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Méthodologie immunohistochimique pour l’utilisation des anticorps Novocastra TM sur des tissus musculaires congelés. Réactifs nécessaires mais non fournis 1. Solvants standard utilisés en immunohistochimie. 2. Tampon Tris (TBS) 50 mM, pH 7,6. 3. Diluant anticorps – sérum normal dilué de façon optimale dans du TBS. 4. Sérums normaux provenant de diverses espèces chez lesquelles l’anticorps secondaire est cultivé. 5. Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase - utiliser selon les recommandations du fabricant. 6. Tétrachlorhydrate de 3,3’-diaminobenzidine (DAB) - utiliser selon les recommandations du fabricant. 7. Milieu de montage - utiliser selon les recommandations du fabricant. Équipements nécessaires mais non fournis 1. Incubateur réglé à 25 °C. 2. Équipements généraux de laboratoire d’immunohistochimie. 3. Ventilateur électrique pour sécher les lames à l’air. Solutions de restauration des antigènes (voir Recommandations d’utilisation) Non applicables sur des coupes congelées. Méthodologie Avant d’utiliser cette méthodologie, les utilisateurs doivent avoir été formés aux techniques immunohistochimiques. Les utilisateurs doivent déterminer les dilutions optimales des anticorps. Sauf mention contraire, toutes les étapes sont réalisées à 25 °C. 1. Découper et monter des coupes de 4 à 10 µm sur des lames revêtues d’un adhésif adapté au tissu et laisser sécher à l’air pendant une heure. 2. Incuber les coupes avec l’anticorps primaire dilué de façon optimale (voir Recommandations d’utilisation). 3. Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois pendant 5 minutes sous agitation légère. 4. Incuber les coupes dans l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase approprié. 5. Laver dans du tampon TBS pendant 2 fois pendant 5 minutes sous agitation légère. 6. Incuber les lames dans le DAB. 7. Rincer les lames à l’eau propre. 8. Déshydrater, assécher et monter les coupes. Amendements apportés à la version précédente Non applicable. Date de publication 5 février 2004 (CEprotocol/Frozen Muscle). NCL-b-DG Page 9
Novocastra TM Anticorpo Monoclonale Murino Liofilizzato Beta-Dystroglycan Codice Del Prodotto: NCL-b-DG Uso Previsto Per uso diagnostico in vitro. NCL-b-DG è destinato all’identificazione qualitativa in microscopia ottica della molecole Beta-Dystroglycan, in sezioni congelate. L’interpretazione clinica di ogni colorazione o della sua assenza va integrata da studi morfologici che utilizzino i controlli appropriati e deve essere valutata da un patologo qualificato, nel contesto della storia clinica del paziente e delle altre metodiche diagnostiche adoperate. Principio Della Procedura Le tecniche di colorazione immunoistochimica (IHC) consentono la visualizzazione degli antigeni mediante l’applicazione sequenziale di un anticorpo specifico per l’antigene (anticorpo primario), di un anticorpo secondario che lega l’anticorpo primario e di un complesso enzimatico con un substrato cromogeno; l’applicazione dei tre reagenti è intervallata da fasi di lavaggio. L’attivazione enzimatica del cromogeno produce una reazione visibile in corrispondenza del sito antigenico. Il campione biologico può, quindi, essere controcolorato e montato. I risultati vengono interpretati mediante un microscopio ottico e sono utili nella diagnosi differenziale di processi fisiopatologici, che possono essere più o meno associati ad un particolare antigene. Clone 43DAG1/8D5 Immunogeno Peptide sintetico contenente 15 degli ultimi 16 aminoacidi dell’estremità carbossilica della sequenza del beta-distroglicano umano (PKNMTPYRSPPPYVP-PCOOH). Specificità Beta-distroglicano umano (43 kD). Inoltre, il clone crossreagisce con il beta-distroglicano nelle sezioni muscolari di topo, ratto, coniglio, cane, pollo, criceto, maiale e rospo. Non sono state valutate altre specie animali. Composizione Del Reagente NCL-b-DG è un supernatante liofilizzato di coltura tissutale, contenente 15 mM di sodio azide come conservante. L’utente deve ricostituire il contenuto del flacone con il volume appropriato di acqua distillata sterile, come indicato sull’etichetta del flacone stesso. Classe Ig IgG2a Total Protein Concentrazione Proteica Totale 1,0–8,0 g/l. Consultare l’etichetta del flacone per la concentrazione proteica totale specifica del lotto. Concentrazione Anticorpale Superiore o uguale a 18,9 mg/l. Consultare l’etichetta del flacone per la concentrazione di Ig specifica del lotto. Raccomandazioni Per L’uso Immunoistochimica (vedere D. Metodologia) sulle sezioni congelate. Diluizione raccomandata: 1:50–1:200 per 60 minuti a 25 o C. Queste raccomandazioni costituiscono delle semplici linee guida; spetta al singolo utente stabilire la diluizione di lavoro ottimale. Conservazione E Stabilità Conservare l’anticorpo, nella confezione ancora integra, a 2–8 o C. In queste condizioni, il prodotto non subisce perdite significative di prestazione fino alla data di scadenza, indicata sull’etichetta del flacone. Non usare dopo la data di scadenza, indicata sull’etichetta del flacone. L’anticorpo ricostituito rimane stabile per almeno due mesi, se conservato a 2–8 o C. Per la conservazione a lungo termine, si raccomanda di congelare aliquote dell’anticorpo a -20 o C (non si raccomanda l’uso di congelatori frost-free, cioè senza brina). Evitare di congelare e scongelare ripetutamente. Preparare le diluizioni di lavoro il giorno stesso dell’utilizzazione. Immediatamente dopo l’uso, raffreddare di nuovo a 2–8 o C. Condizioni di conservazione diverse da quelle sopra specificate vanno verificate dall’utente. Preparazione Del Campione Biologico Congelare i blocchetti di tessuto campione in isopentano raffreddato dall’azoto liquido (vedere “Avvertenze e precauzioni”). I campioni biologici non richiedono l’ulteriore fissazione, ma vanno inclusi in OCT compound (Sakura, codice del prodotto Tissue-Tek 4583). Avvertenze E Precauzioni Questo reagente è stato preparato dal supernatante di coltura cellulare. Trattandosi di un prodotto biologico, va maneggiato con cautela. La molarità della sodio azide nel reagente corrisponde a 15 mM. Su richiesta, è disponibile una scheda dei dati di sicurezza del materiale (MSDS) per la sodio azide. Fare riferimento alla normativa federale, statale o locale per lo smaltimento dei componenti potenzialmente tossici. Prima e dopo la fissazione, i campioni biologici e tutti i materiali ad essi esposti vanno trattati come potenzialmente infettanti e smaltiti con le appropriate precauzioni. 1 Non pipettare i reagenti con la bocca ed evitare il contatto dei reagenti e dei campioni biologici con la pelle e con le mucose. Se i reagenti o i campioni biologici vengono a contatto con zone sensibili, sciacquare abbondantemente le parti interessate. Consultare il medico. NCL-b-DG Page 10
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