Infomusa 11-1 (ESP) - EcoNegocios Agrícolas

Recursos genéticas Clasificación de germoplasma de Vietnam
Utilización de la técnica RAPD para la identificación
y clasificación de algunos cultivares de banano
en Vietnam
Nguyen Xuan Thu, Le Thi Lan Oanh
y Ho Huu Nhi
El banano es una planta frutícola importante
en los países tropicales. El
banano se origina de Musa acuminata
(AA) y Musa balbisiana (BB). Se reconocen
diez grupos de cultivares con niveles de ploidia
que varían de diploides (2n = 2x = 22) a
tetraploides (2n = 4x = 44), así como diferentes
genomas. Se conoce la existencia de
las siguientes configuraciones genómicas:
diploides AA, BB y AB; triploides AAA, AAB,
ABB; y tetraploides AAAA, AAAB, AABB,
ABBB (Simmonds y Weatherup 1990). Por lo
tanto, existe una amplia variedad de sistemas
de clasificación e identificación para el
banano. Hasta la fecha, la clasificación e
identificación tradicionales se basaban solo
sobre la morfología y características cuantitativas.
Recientemente, se empezaron a utilizar
marcadores moleculares para estudiar
la diversidad de las plantas, animales y
microorganismos.
La técnica de ADN polimórfico amplificado
aleatoriamente (random amplified
polymorphic DNA, RAPD), que utiliza
amplificación de reacción en cadena de polimerasa
(PCR) con iniciadores individuales
de la secuencia nucleotídica arbitraria, fue
desarrollada por Williams et al. (1990) y
Welsh y McClelland (1990) para producir
marcadores moleculares para el análisis
genético. Se mostró que el RAPD es útil en la
impresión de huellas genéticas (Yang y
Quiros 1993, Orozco-Catstillo et al. 1994,
Lanham et al. 1995). En este estudio, hemos
utilizado RAPD para identificar y clasificar
algunos cultivares de banano.
Materiales y métodos
Materiales
En este estudio, seis cultivares de banano
indígenas de Vietnam (Tabla 1) fueron
cribados con respecto a los marcadores
de RAPD obtenidos en el Institute of
Agricultural Genetics (Vietnam).
Aislamiento de ADN
El ADN fue aislado de las hojas de banano
utilizando el método de Murray y Thompson
(1980) con algunas modificaciones. Cuatro
gramos de material foliar fresco fueron moli-
dos en nitrógeno líquido en presencia de
arena de cuarzo. El tejido foliar en forma de
polvo fue almacenado a -20 ° C durante dos
horas. Se añadieron diez mililitros de la solución
búfer de extracción [1,5% de bromuro
de cetiltrimetilamonio (CTAB);100 mM de
Tris-HCl (pH 8); 20mM de ácido etilenediaminetetraacético
(EDTA) (pH 8); 1.4 mM
NaCl; 0.2% de mercaptoetanol] calentada a
65 ° C y luego la mezcla fue incubada a 65 ° C
durante 30 min. La mezcla fue sacudida ligeramente
con 1.5 de volumen de cloroformo:
isoamilo (24:1) por 20 min. a temperatura
ambiente. El sedimento se removió
mediante la centrifugación a 3000 rpm por
20 min. El ADN fue precipitado añadiendo
0.8 de volumen de propanol congelado (o 1.5
de volumen de 96% etanol). El gránulo fue
lavado 2-3 veces en etanol al 70%. Al final, el
ADN se disolvió nuevamente en un volumen
mínimo de TE (de unos 200 ml).
Amplificación de ADN
Para amplificar el ADN se utilizaron doce iniciadores
de Operon Technologies, cada uno
diez bases de largo (Tabla 2). La PCR se realizó
en reacciones de 25 ml que contenían
20 ng de matriz (ADN genómico), 200 mM de
cada dNTP, 2.5 unidades de Taq-polimerasa,
15 ng de iniciadores, 10 mM de Tris-HCl
(pH 8.3), 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl 2 ,
0.001% (w/v) de gelatina y 20 ml de aceite
mineral como recubrimiento. Se realizaron
cuarenta y cinco ciclos de amplificación,
cada uno consistiendo de 94°C por 30 s, 36°C
por 1 min., 72°C por 2 min. Los productos
fueron analizados mediante la electroforesis
en geles de agarosa a 1.1% a 100 V por
3 horas, teñidos con bromuro de etidio a
0.01% y fotografiados bajo la luz ultravioleta.
Análisis de datos
• Los coeficientes de similitud entre los cultivares
se calcularon utilizando la fórmula
de Nei y Li (1979):
S ij =
2 N ij
(N i + N j )
Tabla 1. Cultivares y genotipos empleados en el estudio.
donde: N ij = número de bandas en común
entre los cultivares i y j, y
N i y N j = número de bandas para los cultivares
i y j, respectivamente.
• El dendograma de los cultivares estudiados
se produjo utilizando un programa de
computadora NTsyspc 2.0.
Resultados y discusión
RAPD-PCR
Se utilizaron doce iniciadores para amplificar
el ADN genómico del banano. Nueve de
ellos fueron amplificados para obtener productos
múltiples de amplificación de la PCR
(Figura 1: ejemplo con el iniciador H08),
mientras que otros tres iniciadores (G6, Y14,
Y15) no se utilizaron.
Se obtuvieron dos tipos de bandas: bandas
monomórficas que se encontraban presentes
en todos los cultivares y bandas polimórficas
que se encontraban presentes o ausentes
de manera asíncrona en todos los
cultivares. Nueve iniciadores fueron amplificados
en 79 bandas, de las cuales 67 bandas
(84.81%) resultaron polimórficas y 12 bandas
(15.19%) monomórficas. La alta proporción
de bandas polimórficas se debió al origen
muy diferente de los cultivares
estudiados. Dos iniciadores (D07, G14)
amplificaron solo 5 bandas, mientras que el
H07 amplificó 17 bandas. El tamaño de las
bandas varió de 360 Kb a 3200 Kb.
Similitud genética
La fórmula de Nei y Li permitió calcular
coeficientes de similitud entre los cultivares
basándose en los datos de RAPD. Los
coeficientes de similitud reflejaron las relaciones
entre los cultivares. Los coeficientes
de similitud entre los cultivares originales
de M. acuminata variaron entre 0.764-0.826,
mientras que los cultivares originales de
M. balbisiana variaron entre 0.696-0.835
(Tabla 3). Los cultivares pertenecientes a
los dos grupos tuvieron coeficientes de
similitud bajos, que variaron entre 0.317
y 0.461.
Cultivar Genotipo Cultivar Genotipo
1 Chuoi Tieu Xanh AAA (2n = 3x = 33) 4 Chuoi Tay ABB (2n = 3x = 33)
2 Chuoi Tieu Hong AAA (2n = 3x = 33) 5 Chuoi La ABB (2n = 3x = 33)
3 Chuoi Ngu AA (2n = 2x = 22) 6 Chuoi Hot BB (2n = 2x = 22)
48 INFOMUSA — Vol 11, N° 1