PRODUKSI ENZIM MANANASE

LAPORAN PRAKTIKUM
FISIOLOGI MOLEKULAR
PRODUKSI ENZIM MANANASE
KHAIRUL ANAM
P051090031/BTK
BIOTEKNOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2009

PRODUKSI ENZIM MANANASE
Pendahuluan
Indonesia mempunyai biodiversitas mikroorganisme yang mempunyai nilai potential dalam
mengembangkan ilmu pengetahuan maupun nilai komersial. Kemajuan ilmu bioteknologi sekarang ini
memacu kreativitas para peneliti untuk memanfaatkan keanekaragaman mikroorganisme dalam berbagai
bidang, seperti industri pangan, peternakan, bioenergi, lingkungan dan kesehatan. Pemanfaatan mikroba
meliputi produk hasil metabolisme ataupun bioenzim.
Hasil industri perkebunan, pertanian dan hutan di Indonesia mengakibatkan meimpahnya limbah
biomassa hasil pengolahan dari industri‐industri tersebut. Seperti limbah dari produksi minyak kelapa
kopra. Kelapa kopra adalah bahan baku dalam pembuatan minyak goreng dan santan. Sehingga, pada
dasarnya Industri kelapa kopra di Indonesia masih terfokus kepada produksi santan. Oleh karena itu,
limbah hasil produksi minyak goreng dan santan kelapa sangat meruah dan masih sedikit industri yang
bisa mengolah dan memanfaatkan limbah produksi ini. Salah satu limbah dari industri ini adalah serbuk
bungkil kelapa.
Bungkil adalah inti dari buah kelapa. Selama ini pemanfaatan limbah bungkil kelapa, terutama
diperuntukkan sebagai pakan ternak. Tapi hampir sebagian pustaka mengindikasikan bahwa bungkil
kelapa berkualitas rendah karena kandungan serat kasarnya yang tinggi, rendah kandungan asam amino
esensial (lysin, methionin, tryptophan). Karena itu rekomendasi awal tentang penggunaan bungkil
kelapa pada pakan ternak hanya berkisar 10‐25%. Diprediksi setiap tahun ada sekitar 1 juta ton lebih
limbah ini. Sebagai catatan, sekitar 20 ~ 40% komposisi serat dari bungkil inti ini adalah beta‐mannan.
Sehingga dilakukanlah penelitian yang difokuskan pada pemanfaatan biomasa polisakarida
mannan dan mikroba yang dapat menghasilkan enzim mannanase yang berfungsi sebagai pemecah
polimer heteromannan sehingga memproduksi mannosa, oligosakarida dan sakarida lainnya. Enzim
mananase dapat dimanfaatkan oleh industri pulp dan kertas untuk proses pemutihan sehingga
mengurangi pemakaian bahan kimiawi (http://web.ipb.ac.id, 2009).
Mikroba mempunyai peranan penting dalam proses fermentasi yaitu sebagai agen pengubah atau
agen pendegradasi substrat dengan memproduksi enzim. Enzim yang diproduksi mencapai hasil
maksimal pada waktu dan kondisi fermentasi tertentu. Oleh karena itu, pada percobaan kali ini
dilakukan fermentasi selama 5 hari untuk mengetahui hari ke berapa diperoleh hasil optimum dalam
menghasilkan enzim mananase.

Bahan dan Metode
Isolat bakteri yang digunakan adalah bakteri koleksi dari Laboratorium Fisologi Molekular Bioteknologi,
Pasca sarjana IPB dengan kode koleksi A2.
Peremajaan kultur bakteri dilakukan pada media padat di cawan petri yang berisi media BSM (Basal Salt
Medium) yang mengandung LBG (Locust Bean Gum) sebagai substrat sebanyak 0,5% dan agar sebanyak
1,8%. Adapun BSM terdiri dari mineral KNO 3 0,2%; K 2 HPO 4 0,1%; MgSO 4 0,05%; NaCl 0,05%; FeSO 4
0,001%; CaCO 3 0,3% dan. Kultur mikroba diinkubasi pada suhu kamar selama 7 hari.
Fermentasi dilakukan dengan mengambil beberapa cockborer kultur mikroorganisme pada media padat.
Kultur tersebut diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair BSM yang
mengandung serbuk ampas bungkil kelapa 0,5% sebagai substrat, diinkubasikan pada suhu kamar
selama 5 hari dengan penggoyangan dengan kecepatan 150 rpm.
Ekstrak enzim kasar diperoleh dengan mengambil 4 ml larutan dari kultur bakteri yang difermentasi tiap
hari hingga hari ke 5. Untuk memisahkan ekstrak enzim kasar dan biomassa mikroba dilakukan
sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit dengan suhu 4°C.
Larutan standar mannosa dibuat dengan melarutkan 1 gram manosa dalam 10 ml H 2 O steril. Larutan
tersebut kemudian diencerkan sehingga diperoleh stok standar dengan konsentrasi 1 ug/ml. Dari larutan
stok tersebut dilakukan seri pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar mannosa 0
ppm, 0,1 ppm; 0,2 ppm; 0,3 ppm; 0,4 ppm; 0,5 ppm; 0,6 ppm; 0,7 ppm dan 0,8 ppm. 1 ml larutan stok
standar manosa ditambah dengan 1 ml DNS, kemudian campuran larutan tersebut di inkubasi pada
water bath dengan suhu 100°C selama 15 menit. Larutan didinginkan lalu diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 540 nm. Dengan regresi linear, akan didapatkan persamaan matematik untuk
standar manosa, yang akan digunakan pada pengukuran kadar enzim.
Pengukuran aktivitas enzim. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara 0,5 ml ekstrak enzim kasar
ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,5 ml substrat bungkil kelapa lalu divortex. Kemudian
di inkubasi pada water bath dengan suhu 90°C selama 1 jam. Setelah di inkubasi, larutan ditambahkan 1
ml DNS lalu di vortex kemudian dipanaskan dengan water bath pada suhu 100°C selama 15 menit.
Larutan didinginkan lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Pengukuran kontrol
dilakukan dengan menambahkan 0,5 ml substrat bungkil kelapa dan 1 ml larutan DNS barulah kemudian
ditambahkan 0,5 ml ekstrak enzim kasar lalu divortex dan kemudian dipanaskan pada suhu 100°C
selama 15 menit. Larutan didinginkan lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

Pengukuran blanko dilakukan dengan penambahan 0,5 ml substrat ekstrak enzim kasar pada 1 ml DNS
dan 0,5 ml H2O steril. Campuran larutan di vortex, kemudian dipanaskan dengan water bath pada suhu
100°C selama 15 menit. Larutan didinginkan lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
Dengan persamaan matematik dari kurva standar manosa, akan didapatkan kadar enzim yang
terkandung dalam masing‐masing larutan.
Larutan standar protein dibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian
dilarutkan dengan 10 ml H 2 O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm.
Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok
ditambahkan 4,5 ml H 2 O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok tersebut
dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0 ppm, 20 ppm, 40ppm, 60
ppm, 80 ppm, 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan
menambahkan 0.4 ml seri larutan standar dengan 4 ml reagen Bradford (0,05 g CBB (Comasie Briliant
Blue) – G 250 dilarutkan pada 25 ml etanol 95% lalu ditambahkan 50 ml asam fosfat 85%, kemudian
diencerkan dengan H 2 O hingga mencapai volume 500 ml. larutan stok perlu diencerkan dengan H 2 O
sebanyak 5x volume larutan stok. Larutan ini memberikan warna biru yang terdeteksi pada panjang
gelombang 595 m) yang kemudian divortex lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.
Absorbansi larutan standar dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi
linear, akan didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai
absorbansi standar, yang akan digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut.
Pengukuran protein terlarut. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara menambahkan 0,4 ml ekstrak
enzim kasar dengan 4 ml reagen Bradford divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.
Absorbansi Larutan sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Pengukuran kontrol
dilakukan dengan menambahkan 0,4 ml H 2 O steril dengan 4 ml reagen Bradford divortex dan diinkubasi
pada suhu ruang selama 15 menit. Absorbansi Larutan standar protein dibaca pada panjang gelombang
595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva standar protein, akan didapatkan kadar protein
terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim kasar.

Hasil dan Pembahasan
Hasil
Pada pemeriksaan aktivitas enzim dilakukan pengukuran kadar manosa untuk pembuatan kurva
standar dengan menggunakan locust bean gum sebagai substrat. Dari pengukuran secara
spektrofotometri diperoleh data sebagai berikut.
Tabel 1. nilai absorbansi standar manosa
Ppm Absorbansi absorbansi 0
0.0 0.114 0.000
0.1 0.260 0.146
0.2 0.520 0.406
0.3 0.814 0.700
0.4 1.049 0.935
0.5 1.391 1.277
0.6 1.580 1.466
0.7 1.886 1.772
0.8 2.154 2.040 Gambar 1. Kurva standar manosa
Dari gambar 1. Diperoleh persamaan matematis x = (y + 0.077)/2.622 dimana x adalah
konsentrasi manosa dan y merupakan nilai absorbansi dari manosa pada panjang gelombang 595 nm.
Dari persamaan ini, maka diperoleh data sebagai berikut.
Tabel 2. Nilai absorbansi dari sampel, kontrol dan blanko serta nilai unit aktivitas enzim dari ekstrak
enzim kasar mananase pada substrat bungkil kelapa
Hari ke s K B s‐b k‐b Xs Xk U
1 0.712 0.635 0.327 0.385 0.308 0.176 0.147 0.003
2 0.515 0.254 0.366 0.149 ‐0.113 0.086 ‐0.014 0.009
3 0.464 0.362 0.229 0.235 0.133 0.119 0.080 0.007
4 0.206 0.638 0.127 0.079 0.511 0.059 0.224 0
5 0.434 0.632 0.266 0.168 0.366 0.093 0.169 0
Dimana s adalah nilai absorbansi dari sampel, k adalah kontrol, b adalah blanko, s‐b adalah nilai
absorbansi sampel dikurangi blanko, k‐b adalah nilai absorbansi kontrol dikurangi blanko sedangkan Xs
dan Xk dan Xb adalah nilai dari konsentrasi manosa yang diperoleh dengan memasukkan bilai s‐b dan k‐
b ke dalam persamaan x = (y + 0.077)/2.622, sedangkan U adalah unit aktivitas enzim dimana nilainya

diperoleh dengan mengubahnya menjadi satuan umol/menit dengan BM manosa 180 dan waktu
inkubasi adalah 60 menit.
Selain itu diukur pula konsentrasi protein terlarut pada ekstrak enzim kasar dengan
menggunakan larutan bovine serum albumin sebagai standar untuk pengukuran protein terlarut. Data
yang diperoleh adalah sebagai berikut.
Tabel 3. Nilai absorbansi standar BSA
ppm BSA abs 1 abs 2 abs rata‐rata abs 0
0 0.240 0.262 0.2510 0.0000
20 0.297 0.333 0.3150 0.0640
40 0.390 0.359 0.3745 0.1235
60 0.409 0.381 0.3950 0.1440
80 0.434 0.477 0.4555 0.2045
100 0.477 0.516 0.4965 0.2455
Dari nilai absorbansi standar BSA, maka diperoleh kurva standar BSA dengan persamaan regresi y =
0.002x + 0.011.
Gambar 2. Kurva standar BSA untuk pengukuran protein terlarut
Dari persamaan regresi, maka diperoleh konsentrasi protein terlarut pada ekstrak enzim kasar
adalah sebagai berikut.

Tabel 4. Nilai absorbansi dan konsentrasi protein terlarut dalam ekstrak enzim kasar bungkil kelapa
sampel abs kontrol abs ‐ kontrol Ppm mg/ml
h1 0.512 0.240 0.272 130.5 0.1305
h2 0.397 0.170 0.227 108.0 0.1080
h3 0.380 0.118 0.262 125.5 0.1255
h4 0.690 0.178 0.512 250.5 0.2505
h5 0.641 0.183 0.458 223.5 0.2235
Dari pengukuran nilai aktivitas enzim dan protein terlarut, maka diperoleh niali aktivitas enzim
spesifik, adalah sebagai berikut.
Tabel 5. Aktivitas enzim, protein terlarut dan aktivitas spesifik enzim mananase mikroba A2 pada
substrat bungkil kelapa
Hari ke‐
Aktivitas mananase
(U/ml)
Konsentrasi protein
(mg/ml)
Aktivitas spesifik
(U/mg)
1 0.003 0.1305 0.0207
2 0.009 0.1080 0.0853
3 0.007 0.1255 0.0574
4 0 0.2505 0
5 0 0.2235 0
Pembahasan
Aktifitas suatu enzim dapat diukur dengan mengukur kecepatan perubahan substrat menjadi
produk. Aktifitas enzim dinyatakan dalam satuan unit aktifitas dan aktifitas spesifik. Satu unit aktifitas
enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu mikromol produk per menit
pada keadaan kondisi tertentu, seperti pada pH tertentu dan suhu tertentu. Sedangkan aktifitas spesifik
adalah jumlah unit enzim per milligram protein.
Bungkil kelapa dapat digunakan sebagai substrat untuk memproduksi enzim mananase karena
bungkil kelapa banyak mengandung karbohidrat (60%) yang terdiri dari galaktomanna (61%), manna
(26%) (Purwadaria, 1994). Galaktomanan dan manna yang ada pada karbohidrat akan di pecah oleh
enzim mananase melalui komplek endo‐B‐D‐mananse, ekso‐B‐D‐mananase, a‐D‐galaktosidase dan b‐Dmanosidase.

Dari percobaan, enzim mananase diperoleh dengan cara fermentasi dengan menggunakan isolat
bakteri dengan nomor koleksi A2. Enzim yang diperoleh yaitu enzim mananase merupakan enzim yang
termasuk bersifat dapat diinduksi, karena bakteri yang menghasilkan enzim terlebih dahulu di induksi
dengan adanya media yang kaya akan sumber heteromannan sehingga bakteri tersebut mengeluarkan
enzim mananase.
Pada percobaan ini enzim diperoleh dengan mensentrifugasi larutan media dari pengambilan
sampel yang dilakukan tiap hari selama 5 hari dan disebut ekstrak enzim kasar karena enzim masih
belum dimurnikan dan masih bercampur dengan pengotor‐pengotor lainnya. Dari ekstrak enzim kasar
ini diukur aktivitas enzim mananase terhadap subtrat bungkil kelapa dan juga protein terlarut.
Gambar 3. Aktivitas enzim mananase dari ekstrak enzim kasar bungkil kelapa
Dari tabel 2, diperoleh data aktivitas enzim mananase tiap hari selama 5 hari. Dari data tersebut
kemudian diterjemahkan dalam grafik aktivitas enzim seperti yang terlihat pada gambar 3. Dari gambar
tersebut dapat diketahui bahwa aktivitas tertinggi diperoleh pada hari ke 2 fermentasi yaitu sebesar
0,009 unit/ml. 0,009 unit/ml dapat diartikan bahwa 1 ml ekstrak enzim kasar dapat mendegradasi
senyawa heteromanan menjadi manosa sebesar 0,009 umol permenit pada kondisi suhu 90°C.
Kadar protein terlarut pada ekstrak enzim kasar tertinggi ada pada hari ke 5 dan terendah ada
pada hari ke 2. Sehingga apabila unit aktivitas enzim di bagi dengan kadar protein terlarut pada masingmasing
hari, maka diperoleh grafik seperti pada gambar 4.

Gambar 4. Aktivitas spesifik dari ekstrak enzim kasar bungkil kelapa
Dari gambar 4, dapat diperoleh informasi bahwa pada hari ke 2, aktivitas spesifik dari ekstrak
enzim kasar dari bungkil kelapa memiliki nilai spesifik tertinggi dibanding dengan hari‐hari lainnya.
Artinya pada hari ke 2, tiap 1 mg protein yang telarut di dalam ekstrak enzim kasar memiliki aktivitas
sebesar 0,0853 unit. Sehingga apabila protein dalam ekstrak enzim kasar dipekatkan atau diendapkan
akan diperoleh aktivitas tertinggi tiap mg nya yaitu pada fermentasi hari ke 2.
Kesimpulan
Dari data yang diperoleh, dapat diambil kesimpulan bahwa
1. Hari ke 2 fermentasi isolat A2 merupakan hari dimana diperoleh produksi enzim mananase
tertinggi dengan menggunakan substrat bungkil kelapa 0,5%
2. Aktivitas enzim mananase pada hari ke 2 diperoleh nilai sebesar 0,009 U/ml ekstrak enzim kasar.
3. Aktivitas spesifik ekstrak enzim kasar pada hari ke 2 diperoleh nilai sebesar 0,0853 U/mg protein
terlarut.

DAFTAR PUSTAKA
1. http://web.ipb.ac.id/~lppm/ID/index.php?view=penelitian/hasilcari&status=buka&id_haslit=PD/
015.04/MER/k. diunduh pada tanggal 17 November 2009
2. Yopi, Purnawan, A., Thontowi, A., Hermansyah, H., Wijanarko, A. 2006. Preparasi Mannan Dan
Mannanase Kasar Dari Bungkil Kelapa Sawit. JURNAL TEKNOLOGI, Edisi No.4 Tahun XX,
Desember 2006, 312‐319
3. T. Purawadaria, T. Haryati dan J. Darma (1994). Isolasi dan seleksi kapang mesofilik penghasil
mananase. Majalah Jornal dan Peternakan, Maret :26 ‐29.