Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước

https://twitter.com/daykemquynhon 

plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

http://daykemquynhon.blogspot.com 

BỘ Y TẾ 

http://daykemquynhon.ucoz.com 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / 

Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

NGUYỄN THỊ DUNG 

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 

IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG 

THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG 

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM 

HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO) 

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/ 

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

HÀ NỘI - 2018 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial








BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

NGUYỄN THỊ DUNG 

1301056 

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 

IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG 

THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG 

TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

Người hướng dẫn: 

ThS. Vũ Ngân Bình 

Nơi thực hiện: 

Bộ môn Hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> - Độc chất 






HÀ NỘI - 2018 











LỜI CẢM ƠN 

Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia 

đình <strong>và</strong> bạn bè. Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ 

lòng biết ơn sâu sắc <strong>và</strong> chân thành nhất đến họ. 

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Ngân Bình - Bộ môn Hóa 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>và</strong> Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ 

bảo <strong>và</strong> động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng 

kính trọng <strong>và</strong> biết ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà <strong>và</strong> PGS.TS Vũ Đặng Hoàng 

đã tận tình hướng dẫn, chỉ ra hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài. 

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên ở 

Bộ môn Hóa <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> - Độc chất <strong>và</strong> Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã tạo điều kiện cho tôi 

thực hiện khóa luận. 

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo <strong>và</strong> các cán 

bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo <strong>và</strong> trang bị cho 

tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt năm năm học qua. 

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên 

tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập <strong>và</strong> nghiên cứu tại trường. 

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 

Sinh viên 

Nguyễn Thị Dung 
















MỤC LỤC 

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 

DANH MỤC CÁC BẢNG 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2 

1.1. Tổng quan về <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> ........................................................ 2 

1.1.1. Đặc điểm của <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> ................................................. 2 

1.1.2. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> ..... 3 

1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước .......................................... 5 

1.2.1. Pha tĩnh ............................................................................................... 5 

1.2.2. Pha động ............................................................................................. 6 

1.2.3. Cơ chế tách .......................................................................................... 7 

1.2.4. Ưu điểm ............................................................................................... 8 

1.2.5. Nhược điểm ......................................................................................... 9 

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 10 

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 10 

2.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 10 

2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 10 

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 10 

2.2.3. Chuẩn bị mẫu .................................................................................... 11 


2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động ............................................................ 12 

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 12 















2.3.1. Phương <strong>pháp</strong> nghiên cứu .................................................................. 13 

2.3.2. Thẩm định <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> ................................................................... 15 

2.4. Áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> .............................................................................. 18 

2.5. Xử lý kết quả ............................................................................................ 18 

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 19 

3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................... 19 

3.1.1. Khảo sát pha tĩnh ............................................................................. 19 

3.1.2. Khảo sát pha động ............................................................................ 20 

3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu ............................................................. 23 

3.1.4. Khảo sát về thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu .......................................................... 23 

3.1.5. Lựa chọn bước sóng phát hiện .......................................................... 24 

3.2. Phương <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> ....................... 24 

3.3. Thẩm định <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> .......................................................................... 25 

3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................... 25 

3.3.2. Độ chọn lọc ....................................................................................... 25 

3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ............................................................... 26 

3.3.4. Độ lặp lại ........................................................................................... 28 

3.3.5. Độ đúng ............................................................................................. 29 

3.3.6. Độ thô ................................................................................................ 31 

3.4. Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> chế phẩm trên thị trường ................... 32 

3.4.1. Công thức tính ................................................................................... 32 


3.4.2. Kết quả định lượng ............................................................................ 32 

3.5. Bàn luận chung ......................................................................................... 33 















3.5.1. Ưu điểm của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> ................................................................ 33 

3.5.2. Nhược điểm của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> .......................................................... 34 

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 35 

4.1. Kết luận .................................................................................................... 35 

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 35 













DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 




Tên tiếng Anh 

Tên tiếng Việt 

ACN Acetonitrile Acetonitril 

CIL Cilastatin Cilastatin 

DHP-1 Enzyme dehydropeptidase-I Enzym dehydropeptidase-I 

HILIC 

HPLC 

Hydrophilic Interaction Chromatography Sắc ký lỏng tương tác thân nước 

High Performance Liquid 

Chromatography 

IMI Imipenem Imipenem 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao 

IPC Ion – pair Chromatography Sắc kí tạo cặp ion 

NPLC Normal Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha thuận 

LC-MS 

Liquid Chromatography - Mass 

Spectrometry 

Sắc kí lỏng khối phổ 

RPLC Reversed Phase Liquid Chromatography Sắc ký lỏng pha đảo 

UV Ultraviolet Tử ngoại 
















DANH MỤC CÁC BẢNG 

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI <strong>và</strong> CIL ......................................................... 2 

Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL bằng sắc kí lỏng ............. 4 

Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát ........................................................ 14 

Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn .................................................. 16 

Bảng 2.3. Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng ........................................... 18 

Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống………………………………………..25 

Bảng 3.2. Kết quả độ chọn lọc ............................................................................ 26 

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.................................................... 26 

Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại trong ngày <strong>và</strong> khác ngày ....................................... 29 

Bảng 3.5. Kết quả độ đúng của CIL .................................................................... 30 

Bảng 3.6. Kết quả độ đúng của IMI .................................................................... 30 

Bảng 3.7. Kết quả độ thô ..................................................................................... 31 

Bảng 3.8. Kết quả định lượng <strong>imipenem</strong> trong chế phẩm .................................. 33 

Bảng 3.9. Kết quả định lượng <strong>cilastatin</strong> trong chế phẩm .................................... 33 
















DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin ..................................................... 3 

Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC ....................................................................... 7 

Hình 3.1. Kết quả khảo sát pha tĩnh .................................................................... 19 

Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động ............................................... 20 

Hình 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng .............................................................. 23 

Hình 3.4. Phổ hấp thụ của IMI………………………………………................24 

Hình 3.5. Phổ hấp thụ của CIL…………………………………………………24 

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ <strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> 

pic của Cilastatin ................................................................................................. 27 


pic của <strong>imipenem</strong> ................................................................................................ 28 
















ĐẶT VẤN ĐỀ 

Kháng sinh đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong công tác phòng <strong>và</strong> điều trị 

bệnh, đặc biệt là các bệnh do nhiễm khuẩn. Các kháng sinh nhóm β-lactam được sử 

dụng rất phổ biến ở Việt Nam nhưng tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc cũng khá cao, trong 

số đó có <strong>imipenem</strong> [5]. Imipenem có phổ tác dụng rất rộng trên phần lớn các vi khuẩn 

Gram dương, Gram âm, ưa khí, kị khí <strong>và</strong> bền vững với các β-lactamase của vi khuẩn 

nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng, 

khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. Tuy nhiên, nó lại bị <strong>phân</strong> hủy bởi enzym 

dehydropeptidase-I (DHP-I) ở ống thận, do vậy nó thường được kết hợp với <strong>cilastatin</strong>, 

một chất ức chế DHP-I, trong các chế phẩm thuốc tiêm [3],[16]. Theo Cục Quản lí 

Dược Việt Nam, từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 có 15 số đăng kí trong nước <strong>và</strong> 

47 số đăng kí nước ngoài với chế phẩm chứa hai hoạt chất trên [4]. Để đảm bảo được 

hiệu quả điều trị của <strong>imipenem</strong> trong lâm sàng cũng như giảm tỷ lệ vi khuẩn kháng 

thuốc, cần kiểm soát tốt hàm lượng của <strong>imipenem</strong> trong các chế phẩm được sản xuất 

<strong>và</strong> lưu hành tại Việt Nam. 

Imipenem <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> chủ yếu được <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> bằng kỹ thuật sắc kí tạo cặp ion vì 

chúng có độ <strong>phân</strong> cực cao [2],[13],[20]. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử 

dụng chất tạo cặp ion có khả năng lưu giữ trên cột rất tốt nên thông thường sẽ không 

thể dùng cột để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> pha đảo với đối tượng khác [8]. Một kỹ thuật khác có thể 

dùng để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> hai hợp chất trên là sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC). HILIC 

sử dụng pha động <strong>phân</strong> cực <strong>và</strong> pha tĩnh <strong>phân</strong> cực nên lưu giữ tốt các hợp chất <strong>phân</strong> cực 

như <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong>. Theo tôi tìm hiểu, tính đến nay trên thế giới mới có một số 

ít nghiên cứu sử dụng HILIC để định lượng <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> trong chế phẩm, 

còn tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề 

tài: “<strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> trong thuốc tiêm 

bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước” với hai mục tiêu chính: 

1. <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>và</strong> thẩm định <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> trong thuốc 

tiêm bằng HILIC. 


2. Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trên xác định hàm lượng <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> trong một 

chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường. 





1 











CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 

1.1. Tổng quan về <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> 

1.1.1. Đặc điểm của <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> 

Imipenem (IMI) là một kháng sinh carbapenem trong nhóm β-lactam, có phổ tác 

dụng rất rộng nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp 

cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. IMI thường được kết hợp với 

<strong>cilastatin</strong> (CIL) để ức chế sự <strong>phân</strong> huỷ của IMI ở thận bởi enzyme DHP-I. Đặc điểm 

cấu tạo <strong>và</strong> một số tính chất lý hóa của IMI <strong>và</strong> CIL được liệt kê trong bảng 1.1. 

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI <strong>và</strong> CIL 

Đặc điểm IMI CIL 

Công thức cấu 

tạo 

Công thức 

<strong>phân</strong> tử 

Phân tử lượng 

(g/mol) 

Danh <strong>pháp</strong> 

C12H17N3O4S 

299,3 358,4 

Acid (5R,6S)-6-[(R)-1-hydroxy 

ethyl]-3-[[2[(iminomethyl) 

amino]ethyl]sulphanyl]-7-oxo-1- 

azabicyclo[3.2.0]hept-2-en-2- 

carboxylic 

Tính chất vật lí Bột màu trắng, trắng ngà hay 

Tính chất hóa 

học 

Độ ổn định 

<strong>và</strong>ng nhạt. Hơi tan trong nước, 

khó tan trong methanol [2]. 

pka1 = 3,2 <strong>và</strong> pka2 = 9,9. 

Lg P = -3,9 [24]. 

Bị <strong>phân</strong> hủy trong môi trường 

acid <strong>và</strong> base. 

2 

C16H26N2O5S 

acid (Z)-7-[[(R)-2-amino-2- 

carboxyethyl]sulphanyl]-2- 

[[[(1S)-2,2-dimethylcyclopropyl] 

carbonyl]amino]hept-2-enoic 

Bột vô định hình màu trắng hay 

hơi <strong>và</strong>ng, hút ẩm. Rất dễ tan trong 

nước <strong>và</strong> methanol, khó tan trong 

ethanol khan [2]. 

pka1 = 2,53 <strong>và</strong> pka2 = 9,14. 


Lg P = -1,3 [23]. 















Hiện nay, tại Việt Nam có nhiều chế phẩm chứa hỗn hợp IMI <strong>và</strong> CIL đang được 

lưu hành. Các hàm lượng hay được sử dụng là IMI 500 mg (hoặc 750 mg) <strong>và</strong> CIL 500 

mg (hoặc 750 mg) với dạng bột để pha tiêm bắp; IMI 250 mg (hoặc 500 mg) <strong>và</strong> CIL 

250 mg (hoặc 500 mg) với dạng bột để pha tiêm truyền tĩnh mạch [3]. 

1.1.2. Một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> 

Trên thế giới có một số nghiên cứu về <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời IMI <strong>và</strong> CIL trong chế 

phẩm. Phương <strong>pháp</strong> quang phổ đạo hàm được áp dụng để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời hai chất 

này [9],[17]. Tuy nhiên, do IMI dễ bị <strong>phân</strong> hủy thành thienamycin [16] có cấu trúc gần 

giống IMI (hình 1.1) nên việc sử dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> quang phổ đạo cần cân nhắc tới 

khả năng bị <strong>phân</strong> hủy của IMI. 

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin 

Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay được sử dụng để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> 

CIL trong chế phẩm do có thể tách riêng được tạp chất. IMI <strong>và</strong> CIL là những hợp chất 

<strong>phân</strong> cực có khả năng hấp thu ánh sáng vùng tử ngoại (UV) nên <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> hay 

được sử là sắc kí tạo cặp ion (IPC) <strong>và</strong> HILIC kết nối với detector tử ngoại. Trong đó, 

IPC được sử dụng phổ biến hơn <strong>và</strong> được quy định trong một số dược điển [2],[13],[20]. 

Chất tạo cặp ion được sử dụng ở đây là natri hexansulfonat do nó có khả năng tạo cặp 

với các nhóm chức amin của IMI <strong>và</strong> CIL. Sản phẩm tạo thành sau khi tạo cặp ion có 

độ <strong>phân</strong> cực kém hơn so với IMI <strong>và</strong> CIL, do đó chúng được lưu giữ tốt hơn trên pha 

tĩnh kém <strong>phân</strong> cực. Việc sử dụng kĩ thuật sắc kí tạo cặp ion có ưu điểm là sử dụng các 

loại cột pha đảo thông dụng hiện nay. Tuy nhiên, nó có nhược điểm là chất tạo cặp ion 

lưu giữ rất tốt trong cột, do vậy thường không thể sử dụng cột để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> pha đảo. 

HILIC là kĩ thuật mới hơn có khả năng <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trực tiếp IMI <strong>và</strong> CIL do có khả năng 


lưu giữ tốt các chất <strong>phân</strong> cực. Bảng 1.2 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở 

Việt Nam <strong>và</strong> trên thế giới về <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời IMI <strong>và</strong> CIL bằng sắc kí lỏng. 





3 









STT Tác giả Phương 

1 Dược điển 

Việt Nam V 

[2] 

2 Dược điển 

Nhật 16 [13] 

<strong>pháp</strong> 

Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL bằng sắc kí lỏng 

IPC Cột C18 (250 x 4,6 

Điều kiện tiến hành 

Pha tĩnh Pha động Bước 

mm, 10 µm) duy trì 

ở 50 ± 1 o C. 

IPC Cột C8 (200 x 4,6 

mm, 10 µm) duy trì 

ở khoảng 50 o C. 

3 USP 38 [20] IPC Cột C18 (300 x 4,6 

4 Natalija 

Nakov [16] 

HILIC 


mm) duy trì ở 50 ± 

1 o C. 

Cột Purospher 

STAR (150 × 4,6 

mm, 5 µm) duy trì ở 

25°C. 

Natri hexansulfonat trong dung dịch đệm 

phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng 2 ml/phút. 

Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic, 

natri 1-hexan sulfonat <strong>và</strong> dinatri dihydrogen 

ethylendiamin tetracetat dihydrat trong 

nước, pH 7,0. 

Natri 1-hexansulfonat trong dung dịch đệm 

phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng khoảng 2 ml/ 

phút. 

Hỗn hợp ACN : amoni format (45 mM, pH 

5,5) = 68:32 (v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút. 

4 



sóng 

254 nm 

tR CIL 

Kết quả 

tR IMI 

250 nm Khoảng 

254 nm 

3 phút 

254 nm 3,5 phút 4,8 phút 















Trên thế giới hiện nay mới có một số ít nghiên cứu sử <strong>dựng</strong> HILIC để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

IMI <strong>và</strong> CIL trong chế phẩm. Nghiên cứu của N. Nakov [16] sử dụng pha động gồm 

hỗn hợp dung môi ACN <strong>và</strong> dung dịch đệm amoni format 45 mM, pH 5,5 để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

IMI <strong>và</strong> CIL trong chế phẩm cho kết quả về thời gian lưu của các chất ngắn (dưới 5 

phút). Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế là hệ số kéo đuôi của <strong>cilastatin</strong> lớn 

(AS(CIL)= 1,6), hệ số chắn của đường chuẩn cao (Y-intercept của CIL <strong>và</strong> IMI lần lượt là 

-2,6% <strong>và</strong> -8,8%). Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> 

CIL trong chế phẩm bằng HILIC được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài với mục 

đích xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL trong chế phẩm bằng HILIC <strong>và</strong> cải 

thiện được các hạn chế của nghiên cứu trên. 

1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước 

HILIC là kĩ thuật sắc kí lỏng sử dụng pha tĩnh <strong>phân</strong> cực giống sắc kí lỏng pha 

thuận (NPLC) <strong>và</strong> pha động <strong>phân</strong> cực giống sắc kí lỏng pha đảo (RPLC) [7]. So với 

RPLC, HILIC có khả năng lưu giữ tốt hơn các chất <strong>phân</strong> cực. So với NPLC, HILIC sử 

dụng dung môi pha động ít độc hại hơn <strong>và</strong> tăng khả năng hòa tan các chất <strong>phân</strong> cực. 

Đối tượng <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> của HILIC thường là các hợp chất <strong>phân</strong> cực, như các acid amin 

[6], peptid [14], kháng sinh [21], carbohydrat [10]… 

1.2.1. Pha tĩnh 

Pha tĩnh sử dụng trong HILIC là những bề mặt <strong>phân</strong> cực, phổ biến nhất là silica <strong>và</strong> 

dẫn xuất của nó. Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong HILIC 

[7]. Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt <strong>và</strong> độ <strong>phân</strong> giải thấp hơn so với các cột silica 

nên số lượng cột polyme trên thị trường cũng như các nghiên cứu về HILIC trên cột 

polyme là không nhiều. 

Dựa <strong>và</strong>o cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia thành 2 loại là silica không 

dẫn xuất <strong>và</strong> silica dẫn xuất hóa. 

- Silica không dẫn xuất: 

Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt 

<strong>phân</strong> cực của silica. Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động 


có pH thấp thủy <strong>phân</strong>, cắt các liên kết <strong>và</strong> rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết. So với 

RPLC, các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần khi tách các hợp 

chất <strong>phân</strong> cực [8]. Nhược điểm của nó là có thể xảy ra hiện tượng quá tải cột. 

5 















- Silica dẫn xuất hóa: Theo trạng thái <strong>tích</strong> điện, pha tĩnh silica dẫn xuất hóa được chia 

thành các nhóm sau: 

+ Trung tính: amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin… 

+ Lưỡng cực: sulfoalkyl betain… 

+ Tích điện dương: amino propyl, silica bao latex… 

+Tích điện âm: silica liên kết poly(succinimid), poly aspartic, poly hydroxyethyl A, 

poly sulfoethyl A. 

Pha tĩnh silica không dẫn xuất được sử dụng phổ biến hơn loại dẫn xuất hóa do rẻ 

hơn <strong>và</strong> khả năng lưu giữ tốt với nhiều chất. 

1.2.2. Pha động 

HILIC sử dụng pha động là các dung môi hữu cơ thân nước như acetonitril (ACN) 

cùng với một lượng nhỏ nước [7]. Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ 

bay hơi thường được sử dụng. Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3% 

đủ để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [18]. Tuy nhiên, bất kỳ một dung môi 

không proton đồng tan với nước nào cũng có thể được sử dụng làm pha động cho 

HILIC (ví dụ như dioxan hoặc tetrahydrofuran). Alcol cũng có thể được sử dụng, tuy 

nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt được cùng một mức độ lưu giữ các chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

so với các dung môi khác [11]. 

Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải: 

Aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxan < dimethyl 

formamid ~ methanol < nước [7]. 

Thông thường, khi giảm độ <strong>phân</strong> cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của 

chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. 

Đệm thường được sử dụng để kiểm soát pH pha động <strong>và</strong> lực ion. Trong HILIC, 

chúng làm thay đổi sự <strong>phân</strong> cực của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>và</strong> pha động, cũng như trạng thái 

tồn tại của bề mặt pha tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do 

vậy làm thay đổi thời gian lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Đối với chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> có nhiều dạng 

ion hóa, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH thường được điều chỉnh để đảm bảo 


rằng các chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất [7]. Đối với các chất <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử dụng đệm trong pha động. Nếu trong 

cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion, nồng độ đệm tăng sẽ 

6 















làm giảm thời gian lưu. Trong trường hợp tương tác ion không ảnh hưởng đến việc lưu 

giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng đến solvat hóa cũng như 

hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha tĩnh kém). Nồng độ đệm 

thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung 

môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [19]. Các loại đệm hay được sử dụng là đệm 

acetat <strong>và</strong> đệm format do có khả năng bay hơi, thuận lợi trong việc kết nối với detector 

khối phổ. Đệm phosphat ở nồng độ thấp cũng có thể được sử dụng trong trường hợp 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> không sử dụng detector khối phổ. Đệm phosphat có ưu điểm là có khoảng 

pH đệm rộng do dó <strong>phân</strong> tách tốt nhiều chất, tuy nhiên lại dễ bị tủa trong ACN tỷ lệ 

cao. Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như natri perclorat 100-300 mM) có thể 

được sử dụng để tăng sự <strong>phân</strong> cực của pha động nhằm đạt được rửa giải mong 

muốn. Tuy nhiên do các muối này không dễ bay hơi nên việc này không thuận lợi để 

sử dụng trong sắc kí lỏng kết nối với khối phổ [7]. 

HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao 

dung môi hữu cơ khi bắt đầu <strong>và</strong> kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ. 

1.2.3. Cơ chế tách 

Về cơ bản, có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách trong HILIC: thứ nhất là sự 

<strong>phân</strong> bố chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> giữa pha động <strong>và</strong> pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> lên bề mặt của pha tĩnh; thứ ba pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, tiếp theo các 

chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>phân</strong> bố lên lớp hấp phụ này [7]. Hiện nay, cách mô phỏng thứ ba được 

thừa nhận rộng rãi. Hình 1.2 minh họa cơ chế tách này: 






Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC 

7 











Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh <strong>phân</strong> cực, một phần pha 

động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh tạo thành một lớp chất lỏng chứa nước bao trên bề 

mặt pha tĩnh. Chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> khi đi qua cột sắc kí sẽ được <strong>phân</strong> bố giữa pha động <strong>và</strong> 

lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này. Như vậy, chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> càng 

<strong>phân</strong> cực, nó sẽ được lưu giữ lâu hơn trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh. Nói cách 

khác, quá trình <strong>phân</strong> tách phụ thuộc <strong>và</strong>o độ <strong>phân</strong> cực của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>và</strong> lớp solvat 

hoá trên bề mặt pha tĩnh. Khi nồng độ ACN (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng 

lên, nước tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh <strong>phân</strong> cực. Khi nồng độ của 

nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có thể là nhiều lớp, <strong>và</strong> lượng nước 

hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước trong dung môi [7]. Nói chung, thông 

thường khi tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động, hay nói cách khác là giảm độ 

<strong>phân</strong> cực của pha động thì thời gian lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trong HILIC cũng sẽ tăng 

theo [8]. Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện <strong>tích</strong>, chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> có thể có thêm 

các tương tác tĩnh điện với pha tĩnh. 

1.2.4. Ưu điểm 

HILIC có những ưu điểm vượt trội so với các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc kí khác khi <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> các chất <strong>phân</strong> cực. Trong RPLC, do sử dụng pha động <strong>phân</strong> cực <strong>và</strong> pha tĩnh kém 

<strong>phân</strong> cực nên các chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>phân</strong> cực mạnh sẽ không được lưu giữ hoặc lưu giữ 

kém. Trái lại, trong HILIC chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được <strong>phân</strong> bố ở cả lớp dung môi thân nước 

bao trên bề mặt pha tĩnh <strong>và</strong> pha động khan nước, từ đó tăng lưu giữ các chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> 

<strong>phân</strong> cực. NPLC hoặc IPC hay được sử dụng trong việc <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> các hợp chất <strong>phân</strong> 

cực. Tuy nhiên, do NPLC sử dụng dung môi pha động độc hại <strong>và</strong> khả năng hòa tan 

chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>phân</strong> cực [8] kém nên nó không phải là <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> tối ưu cho việc 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> các chất <strong>phân</strong> cực. Khác với NPLC, HILIC sử dụng các dung môi thân thiện 

hơn (như ACN, nước… ), <strong>và</strong> hòa tan tốt chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> <strong>phân</strong> cực. IPC có nhược điểm 

lớn là cột sau khi đã sử dụng bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này thường không thể sử dụng cho 

mục đích khác, tốn nhiều thời gian để ổn định hệ thống <strong>và</strong> rửa cột do chất tạo cặp ion 

bị lưu giữ mạnh hoặc tạo liên kết với pha tĩnh. Chính vì những lí do trên mà HILIC có 


ưu diểm vượt trội khi <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> các hợp chất <strong>phân</strong> cực. 





8 











HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung môi hữu cơ cao có độ nhớt thấp nên có 

thể tiến hành được ở áp suất thấp hơn. Độ nhớt thấp cũng cho phép cột có khả năng 

làm việc ở tốc độ dòng cao, giảm thời gian <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> [7]. 

Với các chất <strong>phân</strong> cực hấp thụ UV kém như các acid amin, HILIC có thể định 

lượng trực tiếp các chất tại bước sóng thấp do sử dụng dung môi có bước sóng tới hạn 

thấp [6]. Khi <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> các hợp chất này bằng RPLC cần phải dẫn xuất hóa, vì vậy gây 

khó khăn cho việc định tính <strong>và</strong> định lượng chất. Trong khi đó, pha động HILIC 

(thường sử dụng ACN có bước sóng tới hạn là 190 nm [1]) cho phép lưu giữ ở thời 

gian lưu thích hợp, xác định trực tiếp nhiều chất tại bước sóng thấp cỡ 200 nm, giảm 

bớt công đoạn tạo dẫn xuất trong định tính, định lượng chất. 

HILIC có khả năng kết nối với detector khối phổ [22] nhờ pha động có chứa lượng 

lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, dễ hóa hơi, thích hợp với LC-MS. Đối với 

RPLC, khi <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> các hợp chất <strong>phân</strong> cực thường sử dụng pha động chứa tỷ lệ nước 

cao, khó hóa hơi nên không phù hợp với LC-MS. Ngược lại, pha động không <strong>phân</strong> cực 

của NPLC không những độc hại với môi trường mà rất khó hoà tan các dược chất <strong>phân</strong> 

cực, giảm tỷ lệ ion hoá của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [8] 

khi <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> bằng LC-MS. 

1.2.5. Nhược điểm 

Bên cạnh các ưu điểm đã trình bày ở trên, HILIC cũng có một số nhược điểm như: 

- Thời gian đạt được cân bằng lâu hơn RPLC. 

- Pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion. 

- Tương tác phức tạp, nhiều lớp, khó kiểm soát hơn RPLC <strong>và</strong> NPLC. 

- Phụ thuộc quá nhiều <strong>và</strong>o dung môi acetonitril, khó tìm lựa chọn thay thế. 






9 











CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

2.1. Đối tượng nghiên cứu 

Đối tượng nghiên cứu là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam của Merck Sharp & 

Dohme Corp. Mỗi lọ chứa một lượng bột tương đương với 500 mg <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> 500 

mg <strong>cilastatin</strong>. Ngoài ra, chế phẩm còn chứa natri bicarbonat vô khuẩn là tá dược không 

có hoạt tính. 

2.2. Nguyên vật liệu 

2.2.1. Hóa chất 

- Thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam: Nhà sản xuất Merck Sharp & Dohme Corp., số 

lô sản xuất: N026757 <strong>và</strong> N023795, hạn dùng: 27/04/2019 <strong>và</strong> 13/02/2019. 

- Chuẩn <strong>imipenem</strong>: Hàm lượng 93,74% của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. 

- Chuẩn <strong>cilastatin</strong> natri: Hàm lượng 95,54% Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. 

- Tá dược natri bicarbonat: Nhà sản xuất CTCP DPDL PHARMEDIC – Việt Nam. 

- Acetonitril dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức. 

- Methanol dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức. 

- Acid phosphoric: Sản xuất bởi Scharlau – Tây Ban Nha. 

- Kali dihydro phosphat: Sản xuất bởi Merck – Đức. 

- Acid acetic băng dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức. 

- Acid formic dùng cho MS: Sản xuất bởi Merck – Đức. 

- Natri hydroxyd: Sản xuất bởi Merck – Đức. 

- Nước cất hai lần. 

2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series <strong>và</strong> phần mềm chemstation. 

- Cột sắc kí: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Sigma Aldrich) <strong>và</strong> cột 

Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent). 

- Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan). 

- Máy lọc hút chân không Rocker 400. 

- Màng lọc cellulose 0,45 µm. 


- Cân <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> Sartorius TE214S <strong>và</strong> cân <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> METTLER – TOLEDO XPE 105 – 

Thụy Sĩ (d = 0,01 mg). 

- Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Hà Lan). 

10 















- Máy đo pH Mettler Tolero . 

- Pipet chính xác 1,00 ml, 1,50 ml, 2,00 ml, 3,00 ml, 4,00 ml, 5,00ml, micro pipet 100- 

1000 µl (Đức). 

- Bình định mức: 5,00 ml, 10,00 ml, 20,00 ml, 100,0ml. 

- Tủ lạnh sâu PANASONIC MDF-594. 

- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, đũa thủy tinh, vial. 

2.2.3. Chuẩn bị mẫu 

- Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước <strong>và</strong>o bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa 

đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40. 

- Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat <strong>và</strong>o bình định 

mức 100,0 ml. Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung 

dịch natri bicarbonat 120 ppm. Hút 0,50 ml dung dịch này <strong>và</strong>o bình định mức 10,00 ml, 

bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách 

pha mẫu của DĐVN V [2]). 

- Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI <strong>và</strong> 22,2 mg 

CIL natri <strong>và</strong>o hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm 

ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI <strong>và</strong> CIL nồng độ 2000 ppm. 

Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm. 

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000 

ppm <strong>và</strong>o bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được 

dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất. Từ dung dịch này, 

dùng pipet chính xác <strong>và</strong> bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm, 

200 ppm, 150 ppm, 100 ppm <strong>và</strong> 75 ppm. 

- Dung dịch mẫu thử: 

+ Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ 

nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g). Chuyển toàn bộ phần bột <strong>và</strong>o cốc thủy tinh 

khô <strong>và</strong> sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ <strong>và</strong> nắp. Cân khối 

lượng vỏ được m2 (g). Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với 


500 mg IMI <strong>và</strong> 500 mg CIL. 

+ Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam <strong>và</strong>o bình định mức 10,00 ml, 

hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có 

11 















nồng độ khoảng 500 ppm của IMI <strong>và</strong> CIL. Hút 1,50 ml dung dịch thử trên <strong>và</strong>o bình 

định mức 5,00 ml; bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử 150 ppm. 

- Các dung dịch trên được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở -80 o C. 

2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động 

- Dung dịch acid phosphoric 0,5% <strong>và</strong> 0,1 %: Hút 750 µl H3PO4 đặc pha <strong>và</strong>o 250 ml 

nước, khuấy đều, thu được dung dịch H3PO4 0,5%. Pha loãng 50 ml dung dịch này 

bằng nước để được 250 ml dung dịch H3PO4 0,1%. 

- Dung dịch đệm phosphat 5 mM (pH 6,80): Cân chính xác khoảng 170,0 mg KH2PO4 

<strong>và</strong>o cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước, thêm nước đến khoảng 200 ml, khuấy đều. 

Chỉnh đến pH 6,80 bằng dung dịch NaOH 0,5 M. Chuyển <strong>và</strong>o bình định mức 250,0 ml, 

thêm nước vừa đủ, lắc đều. 

- Dung dịch đệm phosphat 20 mM (pH 2,50): Cân chính xác 1,6320 g KH2PO4 <strong>và</strong>o cốc 

có mỏ 100 ml, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần. Rót <strong>và</strong>o bình định mức 500,0 ml, 

thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Chỉnh đến pH 2,50 bằng dung dịch H3PO4 20 mM (210 µl 

H3PO4 đặc pha trong 200 ml nước trong bình định mức). 

- Dung dịch HCOOH 0,05%; 0,1% <strong>và</strong> 0,2%: Hút 410 µl HCOOH pha trong 250 ml 

nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,2%. Pha loãng 100 ml dung dịch 

HCOOH 0,2% bằng nước để được 200 ml dung dịch HCOOH 0,1%. Hút 100 µl 

HCOOH pha trong 250 ml nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,05%. 

- Dung dịch CH3COOH 1% <strong>và</strong> 0,1%: Hút 2 ml CH3COOH băng pha trong 200 ml 

nước, khuấy đều thu được dung dịch CH3COOH 1%. Hút 240 µl CH3COOH băng pha 

trong nước vừa đủ 250 ml, khuấy đều. 

- Dung dịch đệm acetat 10 mM (pH 4,75): Hút 140 µl CH3COOH băng pha trong 200 

ml nước, điều chỉnh đến pH 4,75 bằng dung dịch NaOH 0,5 M, thêm nước vừa đủ 250 

ml. 

Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 µm <strong>và</strong> siêu âm trước khi sử dụng. 

2.3. Nội dung nghiên cứu 

- <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL trong thuốc tiêm bằng HILIC. 


Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí sau: 

+ Pha tĩnh 

+ Pha động: thành phần, tỷ lệ, nồng độ, pH, tốc độ dòng 

12 















+ Dung môi pha mẫu 

+ Thể <strong>tích</strong> tiêm 

+ Bước sóng phát hiện 

- Thẩm định <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL trong chế phẩm thuốc tiêm bằng 

HILIC theo hướng dẫn của ICH [12] với các tiêu chí sau: 

+ Độ đặc hiệu 

+ Độ phù hợp hệ thống 

+ Khoảng nồng độ tuyến tính 

+ Độ lặp lại 

+ Độ đúng 

+ Độ thô 

- Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trên xác định hàm lượng IMI <strong>và</strong> CIL trong thuốc tiêm 

Tienam trên thị trường. 

2.3.1. Phương <strong>pháp</strong> nghiên cứu 

Dựa trên nghiên cứu của N. Nakov [16] về <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL bằng HILIC trong 

chế phẩm thuốc tiêm, kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm, tôi 

tiến hành khảo sát các điều kiện chạy sắc kí như sau: 

2.3.1.1. Khảo sát pha tĩnh 

Cột silica có thể sử dụng làm pha tĩnh HILIC, loại cột này có giá thành rẻ, sẵn có, 

vì vậy, tôi lựa chọn cột hai cột silica có độ dài khác nhau, cùng kích thước hạt nhồi cột 

5 µm để tiến hành khảo sát: 

- Cột Supelco Ascentis Silica kích thước 250 x 4,6 mm: Cột đã sử dụng chạy pha 

thuận trước đây, được hoạt hóa lại bằng isopropanol để chạy HILIC. 

- Cột Hypersil Silica kích thước 200 x 4,6 mm: Cột mới được hoạt hóa bằng 

isopropanol. 

Dựa <strong>và</strong>o hình dạng pic sắc kí <strong>và</strong> thời gian <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> để lựa chọn cột. 

2.3.1.2. Khảo sát pha động 

Tiến hành khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ, nồng độ, pH <strong>và</strong> tốc độ dòng. Dựa 


<strong>và</strong>o khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền <strong>và</strong> thời gian lưu của IMI 

<strong>và</strong> CIL để lựa chọn pha động thích hợp. Bảng 2.1 dưới đây mô tả các điều kiện pha 

động mà tôi đã tiến hành khảo sát: 

13 















Pha tĩnh 

Cột Supelco 

Ascentis Silica 

(250 x 4,6 mm, 

5 µm) 

Cột Hypersil 

Silica (200 x 

4,6 mm, 5 µm) 

Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát 

ACN : H3PO4 0,1% 

Pha động 

Tỉ lệ 

(v/v) 

Tốc độ 

(ml/phút) 

70:30 1 

75:25 

1 

1,2 

1,5 

80:20 1 

ACN : H3PO4 0,5% 70:30 1 

ACN : đệm phosphat 5 mM (pH 6,80) 

70:30 1 

75:25 1 

ACN : HCOOH 10 mM 70:30 1 

ACN : đệm acetat 10 mM (pH 4,75) 70:30 1 

ACN : CH3COOH 0,1% 

70:30 1 

75:25 1 

ACN : nước 70:30 1 

MeOH : H3PO4 0,1% 

70:30 1 

75:25 1 

90:10 1 

ACN : HCOOH 20 mM 70:30 1 

ACN : HCOOH 50 mM 70:30 1 

ACN : CH3COOH 1% 

ACN : H3PO4 0,1% 

70:30 1 

60:40 1 

70:30 1 

60:40 

ACN : đệm phosphat 20 mM, pH 2,50 60:40 


1 

1,2 

1 

0,8 

0,5 





14 











2.3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu 

Pha mẫu trong hỗn hợp dung môi ACN <strong>và</strong> nước như trong nghiên cứu N. Nakov 

[16] nhưng với các tỷ lệ khác nhau gồm 75:25 <strong>và</strong> 60:40 (v/v). Tiến hành chạy sắc ký, 

dựa <strong>và</strong>o hình dáng của pic sắc ký <strong>và</strong> chi phí để lựa chọn dung môi pha mẫu thích hợp. 

2.3.1.4. Khảo sát thể <strong>tích</strong> tiêm 

Tiến hành chạy sắc kí ở hai thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu là 10 µl <strong>và</strong> 5 µl, dựa <strong>và</strong>o hình dạng 

pic <strong>và</strong> độ cân xứng của pic để lựa chọn thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu thích hợp. 

2.3.1.5. Khảo sát bước sóng phát hiện 

Tiến hành quét phổ trên pic sắc kí của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ 

190 nm đến 400 nm. Lựa chọn bước sóng thích hợp của mỗi chất. 

2.3.2. Thẩm định <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

Phương <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL bằng HILIC được thẩm định theo các tiêu chí 

sau theo hướng dẫn của ICH [12]: 

- Độ phù hợp hệ thống 

- Độ chọn lọc 

- Khoảng nồng độ tuyến tính 

- Độ lặp lại 

- Độ đúng 

- Độ thô 

2.3.2.1. Độ phù hợp hệ thống 

- Chuẩn bị: Pha mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm bằng cách hút 1,50 ml dung 

dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 500 ppm <strong>và</strong>o bình định mức 5,00 ml, thêm dung môi pha 

mẫu vừa đủ, lắc đều. 

- Tiến hành: Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp 

một mẫu chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 150 ppm. Ghi lại thời gian lưu <strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> pic của 

các lần sắc ký. 

- Yêu cầu: Chênh lệch diện <strong>tích</strong> pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, 

biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0% [2]. 


2.3.2.2. Độ chọn lọc 

- Chuẩn bị các mẫu sau: 

+ Mẫu dung môi pha mẫu: Chuẩn bị như mục 2.2.3. 

15 















+ Mẫu placebo tự tạo: Pha dung dịch natri bicarbonat 6 ppm như mục 2.2.3. 

+ Mẫu chuẩn đơn thành phần IMI, CIL 150 ppm: Hút 1,50 ml chuẩn đơn gốc <strong>và</strong>o bình 

định mức 20,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều. 

+ Mẫu chuẩn hỗn hợp gồm hai thành phần IMI <strong>và</strong> CIL nồng độ 150 ppm của mỗi chất: 

Hút 3,00 ml chuẩn hỗn hợp gốc <strong>và</strong>o bình 5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều. 

+ Mẫu thử nồng độ 150 ppm của mỗi chất: Hút 1,50 ml dung dịch mẫu thử <strong>và</strong>o bình 

5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều. 

- Tiến hành: Chạy sắc ký các mẫu trên, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được. 

- Yêu cầu: 

+ Trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu trắng <strong>và</strong> dung dịch placebo không được xuất hiện 

pic tại vị trí của hoạt chất chính. Nếu có thì ảnh hưởng của mẫu placebo (AH%) ≤ 1%. 

+ Trên sắc kí đồ của dung dịch thử có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống 

kê với thời gian lưu của chất chuẩn trong sắc kí đồ của mẫu chuẩn. Pic của chất cần 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> phải tinh khiết (Độ tinh khiết của pic sắc kí > 0,995). Chồng phổ của chất 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> với chất chuẩn cho hệ số Match ≥ 0,999. Nếu xuất hiện pic tạp chất, thì phải 

tách khỏi pic chất thử với độ <strong>phân</strong> giải Rs > 1,5. 

2.3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ IMI <strong>và</strong> CIL khoảng từ 75 ppm 

đến 250 ppm từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500 ppm. Bảng 2.2 mô tả quy trình pha các 

mẫu dường chuẩn: 

Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn 

Nồng độ (ppm) Hệ số pha loãng V dung dịch 

16 

500 ppm (ml) 

Bình định mức (ml) 

75 6,7 1,50 10,0 

100 5 1,00 5,0 

150 3,3 1,50 5,0 

200 2,5 2,00 5,0 

250 2 5,00 10,0 


- Tiến hành chạy sắc ký, xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> trình hồi quy, xác định hệ số tương quan (R) 

<strong>và</strong> hệ số chắn tại nồng độ 100% (Y-intercept). 















- Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,995 <strong>và</strong> hệ số chắn tại nồng độ 100%: -2,0% ≤ Y- 

intercept ≤ 2,0 %. 

2.3.2.4. Độ lặp lại 

- Độ lặp lại trong ngày 

+ Chuẩn bị: Cân 6 mẫu thử riêng biệt. Pha mẫu thử như mục 2.2.3. 

+ Tiến hành: Chạy sắc kí 6 mẫu thử. 

+ Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối 

RSD (%) của IMI <strong>và</strong> CIL phải không lớn hơn 2,0%. 

- Độ lặp lại khác ngày 

+ Chuẩn bị: Cân 6 mẫu thử riêng biệt. Pha mẫu thử như mục 2.2.3. 

+ Tiến hành: Chạy sắc kí 6 mẫu thử. 

+ Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày <strong>và</strong> 12 lần thử trong 

2 ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của IMI <strong>và</strong> CIL 

phải không lớn hơn 2,0%. 

2.3.2.5. Độ đúng 

- Chuẩn bị: 

+ Cân 21,30 mg thử <strong>và</strong>o bình định mức 20,00 ml. Hòa tan trong 8 ml nước, thêm ACN 

tới vạch, lắc đều thu được dung dịch thử nồng độ khoảng 500 ppm. 

+ Cân 3 mẫu chuẩn hỗn hợp gồm 11,10 mg CIL natri chuẩn <strong>và</strong> 10,70 mg IMI chuẩn 

<strong>và</strong>o 3 bình định mức 20,00 ml. Hòa tan trong 8 ml nước, thêm ACN tới vạch, lắc đều 

thu được 3 dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 500 ppm. 

+ Thêm các lượng chuẩn ở mức 30%, 50%, 70% <strong>và</strong>o mẫu thử 50% được 9 dung dịch 

dịch ở mức nồng độ khoảng 80%, 100%, 120% (tương ứng với các dung dịch có nồng 

độ khoảng 120 ppm, 150 ppm <strong>và</strong> 180 ppm). Bảng 2.3 dưới đây mô tả cách pha của 9 

dung dịch trên: 






17 











Mức nồng 

độ (%) 

80 

100 

120 

Bảng 2.3. Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng 

V thử (ml) V chuẩn 1 

(ml) 

18 

V chuẩn 2 

(ml) 

V chuẩn 3 

(ml) 

Bình định 

mức (ml) 

1,50 1,00 10,00 

1,50 1,00 10,00 

1,50 1,00 10,00 

1,50 1,50 10,00 

1,50 1,50 10,00 

1,50 1,50 10,00 

1,50 2,00 10,00 

1,50 2,00 10,00 

1,50 2,00 10,00 

- Chạy sắc kí 9 dung dịch trên. Tính nồng độ chuẩn đã thêm <strong>và</strong>o, từ đó tính tỷ lệ thu 

hồi của chất chuẩn IMI <strong>và</strong> CIL thêm <strong>và</strong>o mẫu thử 50%. 

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi đạt 98% - 102% , RSD ≤ 2,0% ở mỗi mức nồng độ. 

Công thức tính tỷ lệ thu hồi: 

lượng chất chuẩn thu hồi 

Tỷ lệ thu hồi (%) = 

lượng chất chuẩn thêm <strong>và</strong>o x 100% 

2.3.2.6. Độ thô 

Độ thô đánh giá độ ổn định của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> khi có sự thay đổi nhỏ về các thông 

số của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>. Trong nghiên cứu này, tôi khảo sát sự thay đổi của tỷ lệ dung môi 

pha động, nồng độ đệm <strong>và</strong> pH. Dùng phần mềm Modde để xây <strong>dựng</strong> quy trình thẩm 

định độ thô. Kết quả được đánh giá dựa <strong>và</strong>o giá trị RSD (%) của hai thông số là thời 

gian lưu <strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> pic của IMI <strong>và</strong> CIL. 

2.4. Áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

Áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trên tiến hành <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời IMI <strong>và</strong> CIL trong thuốc 

tiêm truyền tĩnh mạch Tienam. 


2.5. Xử lý kết quả 

2007. 

Kết quả được xử lý bằng phần mềm Chemstation <strong>và</strong> tính toán bằng Microsoft excel 















CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 

3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 

3.1.1. Khảo sát pha tĩnh 

Tiến hành chạy sắc kí mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm với các pha động như 

bảng 2.1 trên cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm). 

Nhận thấy khi chạy sắc kí trên cột Supelco Ascentis Silica sử dụng các điều kiện 

pha động như trong bảng 2.1, các pic đều bị đổ đầu, giãn chân. Điều này có thể do 

hiện tượng quá tải cột nên tôi tiến hành giảm thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu nhưng không có hiệu 

quả. Tiến hành hoạt hóa lại cột Sulpelco Ascentis Silica bằng isopropanol nhưng 

không cải thiện được hình dạng pic. Điều này có thể do cột đã được sử dụng cho sắc kí 

pha thuận nên hiệu lực cột khi chuyển sang hệ dung môi thân nước của HILIC bị giảm. 

Khảo sát trên cột Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) cho thấy hình dáng pic 

được cải thiện hơn. Cột Hypersil Silica được hoạt hóa bằng isopropanol <strong>và</strong> sử dụng 

riêng cho HILIC nên cho hiệu lực tách tốt hơn (số đĩa lý thuyết trên 9000). Vì vậy, cột 

Hypersil Silica được lựa chọn để khảo sát tiếp. Sắc kí đồ khi <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> IMI <strong>và</strong> CIL sử 

dụng hai cột trên với pha động là hỗn hợp ACN <strong>và</strong> dung dịch đệm phosphat, tốc độ 

dòng 1 ml/phút ở bước sóng 226 nm được thể hiện trong hình 3.1. 

a) CIL 

b) 


Hình 3.1. Kết quả khảo sát pha tĩnh 

a) cột Supelco Ascentis Silica b) cột Hypersil Silica 

Các kết quả khác trên cột Ascentis Silica được thể hiện trong phụ lục PL-2, PL-3. 

19 

CIL 

IMI 

IMI 















3.1.2. Khảo sát pha động 

3.1.2.1. Khảo sát thành phần pha động 

Tiến hành khảo sát các pha động khác nhau trên cột Hypersil Silica như bảng 2.1. 

Kết quả cho thấy khi sử dụng các dung môi acid HCOOH, CH3COOH, H3PO4, thời 

gian lưu của hai chất, đặc biệt là IMI rất dài. Khi sử dụng đệm phosphat 20 mM, pH 

2,50; thời gian <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> được rút ngắn. Do đó, đệm này được lựa chọn cho các khảo 

sát tiếp theo. Một số kết quả khảo sát thành phần pha động ở bước sóng 226 nm được 

thể hiện trong hình 3.2. 

b) 

c) 

d) 

a) 

CIL 

CIL 


Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động 

a) ACN : HCOOH 0,1% b) ACN : CH3COOH 1% 

c) ACN : H3PO4 0,1% d) ACN : Đệm phosphat 20 mM, pH 2,5 

20 

CIL 

CIL 

IMI 

IMI 















Từ kết quả khảo sát pha động, tôi đưa ra một số nhận xét sau: 

- Về khoảng pH khảo sát: 

IMI <strong>và</strong> CIL có nhiều dạng ion hóa tùy thuộc <strong>và</strong>o pH pha động. Theo B. Buszewski 

[7], đối với các chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> có nhiều dạng ion hóa, pH thường điều chỉnh để chất 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong> chỉ tồn tại một dạng ion hóa duy nhất. IMI có pka1 = 3,2 <strong>và</strong> pka2 = 9,9 <strong>và</strong> CIL 

có pk1 = 2,5 <strong>và</strong> pka2 = 9,14. Để chúng chỉ tồn tại ở một dạng ion hóa duy nhất (hoặc là 

–NH3 + hoặc là –COO - ) thì pH sử dụng phải nhỏ hơn (pka1 – 2) hoặc lớn hơn (pka2 + 2), 

tức là nằm ngoài khoảng pH từ 2 đến 8. Tuy nhiên ở các giá trị pH này, pha tĩnh silica 

sẽ bị hòa tan tạo thành các khoảng trống trong cột [1],[15]. Do vậy, các khoảng pH < 2 

<strong>và</strong> pH > 8 không được khảo sát trên cột Hypersil Silica. 

Khi pH > 4-5, các nhóm –SiOH của pha tĩnh bị khử proton hóa làm cho bề mặt pha 

tĩnh mang điện âm [19]. Đồng thời, IMI <strong>và</strong> CIL tồn tại ở dạng lưỡng cực –COO - <strong>và</strong> – 

NH3 + . Khi đó, tương tác ion giữa bề mặt pha tĩnh mang điện âm <strong>và</strong> chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> có 

nhóm mang điện dương sẽ đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tách của HILIC, kết 

quả của tương tác này là làm tăng thời gian lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Điều này đúng khi 

tôi tiến hành khảo sát với đệm phosphat pH 6,8 <strong>và</strong> đệm acetat pH 4,75 trên cột Supelco 

Ascentis. Do vậy trên cột Hypersil Silica, khoảng giá trị pH này không được khảo sát 

nữa. 

- Về loại pha động sử dụng: 

Acid acetic <strong>và</strong> acid formic được khuyến cáo sử dụng trong HILIC do tan tốt trong 

các dung môi hữu cơ, <strong>và</strong> đặc tính dễ hóa hơi, thuận tiện khi kết nối với detector khối 

phổ. Tuy nhiên, do thời gian lưu của CIL <strong>và</strong> IMI quá dài nên tôi không chọn chúng để 

khảo sát tiếp. Đệm phosphat nồng độ cao không được khuyến cáo sử dụng do dễ bị tủa 

trong tỷ lệ cao ACN <strong>và</strong> không có khả năng hóa hơi nên không tương thích với LC-MS. 

Tuy nhiên, đề tài sử dụng đệm phosphat nồng độ thấp (20 mM) <strong>và</strong> tỷ lệ ACN thấp 

(60%), kết hợp với việc sử dụng detector mảng diod cho kết quả tốt về thời gian lưu <strong>và</strong> 

khả năng tách hai chất. Do vậy, đệm phosphat pH 2,5 được lựa chọn để khảo sát tiếp. 

Kết quả về thời gian lưu của CIL <strong>và</strong> IMI trên các pha động khác nhau có thể giải thích 


như sau: 

Thời gian lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> giảm khi độ <strong>phân</strong> cực của pha động tăng lên [8]. 

Khi sử dụng dung dịch đệm, độ <strong>phân</strong> cực của pha động tăng so với khi sử dụng dung 

21 















dịch acid. Do đó, thời gian lưu của CIL <strong>và</strong> IMI khi dùng dung dịch đệm phosphat ngắn 

hơn so với khi dùng dung dịch acid phosphoric. Khi so sánh về thời gian lưu của IMI 

<strong>và</strong> CIL khi sử dụng các dung dịch acid, dung dịch acid phosphoric cho thời gian <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> ngắn nhất. Điều này có thể do acid phosphoric có độ <strong>phân</strong> cực lớn hơn so với acid 

acetic <strong>và</strong> acid formic (Lg P của acid phosphoric, acid acetic, acid formic lần lượt là -1 

[27], -0,17 [26], -0,54 [25]). 

- Về nồng độ đệm sử dụng: 

Theo khuyến cáo, nồng độ đệm thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ 

sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [16]. 

Tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng độ <strong>phân</strong> cực của pha động, do đó làm giảm thời gian 

lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> [8]. Do vậy, nồng độ đệm 20 mM được lựa chọn để khảo sát 

tiếp. 

- Về tỷ lệ pha động: 

Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ bay hơi thường được sử dụng [7]. 

Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3% đủ để hydrat hóa hoàn toàn 

các hạt pha tĩnh [18]. Khi tăng tỷ lệ đệm sẽ làm tăng độ <strong>phân</strong> cực của pha động, dẫn 

tới làm giảm thời gian lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong>. Do vậy, tỷ lệ pha động là 60 % ACN <strong>và</strong> 

40% đệm được lựa chọn. Một ưu điểm khác khi dùng tỷ lệ này là tiết kiệm được ACN, 

do vậy đạt hiệu quả về kinh tế. 

3.1.2.2. Khảo sát tốc độ dòng 

Chạy sắc kí hỗn hợp chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm trên cột Hypersil Silica với 

pha động gồm hỗn hợp ACN <strong>và</strong> dung dịch đệm phosphat (20 mM, pH 2,50) = 60:40 

(v/v) với 3 tốc độ dòng khác nhau là 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút <strong>và</strong> 1 ml/phút thu được 

sắc kí đồ ở bước sóng 226 nm thể hiện ở hình 3.3. 

0,5 ml/phút 


CIL 

IMI 





22 








0,8 ml/phút 

CIL 




1 ml/phút 

Hình 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng 

Khi tăng tốc độ dòng, thời gian lưu của chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> giảm. Xét về mặt thời gian 

<strong>phân</strong> <strong>tích</strong>, tốc độ dòng 1,0 ml/phút có ưu thế nhất nhưng thời gian lưu của CIL lại 

trùng với thời gian chết. Xét về kinh tế, thể <strong>tích</strong> ACN sử dụng là tương đương nhau. Vì 

vậy, tốc độ dòng 0,8 ml/ phút được lựa chọn. 

3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu 

Sau khi chạy sắc kí với 2 mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm pha trong hỗn hợp 

dung môi ACN : nước theo tỷ lệ 75:25 <strong>và</strong> 60:40, nhận thấy không có sự khác biệt về 

các thông số như thời gian lưu, diện <strong>tích</strong> pic… <strong>và</strong> hình dạng pic. Sắc kí đồ của hai 

dung dịch trên ở bước sóng 226 nm được thể hiện trong hình 3.4. 

Thông thường, dung dịch đệm của pha động sẽ được sử dụng để pha mẫu, nhưng 

trong đề tài lại chọn hỗn hợp ACN : nước vì IMI không bền trong môi trường acid. 

Theo khuyến cáo, tỷ lệ nước trong dung môi pha mẫu không lớn hơn so với tỷ lệ nước 

trong pha động nên tôi tiến hành pha mẫu trong hỗn hợp ACN : nước theo tỷ lệ 60:40 

<strong>và</strong> 75: 25. Nhưng do kết quả không có sự khác nhau giữa hai tỷ lệ nên tỷ lệ 60:40 được 

lựa chọn vì giống với tỷ lệ của pha động lựa chọn <strong>và</strong> tăng khả năng hòa tan IMI. 

3.1.4. Khảo sát về thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu 

Khi tiêm mẫu với thể <strong>tích</strong> 5,0 µl <strong>và</strong> 10,0 µl, các thông số <strong>và</strong> hình dạng pic không 

có sự khác biệt. 

CIL 


23 

IMI 

IMI 















Nhược điểm của pha tĩnh silica trần là dễ xảy ra hiện tượng quá tải cột. Nguyên 

nhân gây ra hiện tượng này thường là do nồng độ chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> quá cao hoặc thể <strong>tích</strong> 

tiêm quá lớn. Khi tiêm với thể <strong>tích</strong> 5,0 µl sẽ tránh được hiện tượng quá tải cột nên nó 

được lựa chọn. 

3.1.5. Lựa chọn bước sóng phát hiện 

Quét phổ trên pic của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ 190 nm đến 400 

nm, thu được kết quả như trong hình 3.4 <strong>và</strong> 3.5. 

Hình 3.4. Phổ hấp thụ của IMI 

Từ phổ hấp thụ của IMI <strong>và</strong> CIL, nhận thấy: 

24 

Hình 3.5. Phổ hấp thụ của CIL 

- IMI có 2 cực đại hấp thụ ở 200 nm <strong>và</strong> 312 nm. Tuy nhiên, ở bước sóng 200 nm gần 

với bước sóng tới hạn của ACN (190 nm [1]) nên đường nền sẽ bị nhiễu, khó ổn định 

hơn so với bước sóng 312 nm. Chính vì vậy, bước sóng 312 nm được lựa chọn để <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> IMI. 

- CIL không thấy cực đại hấp thụ trong khoảng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm, 

nhưng có vai ở 226 nm. Do đó, bước sóng 226 nm được lựa chọn để <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> CIL. 

Trong nghiên cứu của N. Nakov [14], tác giả lựa chọn bước sóng 254 nm để <strong>phân</strong> 

<strong>tích</strong> đồng thời IMI <strong>và</strong> CIL, có thể do khi sử dụng pha động ACN : amoni format (45 

mM, pH 5,5) = 68:32, phổ hấp thụ của IMI <strong>và</strong> CIL thay đổi. 

3.2. Phương <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> 

Từ kết quả thực nghiệm trên, tôi xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời hai 

chất IMI <strong>và</strong> CIL như sau: 


- Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm như mục 2.2.3. 

- Điều kiện sắc ký: 















+ Cột pha tĩnh: Cột Hypersil Si 200 x 4,6 mm; 5 µm. 

+ Pha động: hỗn hợp ACN : đệm phosphat (20 mM, pH 2,5) = 60:40 (v/v). 

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. 

+ Bước sóng phát hiện: 226 nm đối với CIL <strong>và</strong> 312 nm đối với IMI. 

+ Thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu: 5µl. 

3.3. Thẩm định <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

3.3.1. Độ phù hợp hệ thống 

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn hỗn hợp như mục 2.3.2.1. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 

lần với điều kiện sắc ký đã trình bày ở mục 3.2. Sắc kí đồ được thể hiện trong phụ lục 

PL-4 <strong>và</strong> PL-5. Kết quả thời gian lưu <strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> pic của IMI <strong>và</strong> CIL được thể hiện 

trong bảng 3.1. 

2,0%. 

STT 

Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống 

Cilastatin 

25 

Imipenem 

tR (phút) S (mAU.s) tR (phút) S (mAU.s) 

1 3,461 1057 4,371 1055 

2 3,461 1057 4,370 1055 

3 3,461 1058 4,369 1054 

4 3,460 1057 4,369 1054 

5 3,461 1060 4,367 1055 

6 3,461 1057 4,370 1053 

TB 3,461 1058 4,369 1054 

RSD (%) 0,012 0,12 0,031 0,077 

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đều dưới 

Kết luận: Phương <strong>pháp</strong> đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ phù hợp hệ thống với hai 

chất IMI <strong>và</strong> CIL theo tiêu chuẩn trong DĐVN V [2]. 

3.3.2. Độ chọn lọc 


Do không có placebo của nhà sản xuất <strong>và</strong> không biết hàm lượng của placebo trong 

chế phẩm nên dựa theo chuyên luận Bột pha tiêm Imipenem <strong>và</strong> Cilastatin trong DĐVN 

V [2], tiến hành chuẩn bị mẫu placebo như mục 2.2.3. 















Tiến hành chạy sắc kí như mục 3.2. 

Kết quả độ chọn lọc được thể hiện trong bảng 3.2 <strong>và</strong> phụ lục PL-6 <strong>và</strong> PL-7. 

Nhận xét: 

Dung môi pha mẫu 

Mẫu placebo tự tạo 

Bảng 3.2. Kết quả độ chọn lọc 

tR CIL (phút) 

tR IMI (phút) 

Mẫu chuẩn IMI 4,488 

Mẫu chuẩn CIL natri 3,458 

Mẫu chuẩn hỗn hợp 3,461 4,378 

Mẫu thử 3,462 4,372 

- Trên sắc ký đồ chuẩn CIL ở bước sóng 226 nm xuất hiện pic ở 3,458 phút. Độ tinh 

khiết của pic CIL bằng 999,995. 

- Trên sắc ký đồ chuẩn IMI ở bước sóng 312 nm xuất hiện pic ở 4,488 phút. Độ tinh 

khiết của pic IMI là 999,341. 

- Trên sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp, có pic hai chất ứng với thời gian lưu với pic trong 

chuẩn đơn thành phần. 

- Trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu <strong>và</strong> mẫu placebo không có pic tại thời gian lưu 

tương ứng với thời gian lưu của hai chất <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> trong mẫu chuẩn hỗn hợp <strong>và</strong> chuẩn 

đơn từng chất. 

- Trên sắc ký đồ mẫu thử có các pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 

hai chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp của CIL <strong>và</strong> IMI. Hệ số chồng phổ của CIL <strong>và</strong> 

IMI lần lượt là 999,994 <strong>và</strong> 999,751. Có pic tạp giữa pic của CIL <strong>và</strong> IMI nhưng Rs của 

CIL <strong>và</strong> tạp <strong>và</strong> Rs của tạp <strong>và</strong> IMI đều > 1,5. 

Kết luận: Phương <strong>pháp</strong> đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ chọn lọc với IMI <strong>và</strong> CIL. 

3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 

Chuẩn bị như mục 2.3.2.3. Tiến hành như mục 3.2. 


Sắc kí đồ được thể hiện ở phụ lục PL-8, PL-9. Bảng 3.3 dưới đây thể hiện nồng độ 

<strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> pic của IMI <strong>và</strong> CIL. 





26 











Nồng độ 

(ppm) 

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 

Cilastatin 

Diện <strong>tích</strong> 

(mAU.s) 

Nồng độ 

(ppm) 

Imipenem 

Diện <strong>tích</strong> 

(mAU.s) 

73,9 593,3 73,5 799,4 

98,6 779,8 98,0 1046 

147,8 1167 146,9 1571 

197,1 1559 195,9 2098 

246,4 1963 244,9 2640 

Hình 3.6 <strong>và</strong> 3.7 là đồ thị biểu diễn <strong>phương</strong> trình hồi quy của CIL <strong>và</strong> IMI: 

Diện <strong>tích</strong> pic (mAU.s) 

2500 

2000 

1500 

1000 

500 

y = 7,9408x - 0,7537 

R² = 0,9999 

0 

0,0 100,0 200,0 300,0 

Nồng độ (ppm) 


pic của Cilastatin 






27 












pic của <strong>imipenem</strong> 

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng 

độ <strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> pic khảo sát: 

- Cilastatin: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 73,9 đến 246,4 ppm; hệ số tương quan 

R = 1,00; hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y-intercept = -0,06%. 

- Imipenem: tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 73,5 đến 244,9 ppm, hệ số tương 

quan R = 1,00; hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y-intercept = -0,08%. 

Kết luận: Phương <strong>pháp</strong> đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu. 

Nghiên cứu của N. Nakov [16] thẩm định ở khoảng nồng độ 100 ppm đến 300 ppm 

thu được hệ số chắn tại nồng độ 100% của CIL <strong>và</strong> IMI lần lượt là -2,6% <strong>và</strong> -8,8%. So 

với nghiên cứu của N. Nakov, đề tài đã khảo sát được khoảng nồng độ tuyến tính với 

Y-intercept thấp. 

3.3.4. Độ lặp lại 

Diện <strong>tích</strong> pic (mAU.s) 

Chuẩn bị 6 mẫu thử độc lập như mục 2.3.2.4. Tiến hành chạy sắc kí với các điều 

kiện như mục 3.2. 

3000 

2500 

2000 

1500 

1000 

500 

y = 10,7499x - 1,3305 

R² = 0,9999 

0 

0,0 100,0 200,0 300,0 

Nồng độ (ppm) 

Bảng 3.4 thể hiện kết quả độ lặp lại trong ngày <strong>và</strong> khác ngày. 






28 











Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại trong ngày <strong>và</strong> khác ngày 

Ngày STT Lượng cân 

1 

2 

mẫu thử 

(mg) 

SCIL 

(mAU.s) 

SIMI 

(mAU.s) 

% CIL so 

với HLGTN 

(%) 

% IMI so 

với HLGTN 

(%) 

1 10,8 1194 1663 99,4 102,3 

2 10,5 1193 1585 102,2 100,2 

3 10,6 1202 1586 102,0 99,4 

4 10,8 1190 1655 99,1 101,8 

5 10,5 1193 1578 102,2 99,8 

6 10,7 1192 1655 100,2 102,7 

TB1 (n=6) 100,9 101,0 

RSD1 (n=6) (%) 1,4 1,4 

1 10,67 1188 1575 101,9 99,4 

2 10,64 1181 1563 101,6 98,9 

3 11,24 1240 1689 101,0 101,2 

4 10,90 1235 1632 103,7 100,8 

5 10,70 1194 1588 102,2 99,9 

6 10,76 1216 1618 103,5 101,3 

TB1 (n=6) 102,3 100,3 

RSD2 (n=6) (%) 1,0 1,0 

TB (n=12) 101,6 100,6 

RSD (n=12) (%) 1,4 1,2 

Nhận xét: RSD của cả IMI <strong>và</strong> CIL ở 6 mẫu của độ lặp lại trong ngày <strong>và</strong> 12 mẫu độ 

lặp lại khác ngày đều không lớn hơn 2,0%. 

Kết luận: Phương <strong>pháp</strong> khảo sát có độ lặp lại tốt. 

3.3.5. Độ đúng 

Chuẩn bị như mục 2.3.2.5. tiến hành chạy sắc kí với các điều kiện như mục 3.2. 


Kết quả độ thu hồi các chất <strong>và</strong> được trình bày tại bảng 3.5 <strong>và</strong> 3.6 dưới đây: 





29 











STT 

Nồng độ 

chuẩn CIL 

thêm <strong>và</strong>o (ppm) 

Bảng 3.5. Kết quả độ đúng của CIL 

S 

(mAU.s) 

Nồng độ 

CIL thu 

lại (ppm) 

% thu hồi 

(%) 

1 51,6 1001 51,2 99,4 

2 49,1 979,9 49,3 100,3 

3 49,6 989 49,6 100,2 

4 77,4 1202 77,2 99,8 

5 73,7 1168 73,9 100,3 

6 74,3 1189 75,4 101,5 

7 103,2 1407 103,6 100,5 

8 98,3 1368 100,1 101,9 

9 99,1 1381 100,2 101,1 

STT 

Nồng độ 

chuẩn IMI 

thêm <strong>và</strong>o (ppm) 

Bảng 3.6. Kết quả độ đúng của IMI 

S 

(mAU.s) 

Nồng độ 

IMI thu 

lại (ppm) 

% thu 

hồi (%) 

1 51,1 1357 50,9 99,7 

2 50,3 1346 50,4 100,3 

3 49,7 1328 49,1 98,7 

4 76,6 1624 75,8 98,9 

5 75,4 1608 75,1 99,6 

6 74,6 1587 73,6 98,7 

7 102,2 1908 102,3 100,1 

8 100,6 1886 101,3 100,7 

9 99,5 1851 98,7 99,2 

Trung 

bình 

(%) 

RSD (%) 

99,9 0,5 

100,5 0,9 

101,1 0,7 

Trung 

bình 

(%) 

RSD 

(%) 

99,5 0,8 

99,1 0,4 

100,0 0,7 






Nhận xét: Độ thu hồi của IMI <strong>và</strong> CIL trong 9 dung dịch đều nằm trong khoảng 98% 

đến 102% <strong>và</strong> RSD tại 3 mức nồng độ khoảng 80%, 100% <strong>và</strong> 120% đều nhỏ hơn 2,0. 

30 











Kết luận: Phương <strong>pháp</strong> đạt yêu cầu về độ đúng trong khoảng nồng độ khảo sát. 

3.3.6. Độ thô 

Để loại trừ sự ảnh hưởng của sai số trong quá trình cân, chỉnh pH <strong>và</strong> của bộ trộn, 

tiến hành khảo sát độ thô với ba thông số nồng độ đệm, pH <strong>và</strong> tỷ lệ pha động. Khoảng 

thay đổi của nồng độ đệm, pH <strong>và</strong> tỷ lệ pha động được khảo sát lần lượt là 5%, 4% <strong>và</strong> 3% 

so với điều kiện chạy mẫu đã lựa chọn. 

Dùng phần mềm Modde khảo sát sự thay đổi về nồng độ đệm, pH đệm <strong>và</strong> tỷ lệ pha 

động, tiến hành chạy mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm theo 11 chương trình do 

phần mềm thiết kế. 

Bảng 3.7 dưới đây là các thông số khảo sát <strong>và</strong> kết quả về độ thô. 

Thứ tự 

chạy 

C đệm 

(mM) 

pH 

đệm 

Bảng 3.7. Kết quả độ thô 

Tỷ lệ 

ACN:đệm 

phosphat 

31 

tR CIL 

(phút) 

SCIL 

(mAU.s) 

tR IMI 

(phút) 

SIMI 

(mAU.s) 

1 20 2,50 60:40 3,515 963,8 4,582 1497 

2 20 2,50 60:40 3,513 967,3 4,580 1495 

3 21 2,60 58:42 3,464 968,2 4,406 1460 

4 19 2,40 58:42 3,478 970,4 4,560 1537 

5 20 2,50 60:40 3,506 970,2 4,578 1477 

6 21 2,40 58:42 3,478 975,8 4,477 1523 

7 21 2,60 62:38 3,550 970,5 4,701 1502 

8 21 2,40 62:38 3,555 970,2 4,712 1487 

9 19 2,60 58:42 3,468 970,2 4,428 1454 

10 19 2,60 62:38 3,549 967,1 4,667 1418 

11 19 2,40 62:38 3,556 972,0 4,799 1496 

TB 3,512 969,6 4,590 1486 

RSD (%) 1,0 0,32 2,7 2,2 


Nhận xét: RSD của thời gian lưu <strong>và</strong> diện <strong>tích</strong> pic của IMI <strong>và</strong> CIL đều dưới 3,0%. 

Kết luận: Phương <strong>pháp</strong> đạt yêu cầu về độ thô khi thay đổi tỉ lệ pha động, nồng độ 

đệm, pH đệm. 















3.4. Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> chế phẩm trên thị trường 

Tiến hành: 

- Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm được khối lượng 

m1 = 23,6412 (g). Chuyển toàn bộ phần bột <strong>và</strong>o cốc thủy tinh khô <strong>và</strong> sạch, dùng bông 

tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ <strong>và</strong> nắp. Cân khối lượng vỏ được m2 = 22,5762. 

Khối lượng bột trong lọ mbột = m1-m2 = 1,065 g tương ứng với 500 mg IMI <strong>và</strong> 500 mg 

CIL. 

- Cân 3 mẫu thử độc lập với nhau từ chế phẩm Tienam (số lô SX: N023795). Tiến 

hành pha mẫu thử như mục 2.2.3 <strong>và</strong> chạy sắc ký với điều kiện như mục 3.2. 

Yêu cầu: 

- Hàm lượng <strong>imipenem</strong> từ 90,0% đến 115,0% so với lượng ghi trên nhãn [20]. 

- Hàm lượng <strong>cilastatin</strong> từ 90,0% đến 115,0% so với lượng ghi trên nhãn [20]. 

3.4.1. Công thức tính 

Hàm lượng có trong chế phẩm so với HLGTN: 

Trong đó: 

H(%) = 

St 

Sc x m c.P(%) 

HL 

x Dt 

Dc x 100% 

H(%): hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn 

St: Diện <strong>tích</strong> pic của IMI/ CIL trong mẫu thử (mAU.s) 

Sc: Diện <strong>tích</strong> pic của IMI/ CIL trong mẫu chuẩn (mAU.s) 

mc: Khối lượng chuẩn cân (mg) tính theo IMI/ CIL 

P(%): Hàm lượng của chuẩn (%) 

HL: Lượng chất ghi trên nhãn = m thử 

x 500 x 1000 (mg) 

m bột 

mbột = 1,0650 g 

mthử: khối lượng mẫu thử cân (g) 

Dt, Dc: Hệ số pha loãng của mẫu thử <strong>và</strong> mẫu chuẩn 

3.4.2. Kết quả định lượng 

Bảng 3.8 <strong>và</strong> 3.9 dưới đây là kết quả định lượng <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong>: 






32 











STT 

mthử 

(mg) 

Bảng 3.8. Kết quả định lượng <strong>imipenem</strong> trong chế phẩm 

mc IMI 

(mg) 

SIMI thử 

(mAU.s) 

SIMI chuẩn 

(mAU.s) 

P(%)I 

MI 

Dt Dc H(%)IMI 

1 10,8 10,6 1655 1511 93,74 3,3 3,3 107,3 

2 10,8 1662 3,3 3,3 107,8 

3 10,7 1693 3,3 3,3 110,8 

STT 

mthử 

(mg) 

Trung bình 108,6 

Bảng 3.9. Kết quả định lượng <strong>cilastatin</strong> trong chế phẩm 

mc CIL 

(mg) 

SCIL thử 

(mAU.s) 

SCIL chuẩn 

(mAU.s) 

P(%)I 

MI 

Dt Dc H(%)CIL 

1 10,8 11,6 1189 1215 95.54 3,3 3,3 100,8 

2 10,8 1196 3,3 3,3 101,4 

3 10,7 1178 3,3 3,3 100,8 

Trung bình 101,0 

Nhận xét: Hàm lượng <strong>imipenem</strong> <strong>và</strong> <strong>cilastatin</strong> trong chế phẩm Tienam (số lô SX: 

N023795) đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép. 

Kết luận: Chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lượng theo USP 38. 

3.5. Bàn luận chung 

3.5.1. Ưu điểm của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

Phương <strong>pháp</strong> đã khảo sát có những ưu điểm sau: 

- Thời gian <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> ngắn (dưới 5 phút). 

- Tiết kiệm dung môi ACN. 

- Kết quả thẩm định đạt tiêu chuẩn của ICH. 

- Có một số ưu điểm so với các nghiên cứu <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời IMI <strong>và</strong> CIL trước đó: 

+ So với kĩ thuật quang phổ đạo hàm, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đã tách riêng được tạp chất 

Thienamycin ra khỏi CIL <strong>và</strong> IMI với độ <strong>phân</strong> giải Rs > 1,5. 


+ So với kĩ thuật IPC quy định trong các dược điển, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> cho phép định lượng 

IMI <strong>và</strong> CIL mà không cần sử dụng chất tạo cặp ion. 





33 











+ So với nghiên cứu của N. Nakov, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có ưu điểm: Hệ số kéo đuôi của IMI 

<strong>và</strong> CIL lần lượt là 0,84 <strong>và</strong> 0,80. Hệ số chắn tại nồng độ 100% của IMI <strong>và</strong> CIL lần lượt 

là -0,08% <strong>và</strong> -0,06%. 

3.5.2. Nhược điểm của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

- Thời gian cân bằng cột lâu do cần có thời gian hình thành lớp dung môi thân nước 

trên bề mặt pha tĩnh. 

- Thời gian rửa cột lâu do sử dụng đệm phosphat. 






34 











4.1. Kết luận 

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 

Từ kết quả nghiên cứu, tôi đưa ra những kết luận sau: 

- Chuẩn bị mẫu tử <strong>và</strong> chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm trong hỗn hợp dung môi ACN : 

nước = 60:40 (v/v). 

- Điều kiện sắc ký: 

+ Cột pha tĩnh: Cột Hypersil Si 4,6 x 200 mm, 5 µm. 

+ Pha động: hỗn hợp ACN : đệm phosphat (20 mM, pH 2,5) = 60:40 (v/v). 

+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. 

+ Bước sóng phát hiện: 226 nm đối với CIL <strong>và</strong> 312 nm đối với IMI. 

+ Thể <strong>tích</strong> tiêm mẫu: 5µl. 

- Thẩm định quy trình theo hướng dẫn của ICH thu được kết quả đạt về các tiêu chí 

sau: 

+ Độ phù hợp hệ thống 

+ Độ chọn lọc 

+ Khoảng nồng độ tuyến tính 

+ Độ lặp lại 

+ Độ đúng 

+ Độ thô 

4.2. Kiến nghị 

Dựa trên kết quả nghiên cứu, tôi xin đưa ra một <strong>và</strong>i đề xuất như sau: 

- Tiến hành thẩm định độ tái lặp, độ ổn định của mẫu thử trong các điều kiện khắc 

nghiệt. 

- So sánh <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trên với <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chuẩn trong dược điển. 






35 











Tiếng Việt 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

1. Trần Tử An (2012), Hoá <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.181. 

2. Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, Hà Nội, tr.501-502-503- 

260. 

3. Bộ Y Tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam 4, Hà Nội, tr.1797-1799. 

4. Cục Quản lí Dược, Danh mục thuốc cấp số đăng ký từ năm 2010 đến tháng 

12/2015. 

(http://www.dav.gov.vn/default.aspx?action=detail&newsid=1141&type=3) 

5. Nguyễn Văn Kính (2010), Phân <strong>tích</strong> thực trạng: Sử dụng kháng sinh <strong>và</strong> kháng 

kháng sinh ở Việt Nam, Global Antibiotic Resistance Partnership, tr.29-47. 

6. Đỗ Thị Tuyết Nhung (2017), <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>phân</strong> <strong>tích</strong> đồng thời glycin, 

cystein <strong>và</strong> amoni glycyrrhizat bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC) 

không tạo dẫn xuất, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội. 

Tiếng Anh 

7. Buszewski B., Noga S. (2012), “Hydrophilic interaction liquid chromatography 

(HILIC) – a powerful separation technique”, Anal Bioanal Chem, 402, pp.231- 

247. 

8. Dejaegher B., Heyden Y.V. (2010), “HILIC methods in pharmaceutical analysis”, 

J. Sep. Sci., 33, pp.698-715. 

9. Forsyth R.J., Ip D.P. (1994), “Determination of <strong>imipenem</strong> and <strong>cilastatin</strong> sodium 

in Primaxin by first order derivative ultraviolet spectrophotometry”, Journal of 

pharmaceutical and biomedical analysis, 12(10), pp.1243-1248. 

10. Fu Q., Liang T., Zhang X. et al. (2010), “Carbohydrate separation by hydrophilic 

interaction liquid chromatography on a ‘click’ maltose column”, Carbohydrat 

Research, 345(18), pp.2690-2697. 

11. Hemström P., Irgum K. (2006), “Hydrophilic interaction 

chromatography”, Journal of separation science, 29(12), pp.1784-1821 


12. ICH (1996), Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology 

International Conference on Harmonization, Geneva. 

13. Japanese Pharmacopeia 16, pp.971. 















14. Malerod H., Rogeberg M., Tanaka N. et al. (2013), “Large volume injection of 

aqueous peptide samples on a monolithic silica based zwitterionic-hydrophilic 

interaction liquid chromatography system for characterization of posttranslational 

modifications”, Journal of Chromatography A, 1317, pp.129-137. 

15. Merck KGaA, “Particulate analytical HPLC columns (LiChrosorb®, 

Lichrospher®, Superspher®, Purospher® and Aluspher®) General information 

and Guidelines for Care and Use”. 

16. Nakov N., Petkovska R., Acevska J., Dimitrovska A. (2013), “Chemometric 

approach for optimization of HILIC method for simultaneous determination of 

<strong>imipenem</strong> and <strong>cilastatin</strong> sodium in powder for injection”, Journal of Liquid 

Chromatography & Related Technologies, pp.2-4-20. 

17. Parra A., Villanova J.G., Rodenas V., Gomez M.D. (1993), “First and secondderivative 

spectrofotometric determination of <strong>imipenem</strong> and <strong>cilastatin</strong> in 

injections”, J Pharm Biomed Anal, 11, pp.477-482. 

18. SeQuant A. (2008), Practical Guide to HILIC: A Tutorial and Application 

Book, Umea Sweden. 

19. Thermo Scientific, “HILIC Seperations Technical Guide: A Practiceal Guide to 

HILIC Mechanisms, Method Development and Troubleshooting”. 

20. USP 38 (2015), Imipenem and Cilastatin for injection. 

21. Valette J.C., Demesmay C., Rocca J.L. et al. (2004), “Separation of Tetracycline 

Antibiotics by Hydrophilic Interaction Chromatography Using an Amino-Propyl 

Stationary Phase”, Chromatographia, 59(1–2), pp.55–60. 

22. Yunsheng Hsieh (2008), “Potential of HILIC-MS in quantitative bioanalysis 

ofdrugs and drug metabolites”. 

23. https://www.drugbank.ca/drugs/DB01597, accessed on 11/01/2018. 




















PHỤ LỤC 

Phụ lục 1. Chuẩn bị mẫu <strong>và</strong> dung môi pha động 

Chuẩn bị mẫu 

- Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước <strong>và</strong>o bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa 

đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40. 

- Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat <strong>và</strong>o bình định 

mức 100,0 ml. Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung 

dịch natri bicarbonat 120 ppm. Hút 0,50 ml dung dịch này <strong>và</strong>o bình định mức 10,00 ml, 

bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách 

pha mẫu của DĐVN V [2]). 

- Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI <strong>và</strong> 22,2 mg 

CIL natri <strong>và</strong>o hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm 

ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI <strong>và</strong> CIL nồng độ 2000 ppm. 

Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm. 

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000 

ppm <strong>và</strong>o bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được 

dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất. Từ dung dịch này, 

dùng pipet chính xác <strong>và</strong> bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm, 

200 ppm, 150 ppm, 100 ppm <strong>và</strong> 75 ppm. 

- Dung dịch mẫu thử: 

+ Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ 

nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g). Chuyển toàn bộ phần bột <strong>và</strong>o cốc thủy tinh 

khô <strong>và</strong> sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ <strong>và</strong> nắp. Cân khối 

lượng vỏ được m2 (g). Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với 

500 mg IMI <strong>và</strong> 500 mg CIL. 

+ Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam <strong>và</strong>o bình định mức 10,00 ml, 

hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có 

nồng độ khoảng 500 ppm của IMI <strong>và</strong> CIL. Hút 1,50 ml dung dịch thử trên <strong>và</strong>o bình 


định mức 5,00 ml; bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử 150 ppm. 

- Các dung dịch trên được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở -80 o C. 





PL-1 











Chuẩn bị dung môi pha động: 

Dung dịch đệm phosphat 20 mM (pH 2,50): Cân chính xác 1,6320 g KH2PO4 <strong>và</strong>o 

cốc có mỏ 100 ml, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần. Rót <strong>và</strong>o bình định mức 500,0 

ml, thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Chỉnh đến pH 2,50 bằng dung dịch H3PO4 20 mM 

(210 µl H3PO4 đặc pha trong 200 ml nước trong bình định mức). 

Phụ lục 2: Sắc kí đồ 

Sắc kí chuẩn hỗn hợp 150 ppm chạy trên cột Ascentis Silica với các pha động 

1. ACN : đệm phosphat 5 mM, pH 6,80 = 70:30, 1 ml/phút 

226 nm 

312 nm 

2. ACN : CH3COOH 0,1% = 70:30, 1 ml/phút 

226 nm 

312 nm 

CIL 

CIL 


IMI 

IMI 

IMI 

IMI 





PL-2 








3. ACN : HCOOH 10 mM = 70:30, 1 ml/phút 

CIL 

226 nm IMI 




312 nm 

4. ACN : H3PO4 0,1% = 70:30, 1 ml/phút 

226 nm 

312 nm 

5. ACN : nước = 70:30, tốc độ 1 ml/phút 

226 nm nm 

312 nm 

CIL 


CIL 

IMI 

IMI 

IMI 





PL-3 








Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ở bước sóng 226 nm 




Lần 1 

Lần 2 

Lần 3 

Lần 4 

Lần 5 

Lần 6 


CIL 

CIL 

CIL 

CIL 

CIL 

CIL 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 





PL-4 








Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ở bước sóng 312 nm 




Lần 1 

Lần 2 

Lần 3 

Lần 4 

Lần 5 

Lần 6 


IMI 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 





PL-5 








Sắc kí đồ độ chọn lọc ở bước sóng 226 nm 





Placebo 

Chuẩn đơn CIL 

Chuẩn hỗn hợp 

Mẫu thử 


CIL 

CIL 

CIL 

IMI 

IMI 





PL-6 








Sắc kí đồ độ chọn lọc ở bước sóng 312 nm 





Placebo 

Chuẩn đơn IMI 

Chuẩn hỗn hợp 

Mẫu thử 


IMI 

IMI 

IMI 





PL-7 








Sắc kí đồ khoảng tuyến tính ở bước sóng 226 nm 




75 ppm 

100 ppm 

150 ppm 

200 ppm 

250 ppm 


CIL 

CIL 

CIL 

CIL 

CIL 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 





PL-8 








Sắc kí đồ khoảng tuyến tính ở bước sóng 312 nm 




75 ppm 

100 ppm 

150 ppm 

200 ppm 

250 ppm 


IMI 

IMI 

IMI 

IMI 

IMI 





PL-9

Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?