el ojo derecho y ajustar el foco del ocular izquierdo girando el dioptrio
situado en él. No reajustar el foco del ojo izquierdo con los enfoques macrométrico y
micrométrico, usar el anillo de ajuste del ocular.
5. Seguidamente todos los usos del microscopio sólo requerirán los ajustes de enfoque
macrométrico y micrométrico. Por supuesto, será necesario y se deberá comprobar y
reajustar el microscopio al inicio de cada sesión.
6. Comenzar siempre enfocando la preparación por el objetivo de menor aumento (4x).
Incluso si se va a usar el objetivo de mayor aumento (40x ó 100x). Es más eficaz
comenzar con el objetivo de menor aumento e ir aumentando gradualmente la
magnificación del objetivo, afinando el enfoque de la muestra con cada uno de ellos. Si los
objetivos son parafocales, una preparación microscópica enfocada con un objetivo también
estará, prácticamente, enfocada con el resto de objetivos y sólo se tendrá que corregir
levemente el enfoque micrométrico.
7. Manipular el control macrométrico de enfoque hasta ver la preparación enfocada. Mover los
tornillos de desplazamiento horizontal (XY) de la platina, hasta situar la preparación en la
región de estudio deseada. Entonces, centrar la preparación y enfocar cuidadosamente,
usando los tornillos de enfoque macrométrico y micrométrico, partiendo del objetivo de
menor aumento hasta el de mayor aumento, realizando el estudio de la muestra con cada

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una de las magnificaciones. Usar el micrométrico para el ajuste fino y enfocar al máximo la
imagen.
8. Durante el uso del microscopio, una mano debe de permanecer sobre el micrométrico
reajustando el enfoque constantemente y la otra mano se usa para dirigir los movimientos
de la platina.
9. Dibujar las imágenes que se observan con diferentes aumentos del microscopio, para cada
preparación microscópica.

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Práctica 2. Microanálisis estereológico: Estudio de suspensiones
celulares
Habitualmente los tejidos de organismos se pueden disociar en sus componentes
celulares, a partir de los cuales pueden purificarse diferentes tipos celulares individuales, los
cuales pueden utilizarse para su análisis bioquímico o para establecer cultivos celulares.
Frecuentemente, es necesario conocer el número exacto de células en suspensión que hay en
un medio biológico, para lo que se emplean técnicas de recuento celular.
Ejercicio 1. Preparación de extensiones celulares y recuento celular
1. Introducción
Se entiende por extensión o frotis celular, a la formación de una fina película de células
sobre un portaobjetos, de tal manera que las células no se superpongan entre sí. Se utilizan
para la visualización de células en suspensión (p. ej., células sanguíneas, células en
suspensión, etc.), para lo cual tras la extensión de la muestra procederemos a su tinción;
entendiendo por tal, la coloración diferencial de las distintas células presentes en la suspensión
celular. Un diagnóstico válido no puede ser establecido más que sobre frotis perfectamente
extendidos y teñidos.
Las preparaciones de extensiones celulares se utilizan fundamentalmente para el
estudio morfológico de las células y la obtención de fórmulas de recuento celular.
2. Fundamento
El uso de suspensiones celulares de sangre entera permite observar de forma rápida,
fácil, económica y nítida diferentes tipos celulares con características morfológicas peculiares y
con una notable heterogeneidad nuclear y citoplásmica. Estos tipos celulares se ponen
fácilmente de manifiesto con técnicas histológicas de microscopía óptica, que por su
metodología y sistemática suponen un entrenamiento ideal para el estudio de suspensiones

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celulares de cualquier tipo; ya que raramente se trabaja con suspensiones celulares con una
diversidad celular tan elevada.
Para teñir las extensiones de sangre se emplean compuestos derivados de anilina, por
los que tienen una gran afinidad los distintos orgánulos de las células sanguíneas. Según la
naturaleza química de estos colorantes, distinguimos tres tipos: ácidos, básicos y neutros.
Los colorantes ácidos tiñen estructuras celulares básicas, tales como la hemoglobina,
los gránulos de los eosinófilos, etc.; los elementos celulares que se tiñen se denominan
acidófilos o eosinófilos (un colorante ácido típico es la eosina). Los colorantes básicos por el
contrario, tiñen estructuras celulares ácidas, tales como el ADN nuclear y el ARN;
denominándose las estructuras asi teñidas basófilas (entre los más utilizados está el azul de
metileno).
Finalmente, los colorantes neutros son los más utilizados en hematología, están
formados por la combinación de un colorante ácido y otro básico y su afinidad tintorial es el
resultado de la combinación de los anteriores.
La sangre es un tejido que posee diversas células suspendidas en un medio fluido
denominado plasma. Las células sanguíneas son fundamentalmente de tres tipos: Células
rojas, eritrocitos o hematíes, células blancas o leucocitos y plaquetas o trombocitos. Que con
microscopía óptica muestran la siguiente apariencia:
• Eritrocitos: Esta célula anucleada (en la mayoría de mamíferos) se tiñen de color rosado
debido a su alto contenido en hemoglobina. La zona central pálida, escasamente teñida, es
el resultado de su forma de disco biconcavo, poco corriente. Es el componente celular
mayoritario de la sangre, 4-6 millones/ml.
• Neutrófilos: Son el tipo de leucocito más frecuente en sangre. El detalle más
característico es su núcleo multilobulado. En los neutrófilos maduros existen generalmente
5 lóbulos conectados por finas bandas de materia nuclear, pero en los neutrófilos
inmaduros el núcleo generalmente es poco lobulado. En los neutrófilos de las hembras, el
cromosoma X inactivo o cuerpo de Barr aparece formando un pequeño apéndice en forma
de palillo de tambor, condensado, en uno de los lóbulos del núcleo. Se ve en el 3% de los
neutrófilos de las hembras. El citoplasma de los neutrófilos está ligeramente punteado con
gránulos de color púrpura que se denominan gránulos azurófilos, que se corresponden con
lisosomas primarios grandes.

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• Eosinófilos: Son menos frecuentes que los neutrófilos. Los eosinófilos poseen, como dato
morfológico característico, un núcleo bilobulado y un citoplasma repleto de granos grandes,
eosinófilos (de color rosado oscuro) y de tamaño uniforme.
• Monocitos: Son los elementos mayores de todas las células de la serie blanca. Se
caracterizan porque poseen un gran núcleo, situado excéntricamente, que se tiñe menos
intensamente que los otros leucocitos. El núcleo generalmente es dentado haciéndose más
dentado a medida que la célula madura y adopta finalmente una morfología de herradura o
aspecto bilobulado. El amplio citoplasma está ocupado por pequeños lisosomas que con
microscopía óptica, le dan el típico aspecto de “vidrio mate”.
• Basófilos: Son los leucocitos menos frecuentes. En general el núcleo bilobulado está
eclipsado por numerosos gránulos grandes, intensamente basófilos (azul oscuro).
• Linfocitos: Son las células más pequeñas de la serie blanca, presentando un tamaño
ligeramente mayor que los hematíes. Se caracterizan porque tienen un núcleo redondeado,
muy teñido, y un pequeño anillo de citoplasma agranular, ligeramente basófilo. La cantidad
de citoplasma varía según el estado de actividad de la célula; así, se observan linfocitos
pequeños, medianos y grandes.
• Plaquetas: Son pequeñas células anucleadas (en el hombre), que se forman en la médula
ósea a partir de los megacariocitos, su número varía de 150.000-400.000/ml. Son discos
biconvexos redondos u ovales. En los frotis sanguíneos suelen aparecer agrupadas y el
citoplasma teñido de púrpura, tiene aspecto granular debido a la gran cantidad de
orgánulos que se disponen en el centro de la célula, el citoplasma periférico se tiñe muy
poco y por eso es apenas visible.
3. Material
• Microscopio.
• Suspensión celular de sangre entera con anticoagulante.
• Portaobjetos.
• Extensor o portaobjetos esmerilado.
• Cubreobjetos.
• Cubetas de tinción.
• Capilares.
• Metanol.
• Colorante de tinción.

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• Medio de montaje.
• Papel de filtro.
4. Procedimiento
Se distinguen tres etapas:
A. Preparación de los portaobjetos
Antes de su empleo, los portaobjetos deben ser tratados para eliminar posibles
impurezas de su proceso de fabricación y manipulación (desengrasado) aplicando el siguiente
tratamiento:
1. Lavar con agua y detergente.
2. Una vez aclarado con agua corriente, se depositará en un recipiente que contenga una
de las tres soluciones:
- Mezcla sulfocrómica.
- Etanol.
- Etanol-eter (1:1).
3. Se mantienen 10-15 minutos, tras lo cual, si hemos usado mezcla sulfocrómica los
aclararemos con agua destilada, mientras que con las otras simplemente dejaremos
evaporar el disolvente.
4. Finalmente, los secaremos con papel de filtro o en estufa.
B. Confección de las extensiones
1. Colocamos los portaobjetos sobre una superficie plana y con ayuda de un capilar
depositamos una gota de suspensión celular en un extremo (aproximadamente a 0,5
cm).
2. Con los dedos pulgar e índice de la mano izquierda, se sostiene los dos ángulos de la
parte izquierda del portaobjetos. Con la mano derecha, se coge el portaobjetos
esmerilado, colocamos el pulgar en uno de los bordes y el índice sobre el otro. Situar
este último portaobjetos esmerilado delante de la gota de sangre, de forma que ambos
portaobjetos formen un ángulo de 45º aproximadamente. El grosor de la preparación
depende del ángulo (a menor ángulo menor espesor, y viceversa). El portaobjetos
esmerilado nunca debe pasar por encima de la muestra al hacer la extensión.

Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 19
Figura 2.1. Esquema de la realización de un frotis sanguíneo por el método de los dos
portaobjetos. La flecha indica la dirección en la que debe deslizarse el portaobjetos
esmerilado.
Punto de colocación
de la muestra.
3. Se hace retroceder el portaobjetos esmerilado en dirección a la gota de la suspensión
celular. Tan pronto como ambos entren en contacto, la sangre comenzará a extenderse
sobre el borde del portaobjetos esmerilado.
4. Cuando la sangre, por capilaridad, llega hasta aproximadamente 2 mm de los bordes
del portaobjetos esmerilado, efectuar un movimiento suave y rápido de éste sobre toda
la longitud del portaobjetos horizontal.
5. Dejar el frotis secar a temperatura ambiente y en posición horizontal durante un
mínimo de 10 minutos.
6. Fijar las extensiones introduciendo el portaobjetos en alcohol metílico durante 5
minutos y dejar secar a temperatura ambiente.
7. Teñir durante 30 minutos con una solución de Giemsa al 10% en agua destilada
(preservar de la luz).
8. Lavar las extensiones celulares con abundante agua destilada.
9. Dejar secar a temperatura ambiente y montar con medio de montaje.
C. Examen de la extensión celular
Como es lógico el examen microscópico variará dependiendo de la muestra procesada.
Seguidamente, describiremos el examen de una extensión sanguínea, por ser un tipo de
muestra que con frecuencia se tiene que realizar y de gran aplicación en diferentes áreas

Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 20
científicas. Además, sirve de referencia para el estudio microscópico de otros tipos de
suspensiones celulares; por estar normalizada su realización y examen microscópico.
1. En primer lugar examinaremos la preparación mediante el objetivo de 4x ó 10x. Las
células deben estar homogéneamente distribuidas en el frotis, de lo contrario lo
desecharemos.
2. Seguidamente pasamos a examinar la muestra a 40x. Realizaremos un recorrido por la
preparación tal y como se indica en la figura 2.2 dentro de las zonas ideales de la
extensión; identificando correctamente los distintos tipos celulares que aparecen en la
preparación, con ayuda de la descripción morfológica (ver introducción). Estudiando con
detalle su morfología.
Figura 2.2. Esquema de un frotis sanguíneo de las diferentes áreas que lo componen y la
distribución celular de las mismas. La líneas punteada indica la dirección a seguir en el
recuento diferencial de leucocitos (n=100).
Origen
Zona de linfocitos
Zona de neutrófilos y
monocitos
Sentido de la extensión
Zona ideal de recuento
3. Una vez identificados los distintos tipos celulares proceder a realizar la fórmula leucocitaria
de la muestra. Esta fórmula consiste en un recuento diferencial de los leucocitos o células
de la serie blanca de la sangre. Para ello realizar un recuento de 100 leucocitos,
moviéndonos por la preparación, buscar en la región ideal del frotis (tal y como se indica
en la figura 2.2), identificar cada uno de los tipos y anotar su número. Para poder
determinar el porcentaje de cada tipo de leucocito en el total de la muestra. Indicando su
porcentaje en la tabla 2.1.
Suponiendo que la población total de leucocitos de la muestra analizada es de 9.170
leucocitos/ml. ¿Cuántas células/ml de cada unos de los tipos de leucocitos hay en la muestra?.
Indicar los resultados en la tabla 2.1.

Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 21
4. Responder a las siguientes preguntas:
a. ¿Qué función tiene el baño previo de metanol a la tinción con Giemsa en las
extensiones de sangre?
b. ¿Las estructuras basófilas son de naturaleza ácida o básica?
c. ¿Qué función tiene el mantener los portaobjetos en un baño de etanol-éter antes de
usarlos para realizar extensiones celulares?
d. ¿Qué es el cuerpo o corpúsculo de Barr?
e. ¿A que orgánulo corresponde la ligera granulación púrpura citoplásmica de los
neutrófilos?
f. Ordena de menor a mayor espesor los siguientes frotis según el ángulo de inclinación
aplicado al portaobjetos esmerilado con el que se hizo la extensión: a) 45º; b) 30º; c)
55º; d) 35º; e) 60º.
g. En la raza humana en estado de salud normal los eritrocitos son anucleados. ¿Existen
especies con eritrocitos nucleados, en caso afirmativo enunciarlas?. ¿Si existen, que
significados funcional y/o evolutivo puede tener la presencia de núcleo en los
eritrocitos?

Prácticas - Configuración de los Seres Vivos 22
Tabla 2.1. Esquema de los distintos tipos celulares característicos de sangre humana.
Tipos celulares
Tamaño
(µm)
Recuento
leucocitario
Célula
s/ml
Plaquetas
2-3
Monocitos
14-17
Linfocitos
7-8
Basófilos
9-10
Eosinófilos
10-12
Neutrófilos
10-12
Eritrocitos
6-8