XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ 

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN 

---------- 

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM 

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ 

THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG 

PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

(HPLC) 

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC 

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC 

2015 

1



---------- 

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM 

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ 

THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG 

PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO 

(HPLC) 

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC 

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC 

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 

Ts. NGUYỄN THỊ THU THỦY 

CN. La Văn Thái 

CN. Bùi Thị Quỳnh Hoa 

2015 

2

https://twitter.com/daykemquynhon 

plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

https://daykemquynhon.blogspot.com 

Trƣờng Đại Học Cần Thơ 

Khoa Khoa Học Tự Nhiên 

Bộ Môn Hóa Học 

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam 

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc 

---------- 

http://daykemquynhon.ucoz.com 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / 

Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định 

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 

1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy 

2. Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine 

trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng 

cao (HPLC). 

3. Sinh viên thực hiện:Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424 

Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38 

4. Nội dung nhận xét: 

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp 

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Những vấn đề còn hạn chế: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Kết luận, đề nghị và điểm: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015 

Cán bộ hướng dẫn 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÝ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM 

HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO) 

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/ 

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy 

3 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial





Trƣờng Đại Học Cần Thơ 

Khoa Khoa Học Tự Nhiên 

Bộ Môn Hóa Học 

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam 

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc 

---------- 




NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN 

1. Cán bộ phản biện:...................................................................................... 

2. Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine 

trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng 

cao (HPLC) 

3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Ngọc Châm MSSV: B1203424 

Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38 

4. Nội dung nhận xét: 

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp 

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Những vấn đề còn hạn chế: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 

Kết luận, đề nghị và điểm: 

.............................................................................................................................. 

.............................................................................................................................. 


Cán bộ phản biện 






4 











____________ 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 



___________________________ 

Năm học 2015 – 2016 

Đề tài: “XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ 

THREONINETRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC) 

LỜI CAM ĐOAN 

Em tên: Nguyễn Thị Ngọc Châm tác giả của luận văn này, em xin cam 

đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của riêng 

em, các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp 

nào khác và đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng chấm bảo vệ luận 

văn. 

Trưởng chuyên ngành 

Luận văn tốt nghiệp đại học 

Chuyên nghành: Hóa Dược 

Đã bảo vệ và được duyệt 

Hiệu trưởng: ................................................. 

Trưởng khoa: ............................................... 


Nguyễn Thị Ngọc Châm 

Cán bộ hướng dẫn 






5 

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy 











LỜI CẢM ƠN 

---- 

Trong suốt quá trình học tập, rèn luyện tại Trường Đại học Cần Thơ 

cùng với quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, dưới sự quan tâm, giúp đỡ và 

tận tình chỉ dẫn từ quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè, em đã học hỏi được rất 

nhiều kiến thức từ sách vỡ, cũng như kinh nghiệm thực tiễn rất bổ ích cho bản 

thân. Để có được thành quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc 

đến: 

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Khoa học 

tự nhiên cùng tất cả quý Thầy Cô đã giảng dạy những kiến thức quý báu cho 

em trong suốt quá trình học tập của mình. 

Ban lãnh đạo Trung tâm Phân Tích và Giám định Vinacert Control – Cần 

Thơ, đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về hóa chất, thiết bị, dụng cụ để giúp em 

hoàn thành tốt nhất luận văn này. 

Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy. 

Cảm ơn cô đã truyền dạy những kiến thức sâu rộng của mình, tận tình hướng 

dẫn cùng với sự quan tâm ân cần, âm thầm hỗ trợ và động viên tinh thần, cô đã 

tạo mọi điều kiện tốt nhất để em vượt qua mọi khó khăn và hoàn thành luận 

văn của mình. Xin gửi đến cô lời cảm ơn sâu sắc nhất! 

Xin gửi lời cảm ơn đến Ts. Tôn Nữ Liên Hƣơng, đã dẫn dắt em và lớp 

Cử nhân Hóa Dược Khóa 38 trong suốt 4 năm học tại trường. Cảm ơn cô đã 

truyền lại những kiến thức quý báu về chuyên ngành cũng như sự quan tâm 

sâu sắc và tận tụy, giúp chúng em vượt qua mọi rào cản khó khăn trong học 

tập. 

Cảm ơn CN. La Văn Thái – Trưởng phòng thí nghiệm Trung tâm Phân 

Tích và Giám định Vinacert Control – Cần Thơ, CN. Bùi Thị Quỳnh Hoa – 

kiểm nghiệm viên phòng phân tích sắc ký và các anh chị tại công ty, đã nhiệt 

tình hướng dẫn, chia sẽ kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực 

hiện đề tài tại đây. 

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã yêu 

thương, chăm sóc và hỗ trợ con trong suốt quãng thời gian học tập, là chỗ dựa 

tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện 

để con hoàn thành chương trình học của mình. Cám ơn bạn bè và mọi người 

xung quanh đã luôn đồng hành, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học 

tập. 






i 











TÓM TẮT 

Để đảm bảo sự cân bằng giữa các amino acid trong sản phẩm thức ăn 

chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng các amino acid bằng 

các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao , đề tài tiến hành phân tích 

định lượng lysine, methionine và threonine là các amino acid thiết yếu 

thường được phối trộn trong thức ăn chăn nuôi nhằm tăng tốc độ sinh trưởng 

và năng suất sản xuất của vật nuôi, phương pháp ứng dụng phân tích bằng 

máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu thức ăn chăn nuôi được thủy 

phân với dung dịch HCl 6M (103 ◦ C trong 24 giờ) và tạo dẫn xuất tiền cột với 

ortho-phthaladehyde với sự có mặt của tác chất 3-mercaptopropanoic acid 

tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang mạnh, quá trình tạo dẫn 

xuất tiền cột được tự động hóa với thiết bị bơm và lấy mẫu tự động 

(autosampler), sự phân tách được thực hiện trên cột Agilent Zorbax Eclipse- 

AAA (4,6 150 mm, 5 m) và được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng 

( 338nm. 

Phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao (sự sai khác về thời gian lưu 

trên mẫu thử và mẫu chuẩn nhỏ hơn 4 %), khoảng tuyến tính rộng (3 - 150 

ppm, R 2 > 0,995), phương pháp có độ chụm đạt (RSD = 2,6 % với lysine, 2,5 

% với methionine, 0,8 % với threonine ). Giới hạn phát hiện và giới hạn định 

lượng thấp (Lysine: LOD = 1,131 ppm; LOQ = 3,392 ppm, Methionine: LOD 

= 1,343 ppm; LOQ = 4,029 ppm, Threonine: LOD = 1,593 ppm; LOQ = 

4,779 ppm). Kết quả phân tích độ đúng trên mẫu thử có kết quả khá chính xác 

với độ lệch chuẩn tương đối của mẫu nguyên liệu lysine đạt (RSD = 1,03 %), 

độ chệch (bias) đạt -1,43 %. Kết quả phân tích thu được hàm lượng phù hợp 

với tỉ lệ phối trộn trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng lysine khoảng 0,53 – 

1,89 %, methionine 0,25 – 0,52 % và threonine 0,32 – 1,44 %. 

Từ khóa: amino acid, thức ăn chăn nuôi, sắc ký lỏng hiệu năng cao 

(HPLC), tạo dẫn xuất tiền cột với OPA. 






ii 








MỤC LỤC 




LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i 

TÓM TẮT .......................................................................................................... ii 

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ vi 

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vii 

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... viii 

DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT ................................................................... ix 

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU .............................................................................. 2 

1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 2 

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................. 3 

1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 3 

CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 

2.1 Khái quát về amino acid ........................................................................... 4 

2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid ........................................................ 4 

2.1.2 Phân loại amino acid ......................................................................... 4 

2.1.3 Tính chất vật lý .................................................................................. 8 

2.1.4 Tính chất hóa học .............................................................................. 9 

2.2 Lysine ..................................................................................................... 11 

2.2.1 Giới thiệu về lysine ......................................................................... 11 

2.2.2 Tác dụng của Lysine ........................................................................ 12 

2.3 Methionine ............................................................................................ 13 

2.3.1 Giới thiệu về Methionine................................................................. 13 

2.3.2 Tác dụng của methionine ................................................................ 13 

2.4 Threonine ............................................................................................... 14 

2.4.1 Giới thiệu về threonine .................................................................... 14 

2.4.2 Tác dụng của threonine ................................................................... 15 


2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid ......................................... 15 

2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy ................................................................. 15 

2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................ 17 

2.5.3 Phương pháp sắc ký khí .................................................................. 17 

iii 















2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................... 17 

2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 18 

2.6.1 Khái niệm ........................................................................................ 18 

2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký ................................................. 18 

2.6.3 Phân loại .......................................................................................... 19 

2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 20 

2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định ........................................................... 22 

2.8 Thủy phân protein .................................................................................. 23 

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .... 25 

3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm .................................................................... 25 

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm ........................................................................ 25 

3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm ....................................................... 25 

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................... 25 

3.1.4 Hóa chất ........................................................................................... 25 

3.1.5 Đối tượng thí nghiệm ...................................................................... 26 

3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 26 

3.2.1 Chuẩn bị mẫu ................................................................................... 26 

3.2.2 Khảo sát thời gian lưu ..................................................................... 26 

3.2.3 Xây dựng đường chuẩn dựa trên khoảng tuyến tính ....................... 27 

3.2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện ............................................................. 29 

3.2.5 Khảo sát giới hạn định lượng ......................................................... 30 

3.2.6 Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) ............................................... 31 

3.3 Thực nghiệm .......................................................................................... 36 

3.3.1 Quy trình xử lý mẫu và phân tích trên HPLC ................................. 36 

3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, pha động và dung dịch phân tích .. 36 

3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC .............................................................. 39 

3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lưu của mẫu chuẩn lysine, methionine 

và threonine .............................................................................................. 40 

3.3.5 Xây dựng đường chuẩn ................................................................... 40 


3.3.6 Xác định giới hạn phát hiện............................................................. 40 

3.3.7 Xác định giới hạn định lượng ......................................................... 40 

3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phương pháp ...................... 40 





iv 








3.3.9 Tiến hành thí nghiệm trên mẫu ....................................................... 41 

3.3.10 Công thức tính toán kết quả .......................................................... 41 




CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 42 

4.1 Kết quả khảo sát thời gian lưu ............................................................... 42 

4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn ............................................................. 42 

4.3 Giới hạn phát hiện .................................................................................. 44 

4.4 Giới hạn định lượng ............................................................................... 44 

4.5 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ................................... 44 

4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp ................................... 44 

4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ................................... 45 

4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử .............................................................. 46 

CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 48 

4.1 Kết luận .................................................................................................. 48 

4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 49 

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 50 

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 51 






v 








DANH MỤC BẢNG 




Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp ............................................................... 7 

Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 

.......................................................................................................................... 33 

Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ....... 35 

Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu ............................... 35 

Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích ............ 39 

Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine và threonine ..................... 40 

Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid ....................... 42 

Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính ............ 42 

Bảng 4.3 RSD (%) của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi ........ 44 

Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi ................ 45 

Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi ........... 45 

Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu........................................ 45 

Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu 

nguyên liệu ....................................................................................................... 46 

Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong 

thức ăn chăn nuôi ............................................................................................. 46 

Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine .................... 47 






vi 











DANH MỤC HÌNH 

Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid .......................................... 4 

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I ......................................... 5 

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II ........................................ 5 

Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III ...................................... 6 

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV ...................................... 6 

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V ....................................... 6 

Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid ..................................................... 9 

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid ....... 9 

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid ............................ 10 

Hình 2.10 Phản ứng Sorensen ......................................................................... 10 

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure ....................................................................... 11 

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein ......................................................... 11 

Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine ......................... 12 

Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine ................. 13 

Hình 2.15 Công thức các dạng đồng phân lập thể của threonine .................. 14 

Hình 2.16 Mô tả sắc ký giấy đi lên ................................................................. 16 

Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên ............................................ 16 

Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm .................. 18 

Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ........................................................ 20 

Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA ........................................................... 22 

Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA ............................... 23 

Hình 3.1 Thời gian lưu trên sắc ký đồ ............................................................ 27 

Hình 3.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc ............................................ 28 

Hình 3.3 Minh họa tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu. ............................................. 30 

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC ...... 36 

Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine ................................... 42 

Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine .......................... 43 

Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine ............................. 43 






vii 








DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 




2-ME 

3-MPA 

ACN 

AOAC 

AQC 

HPLC 

LOD 

LOQ 

Lys 

mAu 

MeOH 

Met 

Min 

NRC 

OPA 

pI 

RSD 

S/N 

SKPB 

SKPĐ 

SKPT 

TCVN 

Thr 

USFDA 

2 – Mercaptoethanol 

3 – Mercaptopropanoic acid 

Acetonitrile 

Association of analytical comunities 

6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate 

High perfomance liquid chromatography 

Limit of detection 

Limit of quantitation 

Lysine 

Milli absorbance units 

Methanol 

Methionine 

Minute 

National Reasearch Council 

ortho-Phthaladehyde 

Isoelectric point 

Relative standard deviation 

Signal to Noise 

Sắc ký phân bố 

Sắc ký pha đảo 

Sắc ký pha thường 

Tiêu chuẩn Việt Nam 

Threonine 

United States Food and Drug Administration 






viii 








DANH MỤC ĐƠN VỊ VIẾT TẮT 




◦ C 

g 

Kg 

L 

mg 

mL 

ppb 

ppm 

Celcius degree 

gram 

Kilogram 

Liter 

Milligram 

Milliliter 

parts per billion 

parts per million 

Microgram 

Microliter 






ix 








CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 




1.1 Đặt vấn đề 

Hiện nay, chăn nuôi đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp hiện 

đại ở nước ta. Trong năm 2014, ngành chăn nuôi đạt 24,5% trong tổng giá trị 

sản xuất nông nghiệp, là một trong hai nguồn cung cấp lương thực – thực 

phẩm chủ yếu cho đời sống người dân bên cạnh ngành trồng trọt. Chăn nuôi 

cũng là một mắt xích quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững, góp 

phần tạo việc làm, tăng thu nhập cho người dân. Như chúng ta đã biết, ngành 

chăn nuôi là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho con người, các sản phẩm 

chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp protein và có hàm lượng cao 

hơn các thức ăn có nguồn gốc thực vật. Vì vậy, thực phẩm từ chăn nuôi có giá 

trị dinh dưỡng cao đối với đời sống con người. Để đáp ứng nhu cầu đó, đối với 

ngành chăn nuôi ngoài yếu tố cần có chất lượng con giống tốt, chúng ta cũng 

cần đảm bảo các yếu tố dinh dưỡng cho vật nuôi bằng việc cung cấp đầy đủ 

thức ăn và cân bằng giữa các yếu tố dinh dưỡng. Thị trường thức ăn chăn nuôi 

hiện nay ở nước ta rất đa dạng, các nhà sản xuất đã nghiên cứu và phát triển ra 

những dòng sản phẩm thức ăn chăn nuôi bổ sung đầy đủ các thành phần như: 

protein, amino acid, carbohydrate và các thành phần quan trọng khác như: 

vitamin, khoáng đa lượng và vi lượng,... Trong đó, việc bổ sung và cân đối 

hàm lượng amino acid là rất quan trọng. Vì amino acid là nhân tố không thể 

thiếu trong thức ăn chăn nuôi, nó giữ vai trò quan trọng đối với cơ thể gia súc, 

gia cầm. Thêm vào đó, amino acid là một trong những dưỡng chất quan trọng 

trong quá trình sinh trưởng, tạo ra sản phẩm và nâng cao hiệu quả, hiệu suất sử 

dụng thức ăn của vật nuôi, giúp nâng cao tốc độ tăng trưởng và chất lượng thịt 

của gia súc, gia cầm mà không dùng đến các chất kích thích tăng trọng họ β – 

agonist bị cấm sử dụng trong chăn nuôi. 

Đối với gia súc và gia cầm, các loại amino acid đặc biệt quan trọng cần 

cung cấp hằng ngày gồm: methionine, lysine, threonine. Trong đó, 

methionine, lysine, threonine là các loại amino acid thiết yếu mà cơ thể động 

vật không thể tự tổng hợp được, phải lấy từ thức ăn bên ngoài. Do vậy, cần 

cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng và amino acid trong khẩu phần ăn theo 

đúng nhu cầu cho từng loại vật nuôi nhằm tăng khả năng sinh trưởng, phát 

triển và chất lượng thịt của gia súc và gia cầm. 

Để xác định hàm lượng và đảm bảo cân bằng tỉ lệ các thành phần dinh 

dưỡng nói chung và amino acid nói riêng, bằng các phương pháp phân tích 

hóa học hiện đại, ta có thể định lượng và đánh giá thành phần các amino acid 

trong thức ăn chăn nuôi một cách dễ dàng mà vô cùng chính xác. 






2 











Do vậy, đề tài “Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine 

trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 

(HPLC)” nhằm khảo sát quy trình định lượng các loại amino acid nói chung 

và lysine, methionine, threonine nói riêng, góp phần xác định thành phần dinh 

dưỡng và đánh giá chất lượng các sản phẩm thức ăn chăn nuôi bằng một 

phương pháp phổ biến, có độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp. Từ đó, 

có thể ứng dụng vào thực tiễn để làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về 

nhu cầu protein, amino acid của người và động vật, cũng như góp phần làm 

hoàn thiện các phương pháp phân tích protein. 

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 

- Tìm điều kiện tối ưu về quy trình xử lý mẫu, quy trình định lượng 

lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc 

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 

- Áp dụng và ổn định phương pháp phân tích amino acid trong thức ăn 

chăn nuôi từ đó đánh giá được chất lượng một số loại thức ăn chăn nuôi được 

bán trên thị trường ở thành phố Cần Thơ. 

1.3 Nội dung nghiên cứu 

Phân tích định tính: lysine, methionine, threonine dựa vào thời gian lưu 

của mẫu chuẩn và mẫu thử từ kết quả phân tích trên HPLC. 

Phân tích định lượng: Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện 

(LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn (RSD), độ chính xác của 

phương pháp. 

Tiến hành phân tích định lượng lysine, methionine, threonine trên mẫu 

thức ăn chăn nuôi tại địa bàn Thành phố Cần Thơ. 






3 








CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 




2.1 Khái quát về amino acid 

2.1.1 Giới thiệu chung về amino acid 

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein, hormone và enzyme,…là 

hợp chất hữu cơ mà trong phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxylic (–COOH) 

và một nhóm amine (–NH 2 ) trừ proline chỉ có nhóm NH (được gọi là imino 

acid). Trong phân tử amino acid đều có các nhóm –NH 2 và –COOH gắn với 

carbon ở vị trí . 

Hình 2.1 Công thức cấu tạo chung của amino acid 

Trong tự nhiên có khoảng 150 loại amino acid khác nhau nhưng chỉ có 20 

loại trong số chúng tham gia cấu tạo nên phân tử protein. Hầu hết các protein 

khi thủy phân đều thu được dưới dạng L-α-amino acid. Như vậy các amino 

acid chỉ khác nhau ở mạch nhánh hay còn gọi là chuỗi bên (Kí hiệu: R). 

2.1.2 Phân loại amino acid [1] 

Có nhiều cách để phân loại amino acid, mỗi loại đều có ý nghĩa và mục 

đích riêng. Tuy nhiên, có thể phân loại amino acid một cách chung nhất theo 

hai quan điểm: quan điểm hóa học và quan điểm sinh vật học. 

 

 

- Quan điểm hóa học (xét về cấu tạo phân tử, hóa tính): có thể chia 

amino acid ra thành các nhóm. 

Amino acid mạch thẳng: Dựa vào số lượng nhóm –NH 2 và –COOH 

mà lại chia ra thành: 

Acid monoamine – monocarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm – 

NH 2 và 1 nhóm –COOH). 

Acid monoamine – dicarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm –NH 2 

và 2 nhóm –COOH). 

Diamine – monocarboxylic (amino acid chứa 2 nhóm –COOH 

và 1 nhóm –NH 2 ). 


Amino acid mạch vòng: gồm 2 loại đồng vòng và dị vòng. 





4 











Ngoài ra, dựa vào tính chất của gốc R người ta còn phân loại amino acid 

thành 5 nhóm: nhóm không phân cực (nhóm kỵ nước), nhóm phân cực nhưng 

không tích điện, nhóm tích điện dương, nhóm tích điện âm và nhóm R là nhân 

thơm. 

Nhóm I. Gồm 7 amino acid có gốc R không phân cực kỵ nước: 

glycine, alanine, proline, leucine, isoleucine, valine, methionine. 

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I 

Nhóm II. Gồm 3 amino acid có R là nhân thơm: phenylalanine, 

tyrosine, tryptophan. 

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II 

Nhóm III. Gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: 

serine, threonine, aspargine, cystein, glutamine. 






5 











Hình 2.4 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm III 

Nhóm IV. Gồm 3 amino acid có gốc R tích điện dương: lysine, 

histindine, arginine. 

Hình 2.5 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm IV 

Nhóm V. Gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate, 

glutamate. 

Hình 2.6 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm V 


- Quan điểm sinh vật học (xét về tầm quan trọng đối với dinh dưỡng động 

vật) được chia thành 2 loại: 





 

Amino acid không thay thế được hay còn gọi là amino acid thiết yếu: 

đây là amino acid rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cơ thể 

6 











 

động vật. Cơ thể động vật không thể tự tổng hợp được loại amino acid 

này mà phải bổ sung vào cơ thể hằng ngày bằng thức ăn. 

Đối với người trưởng thành có 8 loại amino acid thiết yếu: lysine, 

valine, methionine, threonine, tryptophan, leucine, isoleucine, 

phenylalanine. 

Đối với trẻ em, do quá trình sinh tổng hợp trong cơ thể chưa hoàn 

chỉnh nên ngoài 8 amino acid thiết yếu trên còn cần thêm 2 amino 

acid là arginine và histidine. 

Amino acid thay thế được hay còn gọi là amino acid không thiết yếu: là 

amino acid mà cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được từ các nguyên 

liệu sẵn có. Nhóm này gồm các amino acid còn lại. 

Theo nhiều nghiên cứu, tuy tyrosine và cystein là các amino acid không 

thiết yếu cơ thể có thể tổng hợp được nhưng với điều kiện phải có 

phenylalanine cơ thể mới có thể tổng hợp được tyrosine và phải có methionine 

mới tổng hợp được cystein. Do vậy, nếu trong khẩu phần ăn của người và 

động vật nếu không bổ sung đầy đủ phenylalanine và methionine sẽ dẫn đến 

thiếu hụt tyrosine và cystein. 

Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein còn có một 

số amino acid khác, đó là những loại ít gặp. Các amino acid này là dẫn xuất 

của những amino acid thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4 – 

hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5 – hydrogenxylysine là dẫn xuất 

của lysine... Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein, nhưng có rất 

nhiều loại amino acid khác thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp chất 

khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản 

phẩm trung gian của quá trình chuyển hoá trong cơ thể sinh vật. 

Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp 

Tên amino 

acid 

Glycine 

Alanine 

Proline 

Valine 

Leucine 

Isoleucine 

Methionine 

Tên amino acid gọi theo danh 

pháp hoá học 

-aminoacetic 

-aminoprpionic 

-pirolidincarboxylic 

-aminoiaovaleric 

-aminonoisocaproic 

-amino--metylvaleric 

-amino--metyltiobutiric 

Tên 

viết 

tắt 

Gly 

Ala 

Pro 

Val 

Leu 

Ile 

Met 

Ký 

hiệu 

G 

A 

P 

V 

L 

I 

M 

Khối 

lượng 

(M) 


75 

89 

115 

117 

131 

131 

149 





7 











Phenylalanine 

Tyrosine 

Tryptophan 

Serine 

Threonine 

Cysteine 

Aspargine 

Glutamine 

Lysine 

Histidine 

Arginine 

Aspartate 

Glutamate 

-amino--phenylpropionic 

-amino--idolylpropionic 

-amino--hydoxypropionic 

-amino-hydrogengenxyphenylpropionic 

-amino-hydrogengenxybutiric 

-amino--tiopropionic 

amide của aspartate 

amide của glutamate 

, diaminocaproic 

-amino--imidazolpropionic 

-amino--guanidinvaleric 

-aminosucinic 

-aminoglutarate 

2.1.3 Tính chất vật lý [1] 

Màu sắc và mùi vị: 

Phe 

Tyr 

Trp 

Ser 

Thr 

Cys 

Asn 

Gln 

Lys 

His 

Arg 

Asp 

Các amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như 

glycine, alanine, valine, serine, histidine, tryptophan; một số loại có vị đắng 

như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là 

mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate). 

Tính tan trong nước: 

Các amino acid thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether 

(trừ proline và hydrogenxyproline). Chúng cũng dễ hòa tan trong acid và kiềm 

loãng (trừ tyrosine). 

Tính quang học 

Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ 

glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm 

quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải 

được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc 

hiệu của amino acid phụ thuộc vào pH của môi trường. Tuỳ theo sự sắp xếp 

trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các amino 

acid có cấu trúc dạng D hay L (Hình 2.7) gọi là đồng phân lập thể. Số đồng 

phân lập thể được tính theo 2 n (n là số carbon bất đối). 


Glu 

F 

Y 

W 

S 

T 

C 

B 

Q 

K 

H 

R 

D 

E 

165 

181 

204 

105 

119 

121 

132 

146 

146 

155 

174 

133 

147 





8 











L-Amino acid 

D-Amino acid 

Hình 2.7 Đồng phân lập thể của amino acid 

Hầu hết các amino acid khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng ( ) khoảng từ 

220 - 280 nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10 -3 M, trong bước sóng khoảng 280 nm 

tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ 

của tyrosine và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa 

tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein. 

2.1.4 Tính chất hóa học [2] 

Amino acid có tính lưỡng tính 

Do trong phân tử có cả nhóm amino (–NH 2 ) và nhóm carboxylic (–COOH) 

vừa có khả năng nhận proton (H + ) thể hiện tính base, vừa có khả năng nhường 

proton thể hiện tính acid. 

Dạng ion lƣỡng cực 

Dạng phân tử 


Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid 





9 











Phản ứng với ninhydrin 

Khi đun nóng amino acid với ninhydrin tạo phức màu xanh tím (trừ proline 

cho màu vàng).Các nhà phân tích cũng lợi dụng tính chất này để định lượng 

amino acid bằng cách định lượng khí NH 3 , CO 2 hoặc aldehyde vừa tạo thành 

từ phản ứng. 

2 x ninhydrin 

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid 

Phản ứng Sanger 

Amino acids 

Đây là một phương pháp phổ biến nhất được ứng dụng để xác định amino 

acid trong mạch polypeptide từ đầu N. 

Khi nghiên cứu tính chất hóa học của amino acid ta phát hiện ra rằng nhóm 

α– amine có khả năng trùng hợp với dinitrobenzene. Trong mạch chỉ có một 

nhóm α– amine tự do ở đầu N, khi trùng hợp sẽ tạo thành dinitropheny – 

polypeptide. Liên kết này rất bền, do đó khi dùng HCl thủy phân protein sẽ 

giải phóng ra tất cả các amino acid tự do cùng với amino acid liên kết với 

dinitrobenzene dưới dạng dinitrophenyl – amino acid. Sau đó, với phương 

pháp sắc ký ta có thể định danh amino acid đó. 

Phản ứng Sorensen (phản ứng với aldehyde formic – formalin) 

Amino acid Formalin Hợp chất vinyl của amino acid 

Hình 2.10 Phản ứng Sorensen 

Phức xanh tím 


Ứng dụng: bằng cách chuẩn độ với dung dịch kiềm tiêu chuẩn người ta có 

thể định lượng được hàm lượng các amino acid có trong dung dịch. 





10 








Phản ứng với kim loại nặng 




Phức Biure có màu đỏ tím 

Hình 2.11 Phản ứng màu Biure 

Các amino acid có khả năng phản ứng với các kim loại nặng, tạo thành hợp 

chất phức nội phân tử với các muối của kim loại đó, đặc biệt là với ion Cu 2+ , 

phản ứng tạo thành phức chất Biure có màu đỏ tím. 

Ngoài ra, do các amino acid có cấu tạo gốc R khác nhau, nên người ta có 

thể dùng để xác định từng amino acid riêng rẽ nhờ phản ứng đặc trưng của nó, 

ví dụ phản ứng oxy hoá khử do nhóm –SH của cysteine, phản ứng tạo muối do 

các nhóm –COOH hay –NH 2 của glutamte hay lysine, phản ứng tạo ester do 

nhóm OH của tyrosine... 

2.2 Lysine [3] 

Oxy hóa 

Khử 

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein 

2.2.1 Giới thiệu về lysine 

- Lysine (viết tắt là Lys hoặc K). Tên khoa học: 2,6-diaminohexanoic acid. 

- Lysine là một α-amino acid chứa hai nhóm –NH 2 và một nhóm –COOH 

với công thức phân tử: C 6 H 14 N 2 O 2 . 

- Công thức hóa học: HOOCCH(NH 2 )(CH 2 ) 4 NH 2 . 

- Nó là một amino acid thiết yếu, cơ thể không thể tự tổng hợp được. 

Trong cấu tạo phân tử có chứa một carbon bất đối xứng nên chúng có hai 

dạng đồng phân quang học: D-Lysine và L-Lysine. Hai đồng phân này có 






11 











tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng 

phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học 

của chúng hoàn toàn khác nhau và cơ thể sinh vật chỉ hấp thu được dạng 

L-Lysine. 

L-Lysine 

Hình 2.13 Công thức các dạng đồng phân lập thể của lysine 

- Điểm đẳng điện ở pI = 9,74 

- Khối lượng phân tử: 146,189 g/mol 

- Nhiệt độ nóng chảy (T ◦ nc): 224 ◦ C. 

D-Lysine 

- Lysine là một amino acid thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con 

đường trao đổi chất phân nhánh. Qua con đường này còn có methionine, 

threonine, isoleucine cũng được tạo thành. 

- Lysine tồn tại ở dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân 

hủy ở 200-300 ◦ C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrine. 

- Lysine có nhiều trong trứng, thịt, sữa, cá, đậu nành… nhưng dễ bị phá 

huỷ trong quá trình chế biến, nấu nướng thức ăn. 

2.2.2 Tác dụng của Lysine 

- Lysine là một amino acid rất cần cho hoạt động sống của người và động 

vật. Nghĩa là cơ thể không tự tổng hợp được nó, phải lấy từ nguồn thức 

ăn bên ngoài (chúng thuộc loại amino acid thiết yếu). Lysine giữ vai trò 

sống còn trong sự tổng hợp protein. Nó là chìa khoá trong việc sản xuất 

các enzyme, hormone và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề 

kháng và chống trả với bệnh tật, đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi 

khuẩn gây bệnh. 

- Lysine cần thiết cho sự phát triển xương của trẻ, hỗ trợ sự hấp thụ calci, 

duy trì sự cân bằng nitơ trong cơ thể. 

- Lysine giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá và hấp thu tối đa chất 

dinh dưỡng và phát triển chiều cao. 

- Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ khó hoạt động bình 

thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm 

lớn, trí tuệ phát triển kém, dễ thiếu men tiêu hoá và nội tiết tố. Chính vì 






12 











thế lysine là một loại amino acid thường được thêm vào khẩu phần ăn 

của trẻ em và của gia súc. 

2.3 Methionine [4] 

2.3.1 Giới thiệu về Methionine 

- Methionine (viết tắt là Met hay M). Tên khoa học: 2-amino-4- 

(methylthio)butanoic acid. 

- Methionine là một -amino acid chứa lưu huỳnh. Có công thức phân tử: 

C 5 H 11 NO 2 S. 

- Công thức cấu tạo: H 3 CS(CH 2 ) 2 CH(NH 2 )COOH. 

- Methionine là một trong 2 amino acid chứa lưu huỳnh (amino acid còn 

lại là cystein). Nguyên tử lưu huỳnh trong Methionine không có tính thân 

hạch mạnh mặc dù nó có thể phản ứng với một vài trung tâm thân điện 

tử. Methionine thường không tham gia vào liên kết hóa học ở trung tâm 

hoạt động của enzyme. 

- Methionine có nhiều trong thịt gà, thịt bò, trứng, cá, tỏi, yogurt và các 

loại đậu. 

Hình 2.14 Công thức các dạng đồng phân lập thể của methionine 

- Điểm đẳng điện: pI = 5,74 

- Khối lượng phân tử: 149,21 g/mol 

- Nhiệt độ nóng chảy (T ◦ nc): 281 ◦ C 

- Khối lượng riêng: 1,34 g/cm 3 

- Độ tan: 3,3 g/100 g nước 

- Do là một amino acid thiết yếu, methionine không được tổng hợp "mới" 

trong cơ thể người và động vật, mà phải được lấy từ thức ăn bên ngoài. Ở 

các loài thực vật và vi sinh vật, methionine được tổng hợp từ acid 

aspartic và cysteine. 

2.3.2 Tác dụng của methionine 

- Khi là một amino acid tự do, methionine đóng vai trò quan trọng trong 

quá trình chuyển hóa của cơ thể. Nó có thể tạo S-Adenosyl-L- 

Methionine (SAM), một chất cho methyl trong các phản ứng. 

- Methionine cũng được cho là làm giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể, 

giảm nồng độ cholesterol trong máu, giúp giải phóng chất độc trong gan, 






13 











bảo vệ đặc hiệu tế bào gan, ngăn ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ, cần thiết 

trong việc tổng hợp ADN và ARN. 

- Methionine tăng cường tổng hợp glutathion và được sử dụng thay thế 

cho acetylcysteine để điều trị ngộ độc paracetamol. 

- Methionine cũng là một chất chống oxi hóa mạnh, có thể khử hoạt tính 

của gốc tự do. Ngoài ra, do trong phân tử có chứa lưu huỳnh nên nó có 

thể chống lại các bệnh lở da, tóc và móng. 

- Tuy nhiên ở những người đã bị suy gan, methionine có thể làm cho tổn 

thương gan nặng. 

2.4 Threonine [4] 

2.4.1 Giới thiệu về threonine 

- Threonine (viết tắt Thr hoặc T). Tên khoa học: 2-amino-3- 

hydroxybutanoic acid. 

- Threonine là một amino acid thiết yếu. Công thức phân tử: C 4 H 9 NO 3 

- Công thức cấu tạo: HOOCCH(NH 2 )CH(OH)CH 3 . 

- Ở nhiệt độ thường, threonine tồn tại ở dạng tinh thể không màu. 

- Threonine là một amino acid phân cực, ưa nước và phân tử ái điện tử. 

Threonine có chứa nhóm –OH (alcohol). Cả carbon ở vị trí và đều có 

hoạt tính mạnh. 

- Threonin là một trong hai trên hai mươi axit amin sinh protein có hai tâm 

đối xứng. Threonin có thể tồn tại dưới bốn dạng đồng phân lập thể với 

các cấu hình sau: (2S,3R), (2R,3S), (2S,3S) và (2R,3R). L-Threonin được 

dùng để chỉ đồng phân không đối quang (2S,3R)-2-amino-3- 

hydroxybutanoic acid. Đồng phân lập thể thứ hai (2S,3S) hiếm khi có 

mặt trong tự nhiên, được gọi là L-allo-threonin. Hai đồng phân lập thể 

(2R,3S)- và (2R,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoic aicd có vai trò không 

đáng kể. 






Hình 2.15 Công thức các dạng đồng phân lập thể của threonine 

14 











- Điểm đẳng điện: pI = 5,6. 

- Khối lượng phân tử: 119,12 g/mol. 

- Nhiệt độ nóng chảy: 256 ◦ C. 

- Độ tan: 20,5 g/100 g nước. 

- Threonine có nhiều trong thịt, các sản phẩm từ sữa, trứng, có ít hơn trong 

ngô, ngũ cốc, mầm lúa mì, các loại đậu, đậu phộng, các loại hạt và rau. 

2.4.2 Tác dụng của threonine 

- Threonine có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt động bình thường 

của hệ thống sinh học của cơ thể khác nhau như hệ thống thần kinh trung 

ương, hệ tim mạch, gan và hệ miễn dịch. 

- Nó cần thiết để giúp duy trì sự cân bằng protein thích hợp trong cơ thể, 

cũng như hỗ trợ trong việc hình thành collagen và elastin trong da. 

- Threonine cũng tham gia vào hoạt động của gan (bao gồm cả ngăn cản 

gan nhiễm mỡ), chức năng lipotropic khi kết hợp với aspartic acid và 

methionine, cũng như hỗ trợ các hệ thống miễn dịch bằng cách giúp sản 

xuất kháng thể và thúc đẩy tăng trưởng và hoạt động tuyến ức. 

- Chất dinh dưỡng khác cũng được hấp thu tốt hơn khi threonine hiện diện, 

và nó cũng đã được sử dụng như là một phần của điều trị sức khỏe tâm 

thần. 

- Threonine cũng được xác nhận trong việc hỗ trợ sự hình thành kháng thể 

và những thành phần chính của hệ thống miễn dịch của cơ thể. Tạo ra 

những kháng thể chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm trùng ngoài da. 

- Bổ sung threonine cho cơ thể giúp ích cho việc điều trị các bệnh do tổn 

thương hệ thần kinh trung ương. Nhiều triệu chứng xơ cứng teo cơ cũng 

được khắc phục bởi loại amino acid này. 

- Tuy nhiên, liều cao threonine khi dùng có thể gây tổn thương chức năng 

gan và thận. 

2.5 Một số phƣơng pháp định lƣợng amino acid 

Có nhiều phương pháp định lượng amino acid ứng dụng nhiều nhất là 

các phương pháp sắc ký, dưới đây là một số phương pháp thông dụng nhất 

trong phân tích định lượng các amino acid. 

2.5.1 Phƣơng pháp sắc ký giấy [5] 

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phân bố giữa hai pha dung 

môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là 

nước giữ ở chân giấy sắc ký. Dung môi di động thường là dung môi hữu cơ 

bão hòa nước, di chuyển trên giấy theo cơ chế mao dẫn kéo theo các chất trong 

dung dịch. Vận tốc di chuyển của từng chất phân tích khác nhau thì không 

giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một giá trị nhất định gọi là R f . 






15 











Trong đó: 

Hình 2.16 Mô tả ắc ký giấy đi lên 

a: khoảng cách dịch chuyển của chất phân tích 

b: khoảng cách dịch chuyển của dung môi 

R f : trị số 

b 

Giấy sắc ký 

Nắp đậy 

Hình 2.17 Sơ đồ bể sắc ký giấy một chiều đi lên 

Giới hạn chiều cao dung 

môi 

Vạch xuất phát cho 

chất phân tích 

Mực dung môi trong 

bể sắc ký 

Có nhiều loại sắc ký giấy khác nhau: sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký một 

chiều đi lên, sắc ký võng nằm ngang và sắc ký hai chiều....Loại giấy thường 

dùng là Whatman số 1 và Shleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các 

chất như 4 Butanol : 1 Acetic acid : 5 nước (dùng cho chiều thứ nhất) : 3 

phenol : 1 nước (dùng cho chiều thứ 2). 

a 

Dung môi 

đi trước 

Dung môi 






16 











2.5.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng [6] 

Nguyên tắc của phương pháp này cũng dựa trên nguyên tắc của phương 

pháp sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa 

hai pha. Tuy nhiên, chất hấp phụ pha động được trán trên một phiến kính hoặc 

nhôm tạo thành một lớp mỏng và pha động là một dung môi thích hợp. Dung 

môi di chuyển kéo theo sự dịch chuyển của các chất trong mẫu phân tích. Các 

chất hấp phụ thường là silica gel, alumium oxide, sephadex,... được kết hợp 

với thạch cao dán vào miếng kính. 

Phương pháp sắc ký bản mỏng nhuộm màu với ninhydrin có thể dùng 

định tính, bán định lượng đồng thời một số loại amino acid từ dịch thủy phân 

protein. phương pháp này thường được sử dụng trong kiểm nghiệm thực 

phẩm, sinh hóa trước đây. Để tăng độ phân giải cho các amino acid người ta 

phải dùng sắc ký hai chiều với hệ 2 dung môi thích hợp. Trong phương pháp 

sắc ký bản mỏng có ba hệ dung môi thường được sử dụng là phenol/nước, 

collidine, butanol/acid acetic/nước. Tùy theo hệ dung môi và tỉ lệ của hệ dung 

môi mà các amino acid có thứ tự và giá trị R f khác nhau. 

2.5.3 Phƣơng pháp sắc ký khí [7] 

Vì các amino acid là những chất khó bay hơi, nên với phương pháp sắc 

ký khí trước tiên ta phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi cho các amino acid bằng cách 

ứng dụng chương trình nhiệt độ trong quá trình sắc ký, thường là để tạo thành 

dẫn xuất N-acetyl-amine. Đầu tiên, ta cho amino acid tự do (sau quá trình thủy 

phân protein) tác dụng với cồn amylic và HBr khan. Sau đó, cho hỗn hợp này 

tác dụng với anhydrid acetic. Cột thường dùng trong sắc ký khí là Chromosorb 

W (60-80 mesh) có một lớp polyethylenglycol 1 % (carbowax 1564 hoặc 

6000). Chương trình nhiệt giữa 125 ◦ C và 155 ◦ C, tốc độ dòng 60-240 mL/phút. 

Tuy nhiên, phương pháp này không được ứng dụng rộng rãi vì khả năng tách 

rất kém và cũng khá lỗi thời. 

2.5.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện 

nay và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích, nghiên cứu khoa học và 

công nghệ trong đó có phân tích amino acid. Nhiều công trình phân tích amino 

acid dựa trên phương pháp này đã được công bố và nó đã trở thành tiêu chuẩn 

để phân tích amino acid. Vì phương pháp này có độ nhạy cao, hiệu suất tách 

cao và ít tốn thời gian cũng như lượng mẫu cần rất ít. Trong khoảng 15 năm 

trở lại đây thì kỹ thuật này là kỹ thuật được ứng dụng rỗng rãi nhất và chiếm 

gần 70% các công trình nghiên cứu và ứng dụng về sắc ký. 






17 











Hình 2.18 Hệ thống máy sắc ký HPLC tại các phòng thí nghiệm 

2.6 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [5] 

2.6.1 Khái niệm 

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 

trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là 

một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa 

trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất 

lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên 

kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử 

dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng 

tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. 

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các 

hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong 

lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… 

2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký 

Hỗn hợp cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêm 

một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một 

dòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu được hòa tan. 

Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha 

tĩnh). Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh. Pha động (còn gọi 

là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc kí. Với việc 

chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di 

chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lượt 

thoát ra khỏi cột vàđi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu được ghi lại, xử lí 






18 











và chuyển ra ngoài dưới dạng một sắc kí đồ cho biết sự hiện diện của mỗi cấu 

tử dưới dạng một peak. Khi đó lượng cấu tử có trong mẫu được tính toán dựa 

vào chiều cao hoặc diện tích của peak của nó. 

2.6.3 Phân loại 

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người 

ta chia HPLC thành 4 loại: 

- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (absorption/liquid 

chromatography). 

- Sắc ký phân bố (partition chromatography). 

- Sắc ký ion (ion chromatography). 

- Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). 

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể 

phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất 

phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000). 

SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha 

tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) 

và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography). 

Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha 

tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và 

phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm. 

SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực 

hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân 

cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân 

cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ 

là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà 

lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT. 






19 








2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 




Trong đó: 

Hình 2.19 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 

Dung môi pha động: dung môi pha động gồm một hoặc nhiều dung môi 

khác nhau để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột. 

Có thể sử dụng dung môi rửa giải có thành phần không đổi trong suốt quá 

trình phân tích, tuy nhiên đối với một hỗn hợp phức tạp một thành phần pha 

động thường không thích hợp từ đầu đến cuối. Do đó thường sử dụng 

phương pháp gradient nồng độ (thay đổi thành phần pha động theo tỉ lệ đã 

được chương trình hóa) cho phép tách tốt trong thời gian vừa phải. 

Yêu cầu đối với dung môi pha động : 

o Có độ tinh khiết cao, cần loại bỏ tạp chất và đuổi khí trước khi sử dụng. 

o Có độ nhớt thấp, không tạo áp lực khi vào cột. 

o Không tương tác với pha tĩnh, không làm lão hóa cột tách và làm thay 

đổi các đặc tính của nó. 

o Không hấp thu trong vùng ánh sáng phân tích. 

Bơm (bơm cao áp): để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc 

ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải điều chỉnh được áp 

suất (0 – 400 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua 

cột tách phù hợp cho quá trình sắc ký nằm trong vùng 0,5 – 3,0 mL/phút. 

Van bơm mẫu (bộ phận lấy mẫu tự động): để bơm mẫu vào cột tách theo 

những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là các 

van 6 chiều có chứa vòng mẫu có thể tích 20, 50, 100 µL. Van 6 chiều chỉ 

có một vòng mẫu nhưng van 10 chiều thì có 2 vòng mẫu. 






20 











Cột HPLC (cột tách): là cột chứa pha tĩnh, trái tim của quá trình sắc ký, nó 

là một yếu tố quyết định hiệu quả sự sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột 

tách có nhiều cỡ khác nhau và thường làm bằng thép không gỉ, tùy thuộc 

vào mức độ sắc ký thông thường cột tách có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường 

kính trong từ 2 – 5 mm, đường kính của chất nhồi cột từ 3-10 m. 

Yêu cầu đối với cột sắc ký: cột phải trơ, có thành thẳng và chịu được áp 

suất cao. 

Trong sắc ký phân bố pha đảo, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được 

gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: 

o Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý 

→ sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). 

o Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded 

phase chromatography) 

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều 

ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau: 

- Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên 

dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối 

với hợp chất phân tích. 

- Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người 

ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi. 

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên 

kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có 

cấu trúc dạng này. 

Detector: là trang bị phát hiện chất phân tích. Có rất nhiều loại detector 

khác nhau, tùy theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt độ 

nhạy cao khi phát hiện các chất và định lượng chúng như: detector UV – 

VIS, AES, AAS, FD, RID, DAD, MS... 

Trong đề tài này, với những điều kiện có sẵn tại phòng thí nghiệm của 

Trung tâm Phân Tích và Giám Định Vinacert Control Cần Thơ, em ứng 

dụng khả năng phân tích của detector diod phát quang (DAD). 

Nguyên tắc hoạt động: dựa trên sự phát quang của một loại diod đặc biệt 

khi nó bị chùm sáng tác động vào (tương tự như detector phổ hấp thụ quang 

phân tử UV – VIS). Mỗi detector có hàng chục diod phát quang tạo thành 

một mảng diod, có vùng phổ làm việc từ 200 – 1100 nm và có tính không 

gian 3 chiều. Nên loại này thu nhận được hình không gian của peak hấp thụ 

của chất, và nhiều peak đồng thời. Loại này có độ nhạy và độ chọn lọc rất 

cao, tốc độ đo cao hơn và có thể đo được từ 2 đến 42 kênh đồng thời. Chọn 

sóng đo hấp thụ cho từng chất là dễ dàng. Hạn chế được sự chen lấn và 

trùng sóng hấp thụ. 


Trang bị điều khiển và xử lý số liệu: gồm các máy tự ghi (recorder), bộ 

phân tích kế (intergrator), máy tính, máy in. 





21 











2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định [8,9] 

Khoảng một nữa các phép phân tích amino acid dựa trên sự tách các 

amino acid tự do bằng sắc ký lỏng trao đổi ion rồi tạo dẫn xuất sau cột phân 

tách. Kỹ thuật tạo dẫn xuất sau cột có thể áp dụng cho các mẫu thử có một 

lượng nhỏ chất đệm (như các muối và ure) và cần 5-10 g mẫu thử protein cho 

một lần phân tích. Các kỹ thuật còn lại bao gồm việc tạo dẫn xuất trước cột rồi 

tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Các kỹ thuật tạo dẫn 

xuất trước cột thường rất nhạy và chỉ cần khoảng 0,5-1,0 g mẫu thử 

protein/peptide cho mỗi lần phân tích. 

Vì vây, với các điều kiện có sẵn tại Trung tâm Phân tích và Giám định 

Vinacert Control Cần Thơ, ứng dụng phương pháp tạo dẫn xuất amino acid 

tiền cột với thuốc thử ortho-phthalaldehyde (OPA). Đây là phương pháp được 

ứng dụng khá phổ biến hiện nay, dùng để phân tích hầu hêt các amino acid với 

khả năng tạo dẫn xuất nhanh và ổn định. 

Hình 2.20 Công thức cấu tạo của OPA 

Thuốc thử OPA, khi có mặt một hợp chất thiol (có thể dùng 2-ME hoặc 

3-MPA) sẽ tác dụng với các amine bậc một để cho một hợp chất isoindole 

phát huỳnh quang mạnh. Bản thân thuốc thử OPA không phát huỳnh quang, 

nên không gây trở ngại. Mặt khác, vì OPA dễ tan và ổn định trong nước đồng 

thời cho phản ứng nhanh. Tuy nhiên, dẫn xuất tạo thành chỉ bền trong vài 

phút, nên phải tiến hành phản ứng tạo dẫn xuất bằng hệ thống tiêm mẫu tự 

động (autosample) để tránh mất thời gian với việc tạo dẫn xuất bằng tay cũng 

như quá trình phân tích với máy. Dù vậy, OPA không cho phản ứng với các 

amine bậc 2, nên kỹ thuật này không áp dụng được để phân tích các amino 

acid có chứa nhóm chức amine bậc 2 như proline. 






22 











OPA (không phát 

huỳnh quang) 

Hình 2.21 Phương trình tạo dẫn xuất với thuốc thử OPA 

Dẫn xuất tạo thành sau khi được phân tích bằng cột pha đảo sẽ được phát 

hiện bằng detector DAD ở bước sóng kích thích 338 nm. 

Ngoài ra, còn một số phương pháp tạo dẫn xuất với các amino acid như 

tạo dẫn xuất sau cột với thuốc thử ninhydrine, tạo dẫn xuất sau cột với thuốc 

thử OPA, tạo dẫn xuất trước cột với thuốc thử 6-aminoquinolyl-Nhydroxysuccinimidyl 

carbamate (AQC),... 

Ưu điểm của phương pháp tạo dẫn xuất với OPA: 

- Tạo dẫn xuất nhanh, rút ngắn thời gian phân tích so với phương pháp tạo 

dẫn xuất với ninhydrin đã được ứng dụng từ rất lâu, không còn phù hợp 

nữa. 

- Lượng mẫu cần dùng phân tích rất nhỏ tiết kiệm được chi phí. 

- Độ nhay cao, giới hạn phát hiện thấp khi phát hiện với detector FLD 

(khoảng 1picomol đã được công bố). 

- Phân tích được hầu hết các amino acid bậc 1 với độ chính xác cao. 

Nhược điểm: 

Amino acids 

- Không phân tích được các amino acid bậc hai. 

- Không bền vững nên sau khi tạo dẫn xuất phải phân tích nhanh chóng 

trên máy. 

2.8 Thủy phân protein [2] 

Tác nhân 

thiol 

Dẫn xuất OPA-amino acids 

phát huỳnh quang mạnh 

DAD: 338 nm 

FLD: Ex 340 nm, Em 450 nm 

Có nhiều phương pháp thủy phân protein nhưng phương pháp chủ yếu 

dùng để tách các amino acid ra khỏi mẫu thực phẩm là dùng HCl) với nồng độ 

cao khoảng 6 M. Tuy nhiên, tùy theo mục đích nghiên cứu định tính hay định 

lượng mà có các phương pháp thủy phân khác như: 

- Thủy phân bằng kiềm 

- Thủy phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion 






23 











- Thủy phân bằng enzyme. 

Trong quá trình thủy phân protein bằng HCl thì threonine bị phân hủy 

một phần, methionine có thể bị oxi hóa một phần. Tùy theo từng mục đích 

nghiên cứu và phân tích mà ta áp dụng các phương pháp thủy phân khác nhau, 

đối với đề tài này cần định lượng các amino acid một cách chính xác nên tôi 

áp dụng phương pháp thủy phân bằng HCl nồng độ cao 6 M có mặt chất xúc 

tác 3 – mercaptopropionic acid, để quá trình thủy phân xảy ra hoàn toàn tiến 

hành ủ mẫu thủy phân qua đêm ở điều kiện nhiệt độ thích hợp khảo sát từ một 

số tài liệu và phù hợp với điều kiện tại phòng thí nghiệm. 

Quá trình thủy phân chủ yếu để cắt đứt các liên kết peptide của các 

amino acid trong protein, trả các amino acid về dạng tự do sau đó tạo dẫn xuất 

với dẫn chất OPA có mặt tác nhân thiol là 3 – MPA để tạo thành hợp chất có 

khả năng phát quang mạnh và được phát hiện bằng detector DAD. 






24 











CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 

3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm 

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm 

Địa điểm thí nghiệm: Trung tâm Phân tích và Giám định Vinacert 

Control Cần Thơ. 

Địa chỉ: F2-62-63, đường số 6, khu dân cư 586, phường Phú Thứ, quận 

Cái Răng, TP Cần Thơ. 

3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm 

Đề tài được thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng kể từ tháng 9 năm 

2015 đến tháng 11 năm 2015. 

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao UHPLC Ultimate 3000 Thermo. 

- Đầu dò RS Diode Array Detector. 

- Tủ sấy DSG DSQ – 1500D – Nhật. 

- Máy ly tâm lạnh NIKRO 220 R. 

- Máy trộn Vortex VM – 1000. 

- Vial. 

- Giấy lọc. 

- Giấy cân. 

- Cối xay thực phẩm. 

- Cân phân tích. 

- Ống teflon. 

- Ống thử nghiệm Falcon bằng nhựa 50 mL, 30 115 mm. 

- Micropipete 10 - 100 µL, Micropipete 100 – 1000 µL và Micropipete 

1000 - 5000 µL đã được hiệu chỉnh cùng đầu tuýp Micropipete với cùng 

thể tích. 

- Màng lọc millipore 0,22 µm. 

- Kim tiêm (Vikimco). 

3.1.4 Hóa chất 

- Chất chuẩn DL-Lysine (87,1 %, Dr. Ehrenstorfer), DL-Methionine 

(99,5%, Dr. Ehrenstorfer), DL-Threonine (99 %, Dr. Ehrenstorfer). 

- Boric acid rắn (99 %, Xilong). 

- Dung dịch o-phthaladehyde (OPA) ( 99 %, Sigma-Aldrich). 

- Sodium hydoxide rắn (NaOH) (99 %, Merck). 

- Dung dịch hydrochloride acid (HCl) (37%, Merck). 

- Dung dịch 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) (99 %, ACROS 

Organic ). 

- Muối di-potassium hydrophosphate (K 2 HPO 4 ) (99 %, Merck). 






25 











- Nước cất HPLC grade (Fisher). 

- Acetonitrile (ACN) loại HPLC grade (99 %, MACRON). 

- Methanol (MeOH) (99 %, J.T.Baker). 

- Dung dịch acetic acid (CH 3 COOH) (99,5 %, Xilong). 

- Potassium chloride (KCl) (99,5 %, Merck). 

3.1.5 Đối tƣợng thí nghiệm 

Thức ăn chăn nuôi dành cho gia súc và gia cầm ở xung quanh Thành phố 

Cần Thơ. 

Số lượng mẫu: 15 mẫu. 

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 

Dựa trên các tài liệu nghiên cứu đã được công bố và các điều kiện tại 

phòng thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm và tối ưu hóa các điều kiện phân tích 

với một vài chỉ tiêu: thời gian lưu, độ chính xác, độ tuyến tính, giới hạn phát 

hiện (LOD), giới hạn định lượng LOQ (chất chuẩn). 

Phân tích trên mẫu thật thức ăn chăn nuôi. 

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 

Mẫu thức ăn chăn nuôi được xay nhuyễn để đạt độ mịn thích hợp và lọc 

qua rây lọc đường kính 0,5 mm. Mẫu qua rây cho vào túi nhựa ép hết khí ra 

ngoài, buộc kín và bảo quản ở nhiệt độ khoảng 25-30 ◦ C cho đến khi phân tích. 

3.2.2 Khảo sát thời gian lƣu [5] 

Thời gian lưu: các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp 

vào cột sắc ký, chúng sẽ bị lưu giữ trong cột tách (trên pha tĩnh) theo một thời 

gian nhất định. Đó là thời gian lưu của nó trong hệ cột đã cho. Thời gian lưu 

này tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải 

ra khỏi cột ở thời điểm đó có nồng độ cực đại. Như vậy, nếu gọi t Ri là thời gian 

lưu tổng cộng của chất tan i thì chúng ta luôn có: 

t Ri = (t 0 + t ’ Ri) 

Trong đó: 

t 0 : thời gian không lưu giữ ( thời gian chất tan nằm trong pha động). 

t ’ Ri: thời gian lưu giữ thực chất của chất i ở trong cột tách sắc ký. 

Nếu t 0 = 0 thì ta sẽ có t Ri = t ’ Ri. Trường hợp này chỉ có khi t Ri < 4 phút. 


Còn nói chung chúng ta luôn có: 

t ’ Ri = t Ri – t 0 





26 











Hình 3.1 Thời gian lưu trên sắc ký đồ 

Nếu 2 chất A và B kế tiếp nhau trong sắc ký đồ thì chúng ta có 

được gọi là thời gian lưu tương đối của A và B hay hệ số tách của 2 chất đó. 

Đại lượng này càng lớn thì sự tách của 2 chất này càng rõ rệt. Khi đại lượng 

này bằng 1, thì không có sự tách sắc ký giữa A và B, lúc này A và B nằm 

chung trong 1 peak sắc ký. Nếu gần bằng 1 thì 2 peak sắc ký của A, B có 

chung một vùng nghĩa là chúng chập nhau, không thể tách thành 2 chất riêng 

biệt đặc trưng cho 2 chất đó. 

Giá trị t ’ Ri của một chất tan trong quá trình sắc ký là phụ thuộc vào nhiều 

yếu tố: 

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, kích thước xốp... 

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế. 

Trong một số trường hợp còn phụ thuộc cả vào pH của pha động, nồng độ 

chất tạo phức nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các quá trình cân bằng 

động trong quá trình sắc ký, nhất là trong sắc ký ion thì yếu tố pH thể hiện rất 

rõ nét. 


3.2.3 Xây dựng đƣờng chuẩn dựa trên khoảng tuyến tính [10] 

Định nghĩa khoảng tuyến tính: khoảng tuyến tính của một phương pháp 

phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo 

được và nồng độ chất phân tích. 





27 











Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độgiữa 

giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn 

này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất 

định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính. 

Hình 3.2 Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc 

Việc xác định khoảng tuyến tính thường bắt đầu từ giới hạn định lượng 

(LOD hay còn gọi là điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm 

cao nhất). Nói chung để xác định khoảng tuyến tính cần dùng 10 (tối thiểu là 

6) nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ đo lặp lại ít nhất 6 lần. 

Xây dựng đường chuẩn: sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây 

dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan. Trong phân tích 

thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn trùm lên nồng độ trong mẫu, 

không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ 

trong mẫu không được vượt ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường 

chuẩn và tốt nhất phải nằm giữa đường chuẩn. 

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau dựa vào phương pháp và kỹ thuật 

khác nhau như: đường chuẩn với chuẩn tinh khiết, đường chuẩn trên mẫu 

trắng, đường chuẩn trên mẫu thực, đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn. 

Với đề tài này, tôi xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết. 


Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết: 

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ), xác định các giá trị đo 

được y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc 

tuyến tính ta có sự khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: 





28 








y = ax + b 




Trong đó: 

a: giá trị độ dốc (slope) 

b: giá trị hệ số chặn intercept 

và hệ số tương quan tuyến tính 

R= ∑ ̅ ̅ 

√∑ ̅ ∑ ̅ 

Nếu 0,995 R 1 hay 0,99 R 2 1 có tính tương quan tuyến tính rõ rệt 

3.2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện [10] 

Định nghĩa giới hạn phát hiện: là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được 

lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của 

chất phân tích trong mẫu mà có thể phát hiện được nhưng không định lượng 

được. 

Cách xác định: 

Dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu 

Phân tích mẫu (mẫu chuẩn, mẫu trắng hoặc mẫu thử) ở nồng độ thấp còn có 

thể xuất hiện chất phân tích. Lặp lại 3,4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia nhiễu 

(S/N = signal to noise ratio) 

Trong đó: 

S: chiều cao chất phân tích (chiều cao peak). 

N: nhiễu đường nền. 

Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính 

nhiễu lân cận 2 bên của peak, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng 

của peak tại nửa chiều cao. 

LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu 

đường nền, thông thường lấy S/N = 3. 

S/N = 






29 











Hình 3.3 Minh họa tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu. 

Dựa trên độ lệch chuẩn 

Làm trên mẫu trắng hoặc mẫu thử, phân tích mẫu 10 lần song song, tính độ 

lệch chuẩn (SD). Độ lệch chuẩn này phải khác 0. 

Trong đó: 

LOD = ̅ + 3 (với trường hợp mẫu trắng LOD = 3 SD 0 ) 

Với SD 0 = √ ∑ 

̅ : nồng độ trung bình của mẫu trắng hoặc mẫu thử 

SD 0 : độ lệch chuẩn tương đối của mẫu trắng hoặc mẫu thử 

Đánh giá LOD tính được: tính R = ̅̅̅ 

Với 

tin cậy. 

R 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và kết quả đo được đáng 

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn hoặc thêm một ít chất 

chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm sau đó tính lại R. 

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn hoặc pha loãng dung dịch 

thử đã dùng và làm lại thí nghiệm, tính lại R. 

3.2.5 Khảo sát giới hạn định lƣợng [10] 

Định nghĩa giới hạn định lượng: là nồng độ tối thiểu của chất phân tích 

có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp và cho kết quả có 

độ chụm mong muốn. 


LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng. 

̅̅̅ 





30 











Có nhiều cách xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể 

mà ta lựa chọn cho phù hợp. 

Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân 

tích, do đó ta thực hiện trên nền mẫu thật. 

LOQ trong nhiều trường hợp là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính. 

Dựa trên độ lệch chuẩn. 

Cách tiến hành tương tự như xác định LOD nhưng công thức tính giá trị 

khác nhau: 

Đối với mẫu trắng: LOQ = ̅̅̅ + 10 SD 

Đối với mẫu thử: LOQ = 10 SD 

Dựa trên đường chuẩn 

Cách tiến hành tương tự như LOD nhưng với công thức tính sau: 

LOQ = 

Dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu 

Cách xác định LOQ tương tự như LOD nhưng điều kiện với giá trị nồng 

độ được chấp nhận mà tại đó tỉ lệ tín hiệu peak gấp 20 – 30 lần nhiễu đường 

nền, thông thường lấy giá trị S/N = 10. 

3.2.6 Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) [10] 

Định nghĩa: theo quan điểm mới nhất của tiêu chuẩn quốc tế (ISO 5725 

1-6:1994) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 6910 1-6 : 2005) độ đúng chỉ mức 

độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc 

giá trị được chấp nhận là đúng . Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết 

quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình. Độ chính xác được khái quát 

thông qua việc đánh giá độ chụm và độ đúng. 

Độ chính xác (accuracy) = độ chụm (precision) + độ đúng (trueness) 

Độ chụm (precision) 

Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và với 

những điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau. Điều này 

do các sai số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, ta không thể kiểm soát 

được hoàn toàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Do đó, để 

kiểm soát được các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm 

chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực. Độ 

chụm là một khái niệm định tính và được biểu thị định lượng bằng độ lệch 






31 











chuẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấp thì độ lệch chuẩn hay hệ số 

biến thiên càng lớn. Độ chụm có thể được phân ra thành ba trường hợp sau: 

làm: 

- Độ lặp lại (repeatability) 

- Độ chụm trung gian (intermediate precision) 

- Độ tái lập (reproducibility). 

Dựa trên độ lặp lại 

Cách tiến hành: Tính toán dựa trên các kết quả phân tích mẫu thực đã 

Trong một số trường hợp việc ước lượng độ lặp lại có thể thông qua tính 

toán dựa trên kết quả phân tích các mẫu thực. Do đó việc lưu giữ các kết quả 

phân tích có vai trò rất quan trọng. Dựa trên kết quả phân tích làm trên mẫu 

thực trong nhiều tuần, ít nhất là 10 mẫu, có thể là các nền mẫu khác nhau, 

nồng độ khác nhau nhưng phải có kết quả làm lặp 2 lần. 

Trường hợp các mẫu có nồng độ, hàm lượng gần như nhau. Tính độlệch 

giữa hai kết quả lặp của mỗi mẫu d i rồi tính độ lệch trung bình d tb , sau đó tính 

độ lệch chuẩn s: 

d i = | | 

̅ 

d tb = ∑ 

̅ 

s = 

RSD % = ̅ 

∑ ̅ 

100 

Nếu các mẫu có nồng độ x i khác nhau nhiều thì thay cho độ lệch d i , tính 

độ lệch tương đối D i , và độ lệch tương đối trung bình D tb và sau đó tính độ 

lệch chuẩn tương đối: 


D i = 

D tb = ∑ 





32 











RSD % = 100 

Tiêu chí đánh giá: đối chiếu giá trị tính được với giá trị mong muốn hay 

giá trị yêu cầu hoặc so với RSD (%) lặp lại cho trong Bảng 3.1 (RSD (%) tính 

được không được lớn hơn giá trị trong bảng ở hàm lượng chất tương ứng). Độ 

chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích. Nồng độ chất càng thấp thì kết quả 

càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD (%) càng lớn. 

Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 

TT Hàm lượng % Tỉ lệ chất Đơn vị RSD(%) 

1 100 1 100 % 1,3 

2 10 10 -1 10 % 1,8 

3 1 10 -2 1 % 2,7 

4 0,1 10 -3 0,1 % 3,7 

5 0,01 10 -4 100 ppm 5,3 

6 0,001 10 -5 10 ppm 7,3 

7 0,0001 10 -6 1 ppm 11 

8 0,00001 10 -7 100 ppb 15 

9 0,000001 10 -8 10 ppb 21 

10 0,0000001 10 -9 1 ppb 30 

Độ đúng (trueness) 

Định nghĩa độ đúng: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ 

gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc 

giá trị được chấp nhận là đúng (μ). Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị 

thựckhông thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy 

chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng). 

Giống như độ chụm, độ đúng là một khái niệm định tính. 

Cách xác định độ đúng:Muốn xác định độ đúng cần phải tìm được giá trị 

đúng (giá trị quy chiếu được chấp nhận), có nhiều cách khác nhau để xác định 

độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi 

một phương pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra 

hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận) và phương pháp xác định độ thu hồi (độ 

tìm lại). 


Phương pháp nghiên cứu trong đề tài này dựa vào việc xác định độ chệch 

(bias) của mẫu nguyên liệu lysine, methionine, threonine. 





33 








̅ 

100 




Trong đó: 

: độ chệch (bias) % 

̅: giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm 

: giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng 

Trong nhiều trường hợp không thể tìm hoặc áp dụng một phương pháp 

tiêu chuẩn để so sánh kết quả, cũng như không thể dễ dàng có được các mẫu 

chuẩn hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận phù hợp với phương pháp. Việc xác 

định độ đúng do đó có thể thực hiện thông qua xác định độ thu hồi (còn gọi là 

độ tìm lại) của phương pháp. Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu 

thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu 

bốn lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây: 

Trong đó: 

lặp lại. 

Đối với mẫu thử: 

Đối với mẫu trắng: 

R%: độ thu hồi % 

R% = 100 

R% = 100 

C m+c : nồng độ thu hồi trong mẫu thêm chuẩn 

C m : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử 

C tt : nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn 

C c : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết). 

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm 

Tiêu chí đánh giá: Sau khi đánh giá độ thu hồi, so sánh kết quả với các 

giá trị cho trong Bảng 3.2 . Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng 

khác nhau. Trong trường hợp phân tích các chất hàm lượng vết có thể tham 

khảo tiêu chuẩn của Hội đồng châu Âu (Bảng 3.3) 






34 











TT 

Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 

TT Hàm lượng % Tỉ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%) 

1 100 1 100 % 98-102 

2 10 10 -1 10 % 98-102 

3 1 10 -2 1 % 97-103 

4 0,1 10 -3 0,1 % 95-105 

5 0,01 10 -4 100 ppm 90-107 

6 0,001 10 -5 10 ppm 80-110 

7 0,0001 10 -6 1 ppm 80-110 

8 0,00001 10 -7 100 ppb 80-110 

9 0,000001 10 -8 10 ppb 60-115 

10 0,0000001 10 -9 1 ppb 40-120 

Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu 

Hàm lượng chất 

( g/kg) 

Đơn vị Độ thu hồi (%) 

1 ppb 50-120 % 

2 đến 1-10 ppb 70-110 % 

3 ppb 80-110 % 






35 








3.3 Thực nghiệm 

3.3.1 Quy trình xử lý mẫu và phân tích trên HPLC [6-9, 11, 12] 




tích 

Cân khoảng 0,3 g mẫu 

thức ăn chăn nuôi cho 

vào ống teflon 

Vặn chặt nắp teflon và 

cho vào tủ sấy, ủ ở 

103 ◦ C trong 24 giờ 

Lọc dung dịch qua 

giấy lọc để loại bã 

Vortex 1 phút, sau đó 

rút dung dịch từ vial 

lọc qua màng lọc 

millipore 0,22 m và 

bơm vào một vial khác 

Hút chính xác 10 mL dung dịch HCl 

6M và 50 L dung dịch 3- 

mercaptopropionic acid cho vào ống 

teflon chứa mẫu vừa rồi. 

Sau 24 giờ, lấy ống teflon ra khỏi tủ sấy 

và tiến hành làm lạnh trong tủ lạnh 

trong khoảng 30 phút 

Rút 50 L dịch chiết 

cho vào vial và định 

mức đến 1 mL bằng 

nước cất dùng riêng 

cho HPLC 

Tiến hành phân tích 

trên máy HPLC 

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC 

3.3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, pha động và dung dịch phân 

Dung dịch chuẩn gốc C 0 (1000 ppm) 

Cân chính xác 11,481 g lysine cho vào bình định mức 10 mL và định 

mức tới 10 mL bằng nước cất loại HPLC, vortex, siêu âm 2 phút và cho vào 

hủ bi tối màu bảo quản và sử dụng khi cần thiết. 

Cân chính xác 10,050 g methionine và cho vào bình định mức 10 mL và 

định mức tới 10 mL bằng nước cất loại HPLC, vortex siêu âm 2 phút và cho 

vào hủ bi tối màu bảo quản và sử dụng khi cần thiết. 






36 











Cân chính xác 10,101 g threonine cho vào bình định mức 10 mL và định 

mức tới 10 mL bằng nước cất loại HPLC, vortex, siêu âm 2 phút và cho vào 

hủ bi tối màu bảo quản và sử dụng khi cần thiết. 

Nồng độ của 3 dung dịch chuẩn tương đương: 

Lysine: 1000 ppm. 

Methionine: 1000 ppm. 

Threonine:1000 ppm. 

Dung dịch chuẩn được lưu trữ ở điệu kiện tránh ánh sáng, ở nhiệt độ 2 – 

8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 

- Dung dịch chuẩn trung gian (chuẩn mix của 3 amino acid) 

Chuẩn trung gian 150 ppm 

Hút chính xác 5 mL dung dịch chuẩn gốc (C 0 ) của mỗi dung dịch chuẩn 

lysine, methionine, threonine cho vào bình định mức 20 mL và định mức tới 

20 mL bằng nước cất loại HPLC grade, vortex, siêu âm 2 phút, cho vào hủ bi 

tối màu bảo quản ở 2-8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 

Dung dịch chuẩn làm việc 

Chuẩn C 1 (150 ppm) 

Hút chính xác 6 mL dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình 

định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC grade. Vortex, siêu 

âm 2 phút. Bảo quản ở 2-8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 


Hút chính xác 4,8 dung dịch chuẩn trung gian 250 ppm cho vào bình 

định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC grade. Vortex, siêu 

âm 2 phút. Bảo quản ở 2-8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 



định mức 10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC gradde. Vortex, 

siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2-8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 




siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2 - 8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 





siêu âm 2 phút. Bảo quản ở 2 – 8 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 





37 












Hút chính xác 1 mL dung dịch chuẩn C 5 (30 ppm) cho vào bình định mức 

10 mL và định mức bằng nước cất loại HPLC gradde. Vortex, siêu âm 2 

phút. Bảo quản ở 2 – 80 ◦ C và sử dụng trong 7 ngày. 

- Dung dịch đệm borate pH = 10,4 

Cân 0,6189 g acid boric và 0,7456 g KCl hòa tan trong 50 mL nước cất, hút 

chính xác 36,85 mL NaOH 0,2 M thêm vào dung dịch trên và điều chỉnh pH 

tới 10,4 bằng dung dịch NaOH đậm đặc. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 ◦ C và sử 

dụng trong 7 ngày. 

- Dung dịch OPA 

Cân 50 mg OPA hòa tan trong 1,25 mL methanol. Hút chính xác 50 L 3- 

MPA và 11,2 mL dung dịch đệm borate pH = 10,4 thêm vào dung dịch. Bảo 

quản ở nhiệt độ 2 – 8 ◦ C, chỉ pha khi cần sử dụng. 

- Pha động A 

Cân chính xác 13,92 g K 2 HPO 4 cho vào bình định mức 2000 mL và định 

mức tới vạch bằng nước cất. Điều chỉnh pH tới 7,8 bằng dung dịch H 3 PO 4 

đậm đặc. Lọc chân không và siêu âm 30 phút. 

- Pha động B 

Đong chính xác 900 mL ACN, 900 mL MeOH và 200 mL nước cất HPLC 

cho vào bình đựng pha động, khuấy đều và đánh siêu âm 30 phút. 






38 











3.3.3 Điều kiện chạy máy HPLC 

Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích 

Pha động A Đệm K 2 HPO 4 40 mM pH = 7,8 

Pha động B MeOH:ACN:H 2 O (45:45:10) 

Gradient 

Thời gian (phút) A % B % 

0 85 15 

0 85 15 

3 85 15 

18 55 45 

22 55 45 

25 85 15 

32 85 15 

Cài đặt autosampler 

(Injection program) 

1. Bơm 5 từ vial chứa đệm borate 8. Chờ 60 giây. 

pH 10,4, tốc độ bơm 1 mL/phút. 

2. Bơm 1 từ vial chứa mẫu thử, 9. Bơm vào 100 từ vial chứa dung 

tốc độ bơm 1mL/phút. 

dịch rửa kim và thải ra để rửa sạch 

kim. 

3. Trộn 6 dung dịch vừa bơm vào 10. Bơm 3 từ vial chứa dung dịch 

trong vòng đệm (van nạp mẫu), 

tốc độ bơm tối đa (cài đặt lặp lại 

acetic acid 1 M để làm giảm pH của 

dung dịch, tốc độ bơm 5 mL/phút. 

bước này 3 lần). 

4. Chờ 3 giây. 11. Trộn 10 dung dịch phản ứng 

trong cột dẫn, tốc độ tối đa (cài đặt 

lặp lại bước này 4 lần). 

5. Bơm vào 100 từ vial chứa 12. Tiêm vào cột phân tích 3 . 

dung dịch rửa kim và thải ra để 

làm sạch kim tiêm. 

6. Bơm 1 từ vial chứa tác chất 13. Rửa vòng đệm bằng 100 từ 

OPA, tốc độ bơm 1 mL/phút. bình chứa dung dịch rửa vòng đệm để 

chuẩn bị cho lần bơm mẫu kế tiếp. 

7. Trộn 7 dung dịch trong vòng 

đệm, tốc độ bơm tối đa (cài đặt 

lặp lại bước này 6 lần). 


Tốc độ dòng: 1 mL/phút 

Cột: Agilent Zorbax Eclipse AAA 

4,6 150 mm, 5 m 

Nhiệt độ cột: 30 ◦ C 

Đầu dò DAD, bước sóng: 338 nm 





39 











3.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lƣu của mẫu chuẩn lysine, 

methionine và threonine 

Từ các dung dịch chuẩn làm việc, lấy dung dịch có nồng độ tương đối 

cao chuẩn trung gian 250 ppm của mỗi mẫu chuẩn lysine, methionine, 

threonine và tiến hành đo trên máy HPLC, xác định thời gian lưu của mỗi chất 

trên sắc ký đồ với cùng điều kiện chạy máy như phần 3.3.3 

3.3.5 Xây dựng đƣờng chuẩn 

Thực hiện: pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp của lysine, methionine 

và threonine có nồng độ thay đổi như bảng bên dưới. 

Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine, threonine 

Amino 

acid 

Dãy chuẩn 

(ppm) 

Nồng độ (ppm) 

1 2 3 4 5 6 

Lysine 3 – 150 3 30 60 90 120 150 

Methionine 3 – 150 3 30 60 90 120 150 

Threonine 3 – 150 3 30 60 90 120 150 

Vẽ đồ thị từ kết quả thu được thể hiện mối liên quan giữa diện tích peak 

(S) hoặc chiều cao peak (H) và nồng độ chất phân tích (C c ) trong mẫu chuẩn, 

từ đó xác định khoảng tuyến tính với hệ số tương quan tuyến tính phù hợp 

R 2 > 0,999. 

3.3.6 Xác định giới hạn phát hiện 

Từ kết quả tỉ lệ S/N hiển thị trên chương trình máy tính sau khi tiến hành 

đo trên mẫu thử, xác nhận giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) tại giá 

trị có tỉ lệ S/N . 

S/N: tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu. 

3.3.7 Xác định giới hạn định lƣợng 

Tương tự như thí nghiệm 3.3.6 nhưng từ kết quả thu được trên chương 

trình máy tính, xác nhận giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) tại nồng 

độ có giá trị S/N 10 hoặc xác nhận nhận giá trị LOQ = 3 LOD. 

3.3.8 Thí nghiệm khảo sát độ chính xác của phƣơng pháp 

Độ chụm: 


Tiến hành phân tích trên 3 mẫu thức ăn chăn nuôi khác nhau, cách tiến 

hành như trong phần 3.2.6. Mỗi mẫu làm lặp lại 2 lần. 

Từ kết quả thu được, tiến hành tính toán để tìm được giá trị RSD (%) cho 

phép của độ lặp lại ở nồng độ nhất định, xác nhận độ chụm của phương pháp. 





40 











Độ đúng: 

Phân tích trên mẫu nguyên liệu lysine dùng phối trộn trong thức ăn chăn 

nuôi để kiểm tra hàm lượng chính xác của mẫu nguyên liệu. 

Tiến hành cân một lượng chính xác khoảng 0,003 g mẫu nguyên liệu 

lysine định mức 50 mL bằng nước cất HPLC và tiến hành lọc qua giấy lọc và 

rút 1 mL dung dịch qua lọc tiếp tục lọc qua màng lọc millipore 0,22 m, bơm 

vào vial và tiến hành phân tích trên máy HPLC.Từ kết quả thu được sau khi so 

sánh với RSD (%) cho phép của độ lặp lại ở hàm lượng nhất định, xem giá trị 

hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine như là vật liệu chuẩn (giá trị đo được từ 

mẫu nguyên liệu được chấp nhận là một giá trị đúng). 

Tiến hành phân tích mẫu nguyên liệu lysine như trong phần 3.3.1 trong 

cùng điều kiện như phần 3.3.3. Cân một lượng khoảng 0,01 g Mẫu nguyên liệu 

đo lặp lại 2 lần để xác định giá trị trung bình hàm lượng của chất phân tích 

trong mẫu. 

Từ kết quả trung bình thu được xác nhận giá trị độ chệch (bias) của mẫu 

nguyên liệu, từ đó đánh giá được độ đúng của phương pháp. 

3.3.9 Tiến hành thí nghiệm trên mẫu 

Tiến hành quy trình phân tích trên 15 mẫu thức ăn chăn nuôi và 1 mẫu 

nguyên liệu lysine với quy trình như phần 3.2.2, riêng đối với mẫu nguyên liệu 

cân khối lượng xấp xỉ 0,01 g và làm lặp 2 mẫu để đánh giá độ lệch chuẩn và 

có hàm lượng chính xác nằm trong khoảng tuyến tính. 

Trong đó: 

3.3.10 Công thức tính toán kết quả 

% m = % 

% m: hàm lượng (g/100g) của lysine, methionine hoặc threonine trong mẫu 

X: nồng độ ppm ( có được từ diện tích peak mẫu so với phương trình 

đường chuẩn 

V: thể tích pha loãng (mL) 

M: khối lượng mẫu cân ban đầu (g) 


f: hệ số pha loãng 





41 











CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 

4.1 Kết quả khảo sát thời gian lƣu 

Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid 

Thời gian lưu 

(t R ) phút 

4.2 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn 

Lysine Methionine Threonine 

17,62 11,40 3,50 

Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính 

Amino acid 

Lysine 

Methionine 

Threonine 

Khoảng 

nồng độ 

(ppm) 

Phương trình S = a.C c + b 

(hay y = ax + b) 

Hệ số tương quan 

tuyến tính R 2 

3 – 150 y = 0,029x + 0,0202 0,9998 

3 – 150 y = 0,0275x + 0,0270 0,9991 

3 – 150 y = 0,1125x + 0,2695 0,9995 

* Nhận xét: Đường chuẩn có độ tuyến tính cao với hệ số tương quan 

tuyến tính đạt yêu cầu R 2 > 0,995. 


Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine 





42 











Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine 


Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine 





43 











4.3 Giới hạn phát hiện 

Giới hạn phát hiện của phương pháp: 

Xác nhận giá trị LOD từ kết quả phân tích trên chương trình máy tính tại 

nồng độ thấp nhất có tỉ lệ S/N = 3 

Ký hiệu 

mẫu 

TACNA1 

TACNA2 

TACNA3 

Lysine: LOD = 1,131 ppm 

Methionine: LOD = 1,343 ppm 

Threonine: LOD = 1,593 ppm 

4.4 Giới hạn định lƣợng 

Giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 3 . 

Lysine: LOQ = 3,393 ppm 

Methionine: LOQ = 4,029 ppm 

Threonine: LOQ = 4,779 ppm 

4.5 Kết quả khảo sát độ chính xác của phƣơng pháp 

4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phƣơng pháp 

Bảng 4.3 %RSD của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi 

Kết quả đo Kết quả 

Khối lượng 

trên máy thực 

cân (g) 

(ppm) (% m) 

0,3033 6,9856 0,4605 

0,2263 5,2566 0,4644 

0,3082 6,4774 0,4203 

0,3052 6,4997 0,3997 

0,3041 5,7217 0,3763 

0,3022 5,8450 0,3869 

Giá trị trung 

bình 

0,4625 

0,4100 

0,3816 

RSD 

(%) 

‣ RSD = 2,5% < 2,7% phương pháp có độ chụm về hàm lượng 

methionine (theo AOAC so sánh Bảng 3.1) 


2,5 





44 











Ký hiệu 

mẫu 

TACNA1 

TACNA2 

TACNA3 

Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi 


cân (g) 

Kết quả đo 

trên máy 

(ppm) 

Kết quả 

thực 

(% m) 

0,3033 18,8637 1,2437 

0,2263 14,6336 1,2931 

0,3082 15,8759 1,0302 

0,3052 16,0447 0,9868 

0,3041 13,6271 0,9247 

0,3022 13,8890 0,9193 


bình 

1,2684 

1,0085 

0,9220 

RSD 

(%) 

‣ RSD = 2,6% < 2,7% phương pháp có độ chụm về hàm lượng lysine 

(theo AOAC so sánh Bảng 3-1). 

Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi 

Ký hiệu 

mẫu 

TACNA1 

TACNA2 

TACNA3 




cân (g) 

(ppm) (% m) 

0,3033 8,6216 0,5685 

0,2263 6,3654 0,5625 

0,3082 8,5019 0,5517 

0,3052 8,5517 0,5259 

0,3041 4,6871 0,3083 

0,3022 4,6972 0,3109 

Giá trị 

trung bình 

0,5655 

0,5388 

0,3096 

2,6 

RSD (%) 

1,99 

‣ RSD = 1,99 % < 2,7 % phương pháp có độ chụm về hàm lượng 

threonine (theo AOAC so sánh Bảng 3.1) 

Ký hiệu 

mẫu 

NL-Lys 

4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp 

Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu 




cân (g) 

(ppm) (% m) 

0,00319 50,763 79,566 

0,00319 50,215 78,584 


bình 

(% m tb ) 

RSD 

(%) 


79,075 1,11% 





45 











‣ RSD (%) của mỗi mẫu nguyên liệu lysine < 1,3 %. Độ lệch chuẩn hàm 

lượng lysine đạt (theo tiêu chuẩn của AOAC so sánh Bảng 3.1). Xác 

nhận giá trị hàm lượng lysine bằng 79,075 % là giá trị quy chiếu được 

chấp nhận là đúng. 

Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu 

nguyên liệu 

Giá trị 

Khối Kết quả đo Kết quả 

Độ 

Ký hiệu 

trung RSD 

lượng cân trên máy thực 

chệch 

mẫu 

bình (%) 

(g) (ppm) (% m) 

(%) 

(%m tb ) 

0,01135 52,4642 77,496 

NL-Lys 

77,945 1,03 -1,43 

0,01138 54,0887 78,394 

Nhận xét: Phương pháp phân tích có độ chệch âm và nhỏ hơn 15 % (theo 

quy định của USFDA). 

‣ Phương pháp phân tích có độ đúng đạt yêu cầu 

4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử 

Kết quả được tổng hợp từ nhiều lần đo và phân tích trong nhiều ngày. 

Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong 

thức ăn chăn nuôi 

Khối 

Kết quả đo trên 

Ký 

Kết quả thực 

lượng 

máy 

hiệu 

(% m) 

cân 

(ppm) 

mẫu 

(g) Lys Met Thr Lys Met Thr 

AA01 0,3429 25,5945 7,2886 19,5446 1,4929 0,4252 1,1400 

AA02 0,3139 28,6263 8,1169 22,6371 1,8240 0,5172 1,4424 

AA03 0,3066 24,6200 6,0543 18,5328 1,6061 0,395 1,2090 

AA04 0,3616 9,5872 4,9927 7,0178 0,5303 0,2761 0,3882 

AA05 0,3020 10,9189 4,4622 6,9597 0,7232 0,2956 0,4610 

AA06 0,3157 13,7869 4,6733 9,3138 0,8735 0,2961 0,5901 

AA07 0,3593 14,8867 4,9382 7,5338 0,8287 0,2748 0,4194 


AA08 0,3116 11,2955 4,9368 5,8312 0,7250 0,2527 0,3743 

AA09 0,3073 15,8565 4,9265 8,0434 1,0320 0,3206 0,5235 





46 











AA10 0,3089 17,4949 7,6280 8,3901 1,1328 0,4939 0,5433 

AA11 0,3118 14,8801 6,8050 11,9855 0,9545 0,4365 0,7688 

AA12 0,3546 22,081 9,4425 9,7833 1,2455 0,5326 0,5518 

AA13 0,3077 29,2035 6,1282 9,3142 1,8982 0,3984 0,6055 

AA14 0,3009 10,0644 4,9156 4,7783 0,6690 0,2603 0,3177 

AA15 0,3188 20,3316 5,1451 10,5021 1,2756 0,3228 0,6589 

Ký hiệu 

mẫu 

NL- 

Lys01 

 

Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lượng mẫu nguyên liệu lysine 

Kết quả 

Khối 

Kết quả 

đo trên 

lượng 

thực 

máy 

cân 

(% m) 

(ppm) 

0,0115 44,3785 77,18 

0,0121 47,2082 78,03 

Giá trị 

trung 

bình 

(%m tb ) 

RSD 

(%) 

Độ 

chệch 

(bias) 

77,065 0,98 -2,54 

Kết quả phân tích trên mẫu nguyên liệu lysine có RSD (%) < 1,3 % (theo 

AOAC so sánh Bảng 3.1) và có độ chệch (bias) âm sai lệch -2,54 % nhỏ 

hơn 15 % (theo quy định của USFDA) 

Kết quả nhận được đối với các mẫu thử thức ăn chăn nuôi là đáng tin 

cậy. 






47 











4.1 Kết luận 

CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 

Đề tài “Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine trong thức 

ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” đạt 

một số kết quả sau: 

- Khảo sát quy trình định lượng lysine, methionine và threonine trong thức 

ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), với 

các thông số thẩm định : 

Độ tuyến tính khá cao với hệ số tương quan tuyến tính R 2 > 0,995 

+ Phương trình tương quan tuyến tính của lysine: 

y = 0,029x + 0,0202 R 2 = 0,9998 

+ Phương trình tương quan tuyến tính của methionine: 

y = 0,0275x + 0,0270 R 2 = 0,9991 

+ Phương trình tương quan tuyến tính của threonine: 

y = 0,1125x + 0,2695 R 2 = 0,9995 

Độ chụm đạt yêu cầu (theo tiêu chuẩn của AOAC) 

+ RSD = 2,6 % đối với lysine 

+ RSD = 2,5 % đối với methionine 

+ RSD = 1,99 % đối với threonine 

Độ đúng đạt yêu cầu (theo tiêu chuẩn của USFDA) 

+ Độ chệch (bias) = -1,43 % đối với mẫu nguyên liệu lysine 

Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện thấp: 

+ Lysine: LOD = 1,131 ppm LOQ = 3,393 ppm 

+ Methionine: LOD = 1,343 ppm LOQ = 4,029 ppm 

+ Threonine: LOD = 1,593 ppm LOQ = 4,779 ppm 

- Phân tích trên 15 mẫu thức ăn chăn nuôi và 1 mẫu nguyên liệu cho kết 

quả tốt, với độ lệch chuẩn của mẫu nguyên liệu đạt RSD = 0,98 % (theo tiểu 

chuẩn của AOAC), độ chệch (bias) âm với sai lệch -2,54 % nhỏ hơn 15 % 

cho phép theo tiêu chuẩn của USFDA. 

- Kết quả cho thấy các mẫu thức ăn chăn nuôi có hàm lượng lysine khá 

cao, cụ thể hàm lượng lysine dao động từ 0,53 – 1,89 %, có 8 mẫu thức ăn 

chăn nuôi phối trộn hàm lượng lysine lớn hơn 1%. Trong khi đó, hàm lượng 

của methionine và threonine được phối trộn ở mức thấp hơn, cụ thể hàm lượng 

methionine dao động từ 0,25 – 0,52 % và hàm lượng threonine dao động từ 

0,32 – 1,44 %, 3 trong số 15 mẫu có hàm lượng threonine lớn hơn 1 % và hàm 

lượng methionine chỉ được phối trộn ở mức dưới 0,6 %. 


- Từ kết quả phân tích có được ta có thể xác nhận giá trị hàm lượng của 

lysine, methionine, threonine phù hợp với nhu cầu amino acid trong khẩu phần 





48 











ăn của gia súc và gia cầm (theo tiêu chuẩn của NRC – 1994, NRC – 1998, 

TCVN 2265: 1994). 

- Với kết quả trên cho thấy phương pháp xác định hàm lượng của lysine, 

methionine, threonine có thể áp dụng để phân tích hầu hết các loại amino acid 

bậc 1, giúp đánh giá một cách chính xác giá trị dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi 

nói riêng và các sản phẩm dinh dưỡng khác nói chung thông qua việc phân 

tích trên máy HPLC. 

4.2 Kiến nghị 

Từ các kết quả phân tích trong quá trình thực hiện đề tài em có một số 

kiến nghị như sau: 

- Các công ty đơn vị sản xuất và phân phối thức ăn chăn nuôi trên thị 

trường nên ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng amino acid trong quá 

trình kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm nhằm nâng cao chất lượng cũng 

như tiết kiệm được chi phí và nguyên liệu phối trộn để mang lại hiệu quả kinh 

tế hơn nữa. 

- Vì thời gian thực hiện đề tài khá ngắn, nên phương pháp vẫn chưa khảo 

sát được các điều kiện của quy trình xử lý mẫu như: nhiệt độ, nồng độ dung 

dịch thủy phân, nồng độ tác chất, thời gian ủ mẫu,..và thực hiện trên các loại 

nền mẫu khác nhau, để giúp đề tài phong phú và đa dạng hơn. Đồng thời, đánh 

giá lại các thông số thẩm định một cách bài bản hơn để xác định giá trị của 

phương pháp phân tích. 

- Có thể ứng dụng cơ sở của phương pháp để phân tích thêm các loại 

amino acid và các loại hợp chất khác như: glycine, serine, cystein, amine, acid 

nucleic,... để mở rộng phạm vi ứng dụng của phương pháp. 

- Tiến hành tạo dẫn xuất các amino acid với tác chất khác và so sánh hiệu 

suất thu hồi giữa hai phương pháp. 

- Tiến hành xử lý mẫu bằng phương pháp khác như: thủy phân mẫu bằng 

kiềm, enzyme... 

- Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên máy hoặc phát hiện chất phân tích 

với các loại đầu dò khác như: UV-VIS, FLD... hoặc tiến hành phân tích với 

một phương pháp khác như: GC-MS, GC-FID, LC-MS... và so sánh khả năng 

phân tích amino acid giữa các phương pháp. 






49 











TÀI LIỆU THAM KHẢO 

[1] Trần Tố (Chủ biên), 2008. Sinh hóa học động vật. Giáo trình. Nhà xuất 

bản Nông nghiệp. Hà Nội. Trang 20-27. 

[2] Cao Đăng Nguyên (Chủ biên), 2006. Công nghệ protein. Giáo trình. Nhà 

xuất bản Đại học Huế. Huế. Trang 13-25. 

[3] Nguyễn Tiến Toàn, 2012. Nghiên cứu ảnh hưởng của lysine và 

probiotics trong thức ăn hỗn hợp đến khả năng sinh trưởng và chất lượng 

thịt gà ta nuôi thương phẩm. Luận văn thạc sĩ kỹ thuật. Đại học Nha 

Trang. Nha Trang. 

[4] Ngô Anh Thư và Nguyễn Anh Thư, 2008. Acid amin không thay thế. 

Tiểu luận. Trường Đại học Bách Khoa. Thành phố Hồ Chí Minh. 

[5] Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008. Các phương pháp phân tích hiện đại. Giáo 

trình. Nhà xuất bản trường Đại học Cần Thơ. Cần Thơ. 

[6] Đoàn Bảo Quốc, 2005. Nuôi trồng và xác định thành phẩn amino acid 

của một số loài nấm bào ngư (Pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng 

cao áp (high performance liquid chromatography - HPLC). Luận văn tốt 

nghiệp. Đại học Nông Lâm. Thành phố Hồ Chí Minh. 

[7] Lê Thị Hồng Thảo, 2005. Nghiên cứu úng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu 

năng cao (HPLC) tối ưu hóa một số điều kiện phân tích acid amin trong 

cá. Đề tài nghiên cứu cấp viện. Viện dinh dưỡng. Hà Nội. 

[8] Nguyễn Huy Du, Nguyễn Văn Đông, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn 

Thị Thùy Luyên và Nguyễn Ánh Mai, 2012. Cải tiến quy trình xác đinh 

thành phần axit amin. Tạp chí phát triên KH&CN. Tập 14. 

[9] Silvia Marten and Mareike Margraf, 2012. Determination of Amino 

acids by UHPLC with automated OPADerivatization by the 

Autosampler. 

[10] Trần Cao Sơn (Chủ biên), 2010. Thẩm định phương pháp trong phân tích 

hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. 

Trang 16-57. 

[11] TCVN 8764 : 2010 ISO 13903 : 2005. Thức ăn chăn nuôi – xác định 

hàm lượng acid amin. 

[12] AOAC Official Method 999.13, 2002. 






50 











PHỤ LỤC 






51 








ĐỒ THỊ ĐƢỜNG CHUẨN VÀ PHƢƠNG TRÌNH ĐƢỜNG 

CHUẨN 









52 








SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC ĐIỂM CHUẨN 









53 
















54 
















55 
















56 
















57 
















58 








SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ CHỤM CỦA PHƢƠNG PHÁP 









59 
















60 








SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG MẪU NGUYÊN LIỆU 

LYSINE 









61 








SẮC KÝ ĐỒ CỦA MẪU THỨC ĂN CHĂN NUÔI 









62 
















63

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?