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Metodologia de imunocitoquímica para utilização de anticorpos
Novocastra TM em tecido de músculo congelado.
Reagentes necessários mas não fornecidos
1. Solventes comuns utilizados em imunohistoquímica.
2. 50 mM solução salina tampão Tris (TBS) pH 7,6.
3. Diluente do anticorpo – soro normal diluído em TBS.
4. Soros normais da espécie em que o anticorpo secundário tenha sido desenvolvido.
5. Anticorpo secundário conjugado com peroxidase – preparar conforme recomendado pelo fabricante.
6. 3,3’ Tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB) – preparar e utilizar conforme recomendado pelo fabricante.
7. Meio de montagem – usar conforme recomendado pelo fabricante.
Equipamento necessário mas não fornecido
1. Incubador regulado para 25 ºC.
2. Equipamento geral de laboratório de imunohistoquímica.
3. Ventilador eléctrico para secagem das lâminas ao ar.
Soluções de recuperação de antígeno (ver as Recomendações sobre a utilização)
Não se aplica às secções congeladas.
Metodologia
Antes de intentar esta metodologia, o utilizador deve ter recebido a devida formação em técnicas de imunohistoquímica.
O utilizador deve determinar quais as fórmulas de diluição ideais para os anticorpos. A não ser indicação em contrário, todas as etapas
devem ser efectuadas a 25 ºC.
1. Cortar e montar secções de 4–10 μm em lâminas revestidas de um tecido adesivo apropriado e secar ao ar durante pelo menos
uma hora.
2. Incubar as secções com anticorpo primário optimamente diluído (ver Recomendações sobre a utilização).
3. Lavar em tampão TBX durante 2 x 5 minutos, agitando levemente.
4. Incubar as secções num anticorpo secundário apropriado, conjugado com peroxidase.
5. Lavar em tampão TBX durante 2 x 5 minutos, agitando levemente.
6. Incubar as lâminas em DAB.
7. Enxaguar as lâminas em água limpa.
8. Desidratar, soltar e montar as secções.
E. Emendas da edição anterior
Não é aplicável.
F. Data de emissão
5 de Fevereiro de 2004 (CEprotocol/Frozen Muscle).
NCL-b-DG
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