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Metodologia immunoistochimica per l’uso di anticorpi Novocastra TM su
tessuto muscolare congelato.
Reagenti necessari ma non forniti
1. Solventi standard utilizzati in immunoistochimica.
2. Tampone Tris salino (TBS) 50 mM a pH 7,6.
3. Diluente anticorpale - siero normale diluito in maniera ottimale in TBS.
4. Sieri normali delle specie da cui si è ottenuto l’anticorpo secondario.
5. Anticorpo secondario coniugato con perossidasi - usare secondo le raccomandazioni del produttore.
6. 3,3’ diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) - preparare ed usare secondo le raccomandazioni del produttore.
7. Mezzo di montaggio - usare secondo le raccomandazioni del produttore.
Attrezzature necessarie ma non fornite
1. Set incubatore a 25 °C.
2. Attrezzature di base del laboratorio di immunoistochimica.
3. Ventilatore elettrico per asciugare i vetrini.
Soluzioni per smascheramento antigenico (vedere Raccomandazioni per l’uso)
Non si applica alle sezioni congelate.
Metodologia
Prima di intraprendere questa metodologia, l’utente deve acquisire esperienza con le tecniche immunoistochimiche. Gli utenti devono
determinare le diluizioni ottimali degli anticorpi. Se non indicato diversamente, tutte le fasi vanno condotte alla temperatura di 25 °C.
1. Tagliare e montare sezioni dallo spessore di 4–10 μm su vetrini ricoperti con un adatto adesivo tissutale e lasciar asciugare all’aria
per circa un’ora.
2. Incubare le sezioni con anticorpo primario diluito in maniera ottimale (vedere Raccomandazioni per l’uso).
3. Lavare 2 volte in tampone TBS per 5 minuti, scotendo delicatamente.
4. Incubare le sezioni con un appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi.
5. Lavare 2 volte in tampone TBS per 5 minuti, scotendo delicatamente.
6. Incubare i vetrini in DAB.
7. Sciacquare i vetrini in acqua pulita.
8. Disidratare, pulire e montare le sezioni.
Modifiche alla pubblicazione precedente
Non applicabile.
F. Data di pubblicazione
5 Febbraio 2004 (CEprotocol/Frozen Muscle).
NCL-b-DG
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